近红外二区荧光导航手术在足踝外科中的应用初探

樊潇霄 ,  杨杰 ,  倪沪桅 ,  夏启铭 ,  刘孝龙 ,  吴天翔 ,  李霖 ,  Paras N. Prasad ,  刘超 ,  林辉 ,  钱骏

工程（英文） ›› 2024, Vol. 40 ›› Issue (9) : 20 -29.

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工程（英文） ›› 2024, Vol. 40 ›› Issue (9) : 20 -29. DOI: 10.1016/j.eng.2024.04.011
研究论文

近红外二区荧光导航手术在足踝外科中的应用初探

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Initial Experience of NIR-II Fluorescence Imaging-Guided Surgery in Foot and Ankle Surgery

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摘要

近红外二区（NIR-II; 900~1880 nm）窗口的光学成像，是目前生物医学成像领域的热门研究课题。本研究旨在探索 NIR-II荧光成像在足踝外科手术中的应用价值。我们开发了一套实验室自建的NIR-II荧光手术导航系统，并将其用于足踝外科手术导航。相比于近红外一区（NIR-I）荧光图像，该系统获得的NIR-II荧光图像，拥有更高空间频率的信息以及更高的信号背景比（SBR）。本文的研究结果表明，NIR-II成像可为外科医生提供对比度更高、探测深度更大的图像。本研究纳入了三种临床应用场景（糖尿病足、跟骨骨折以及下肢创伤）。利用NIR-II荧光成像技术，我们在糖尿病足出现形态学改变前就观察到了缺血区域，精准定位了手术切口中缺血区域的边界，并全面评估了皮瓣的血供情况。NIR-II荧光成像能够帮助外科医生精确判断手术切缘，提早发现缺血性病变，并动态追踪灌注过程。我们认为，便携且可靠的NIR-II荧光成像设备以及更多功能性荧光探针，可在精准手术中发挥关键作用。

Abstract

Optical imaging in the second near-infrared (NIR-II; 900-1880 nm) window is currently a popular research topic in the field of biomedical imaging. This study aimed to explore the application value of NIR-II fluorescence imaging in foot and ankle surgeries. A lab-established NIR-II fluorescence surgical navigation system was developed and used to navigate foot and ankle surgeries which enabled obtaining more high-spatial-frequency information and a higher signal-to-background ratio (SBR) in NIR-II fluorescence images compared to NIR-I fluorescence images; our result demonstrates that NIR-II imaging could provide higher-contrast and larger-depth images to surgeons. Three types of clinical application scenarios (diabetic foot, calcaneal fracture, and lower extremity trauma) were included in this study. Using the NIR-II fluorescence imaging technique, we observed the ischemic region in the diabetic foot before morphological alterations, accurately determined the boundary of the ischemic region in the surgical incision, and fully assessed the blood supply condition of the flap. NIR-II fluorescence imaging can help surgeons precisely judge surgical margins, detect ischemic lesions early, and dynamically trace the perfusion process. We believe that portable and reliable NIR-II fluorescence imaging equipment and additional functional fluorescent probes can play crucial roles in precision surgery.

关键词

近红外二区荧光成像 / 足踝外科手术 / 吲哚菁绿 / 影像引导手术

Key words

Second near-infrared fluorescence imaging / Foot and ankle surgery / Indocyanine green / Imaging-guided surgery

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樊潇霄,杨杰,倪沪桅,夏启铭,刘孝龙,吴天翔,李霖,Paras N. Prasad,刘超,林辉,钱骏. 近红外二区荧光导航手术在足踝外科中的应用初探[J]. 工程（英文）, 2024, 40(9): 20-29 DOI:10.1016/j.eng.2024.04.011

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1 引言

随着解剖学与手术技术的不断进步，外科领域已经从依赖经验方法过渡到了更为精准的方式[1‒2]。2015年，Dong和Zhang [1]提出了精准手术的概念，强调了最大限度地切除所有病变组织，同时保留正常组织的重要性。荧光成像手术导航与精准手术的原则高度契合。外科医生利用可见光或近红外（NIR）荧光探针来观察病变组织与正常组织，以便进行切除操作。近红外荧光成像手术导航在外科领域已经取得了显著成就，可应用于前哨淋巴结识别、肿瘤可视化、血供评估和神经检测等领域[3‒6]。

然而，传统的NIR荧光成像手术导航采用的生物成像窗口范围是760~900 nm。近红外二区（NIR-II）窗口指的是900~1880 nm的光谱区域，该区域在生物组织中具有适中的光吸收、显著降低的光子散射以及极小的自发荧光[7]。NIR-II荧光生物成像极大地提升了图像对比度，尤其是在辨认体内深层组织的结构时。自2009年Welsher等[8]首次提出这一概念以来，有关NIR-II生物成像的研究就备受关注[8‒10]。为此，人们研发出了多种类型的荧光探针，如单壁碳纳米管、量子点、稀土离子掺杂纳米颗粒以及有机材料等[7,11‒12]。不同类型的NIR-II成像系统，包括NIR-II宏观成像系统、NIR-II宽场显微镜以及NIR-II共聚焦显微镜也已被建立起来[13]。随着荧光探针和成像系统的发展，NIR-II荧光成像显著加速了基础生物学与医学研究的进展。它已被用于解析脑血管结构/功能[14‒15]、淋巴结中巨噬细胞/T细胞的分布情况[16]，以及肿瘤的分子成像[17]。

NIR-II荧光生物成像尽管尚处于起步阶段，但众多临床应用为其带来了全新且充满前景的机遇。Hu等[18]为NIR-II荧光成像的临床转化做出了重大贡献。2020年，他们将这一新技术引入肝脏肿瘤手术导航领域。与NIR-I荧光成像手术导航相比，术中NIR-II荧光成像在肿瘤检测方面具有更高的灵敏度，肿瘤与正常组织的对比度也更高[18]。接下来，他们进一步探索了NIR-II荧光成像在脑胶质瘤精确切除中的应用。在他们的研究中，NIR-IIa（1300~1400 nm）和NIR-IIb（1500~1700 nm）生物成像窗口首次在临床上用于胶质瘤切除过程中的脑血管可视化[19]。在NIR-IIa和NIR-IIb窗口获取的图像，比在传统NIR-II和NIR-I窗口获取的图像效果更佳。迄今为止开展的研究虽还有限，但已揭示出NIR-II荧光成像在临床实践中巨大的应用潜力。

鲜有临床研究证实NIR-II荧光成像在足踝外科手术中的适用性。在本研究中，我们利用实验室自建的手术导航系统，将NIR-II成像技术引入骨科手术。与NIR-I荧光成像相比，我们观察到NIR-II荧光成像（波长超过1100 nm）具有更优的表现。随后，我们将这一创新成像技术应用于糖尿病足、跟骨骨折及带蒂皮瓣手术。利用具有更高SBR和更多成像细节的NIR-II图像，有助于实现更精准的骨科手术。我们的研究证明了NIR-II荧光成像在足踝外科手术中的巨大潜力，因此值得推动其临床转化。

2 实验方法

2.1 实验室自建的NIR-II荧光成像仪与商用NIR-I荧光成像仪

我们在实验室自建了NIR-II荧光成像仪，它由近红外二区荧光成像系统和激光激发系统组成。NIR-II荧光成像系统包括：一台制冷型铟镓砷（InGaAs）相机（SW640；西安天盈光电科技有限公司），用于记录NIR-II图像；一个滤光片（FELH900或FELH1100；美国索雷博公司），用于过滤荧光波长；以及一个近红外镜头（TKL35，F/1.6；天盈光电科技有限公司），用于采集图像。由于我们利用吲哚菁绿（ICG）的发射光谱尾端来实现近红外二区荧光成像，如果选用1300 nm长通滤光片，激发光的功率密度可能会非常高。考虑到成像性能、激发激光功率强度以及成像速度之间的平衡，我们选择1100 nm长通滤光片用于进一步的临床应用。它能高效采集ICG样品发射光谱尾端的荧光信号，并提供高对比度的NIR-II荧光图像。激发系统由一台808 nm激光器（MW-GX-808；长春镭仕光电科技有限公司）作为激发源、一个扩束器用于调节发散度，以及一个光扩散器（EDP10-5；深圳市麓邦技术有限公司），以确保激发的均匀性。本激发系统可以提供合适的激发功率和激发面积（125 cm2），使激光中心与边缘的功率差异不会过大。PDE®近红外荧光成像仪（日本滨松光子学株式会社）是一款商用NIR-I荧光成像仪，用作对比。

2.2 吸收光谱与发射光谱的测量以及动物、血管的NIR-I和NIR-II荧光成像

使用UV-3600扫描分光光度计（日本岛津公司）收集吸收光谱。使用FLS980光致发光（PL）光谱仪（英国爱丁堡仪器公司；信号检测：液氮冷却的InGaAs二极管探测器）获取发射光谱。新西兰大白兔（体重1.5 kg）购自浙江大学医学院附属邵逸夫医院动物中心实验室。通过兔耳缘静脉注射戊巴比妥钠盐溶液（生理盐水配制，浓度为10 mg∙mL-1，剂量为3 mL∙kg-1）对兔子进行麻醉，以最大限度减少其痛苦。剃去兔子腹部的毛发，再用脱毛膏彻底清除。然后将兔子仰卧放置，经耳缘静脉注射2 mL ICG（浓度为5 mg∙mL-1）。使用690 nm激光对兔子腹部进行均匀照射。利用硅基电荷耦合器件（CCD）（GA1280；天盈光电科技有限公司）和InGaAs相机，并借助两个700 nm长通滤光片（FELH0700；索雷博公司）和一个900 nm短通滤光片（FESH0900；索雷博公司）记录NIR-I荧光图像；借助InGaAs相机，通过900 nm长通滤光片或1100 nm长通滤光片（FELH900或FELH1100）记录NIR-II荧光图像。为尽量减少因ICG代谢造成的偏差，NIR-I和NIR-II系统彼此靠近放置（附录A中图S1）。如此，我们几乎能同时获取NIR-I和NIR-II的图像。本研究方案已获浙江大学实验动物伦理委员会批准（批准号：ZJU20210209）。

2.3 患者招募、临床数据收集与影像引导手术

本研究招募了8名患者，其中5名患有糖尿病足、2名患有跟骨骨折、1名患有下肢创伤。原计划对这些患者实施NIR成像手术导航，以评估血供情况，所使用的仪器是PDE®近红外荧光成像仪。在充分了解研究内容后，患者接受了NIR-II荧光成像检查以及传统ICG辅助成像引导手术。本研究得到了邵逸夫医院伦理委员会的批准与监督（批准号：20220279）。过程中收集了患者的基本数据（年龄、体重、体重指数、性别、既往病史、过敏史和吸烟史 ）以及手术相关数据（ICG剂量和手术时间）。

在影像引导手术过程中，从目标组织到NIR-II相机的成像距离约为50 cm。我们利用无影手术灯中的红外组件将焦距调整到合适位置。关闭手术灯，给患者注射ICG。我们还准备了不含NIR组件的手术灯，用于替换手术导航中常用的无影灯。曝光时间设定为10~25 ms，以确保手术视频的流畅性。一般来说，大约3 min后，荧光信号开始出现。NIR-II荧光图像被全程记录。

2.4 荧光图像分析与分子对接

采用二维（2D）傅里叶变换对荧光图像进行光谱分析，并定量比较图像中的细节。对所有荧光图像的选定区域运用快速傅里叶变换（FFT）。使用MATLAB的FFT2函数（MATLAB版本R2021b）来执行这一变换。在选定区域执行FFT。从统计学角度来说，通过绘制以频率为x轴、强度为y轴的曲线，来测量光谱图像中每个像素点相对中心的位置及其强度值。将各光谱图像的强度积分归一化到相同值。根据各图中的线条绘制图像的强度分布图。为计算SBR，将最高值用作信号，将两个信号峰之间的波谷用作背景值。信号与背景的强度比即为参考区域的SBR。使用ImageJ软件（版本1.6.0；美国国立卫生研究院）对荧光强度进行定量分析。使用Origin Pro软件（版本9.0；美国OriginLab公司）生成图表。

变异系数（CV）用于评估图像的SBR或纹理复杂度，其计算公式为CV = SD/mean × 100%。其中，mean表示所有像素强度的平均值，而SD则对应标准差。均方差平方（SMD2）是一种侧重于相邻像素间灰度差异的评估指标，其计算公式为

S M D 2 = ∑ y ∑ x f x , y - f x + 1 , y ×          f x , y - f x , y + 1

式中，f(x,y)是对应像素的灰度值；x, y代表每个像素的二维坐标。

采用配对双尾t检验来评估组间差异。设定统计学显著性水平为P < 0.05。

在分子对接方面，从蛋白质数据库下载白蛋白的三维（3D）结构。利用Chem3D构建分子结构并最小化能量。使用Discovery Studio软件（v19.1.0.18287）模拟分子与蛋白质的结合位点及堆叠构象。

3 结果分析

3.1 人白蛋白显著增强了ICG在NIR-II成像窗口的荧光强度

ICG是一种经临床批准的NIR荧光染料。随着NIR-II成像技术的发展，研究人员逐渐意识到，ICG较强的NIR-II发射光谱尾端能提供具有高SBR的荧光图像[20‒21]。我们团队此前曾报道，ICG在微观和宏观的NIR-II成像中都能取得令人满意的效果[22‒23]。即便在NIR-IIb成像窗口，ICG也展现出了优异的成像性能[24]。ICG是一种典型的聚集诱导猝灭（ACQ）分子，其发射峰位于NIR-I成像窗口。然而，当ICG分子与蛋白质（如白蛋白）结合时，其光学性质会发生显著变化。人血清白蛋白（HSA）在人体生理过程中起着重要作用。HSA占血浆蛋白的60%，承担着血液中近80%的渗透压[25]。由于一系列内源性和外源性配体通常以104~106 mol∙L-1的结合常数可逆的与HSA结合，HSA常充当载体[26]。我们使用Discovery Studio软件模拟了ICG与HSA的分子-蛋白质结合位点及堆叠构象。通过对结合模型进行评分排序操作，呈现出了能量状态绝对值最低（125.025）的模型[图1（a）]。对受体-配体相互作用进行了分析，结果以二维图展示[图1（b）]。ICG分子通过常规氢键与Tyr452相互作用，通过碳氢键与Ala191相互作用。ICG还通过π-阳离子或π-阴离子相互作用力与Asp187、Lys436、Glu292和Glu153相互作用。此外，ICG通过π-烷基相互作用力与Lys432、Phe157、His288和Ala291相互作用。由于ICG与HSA之间的相互作用，ICG芳香族结构的π-π堆积显著减少，分子内旋转受到限制。此前有报道指出，低浓度的ICG在水中有两个发射峰[27]，本文也观察到了类似结果[图1（c）]。ICG在5% HSA溶液以及人血清中的荧光显著增强[图1（c）]。还发现ICG在人血清中的荧光强度高于其在5% HSA溶液中的荧光强度，这意味着ICG与人血清中的其他蛋白质，如高密度脂蛋白和低密度脂蛋白[28]，可能存在相互作用。值得注意的是，ICG在5% HSA溶液和人血清中的荧光光谱相似，与ICG在水中的光谱相比，均出现了约40 nm的明显红移。

为验证ICG在NIR-II荧光成像中的应用潜力，我们获取了兔子腹壁血管在900 nm和1100 nm 长通光谱区域的图像，并同时与ICG的NIR-I荧光成像作对比。所有图像均在相同视场下获得。在每张图像中，在指定区域内选取尺寸和位置均相同的感兴趣区域[图1（d）中红框标记的区域]，利用2D FFT分析该区域的频率分布。经过FFT后，对傅里叶变换后的图像进行频移，使低频信息移至图像中心。以频谱图中心为原点，计算不同半径的光谱强度后，获取不同空间频率下各图像的平均强度[图1（e）]。与在NIR-I窗口和900 nm长通NIR-II窗口获取的图像相比，1100 nm长通NIR-II窗口拍摄的图像拥有更大面积的高空间频率区域[图1（e）]，展现出更多成像细节与更高的分辨率。为进一步比较NIR-I和NIR-II生物成像窗口中的SBR，我们选取了三张荧光图像中的相同血管。在NIR-I、900 nm长通NIR-II以及1100 nm长通NIR-II窗口中的SBR分别为1.21、1.62和3.02。在NIR-II生物成像窗口检测到的SBR高于NIR-I生物成像窗口，且在波长超过1100 nm时性能进一步提升（附录A中图S2）。用三只兔子重复该实验，结果显示，波长超过1100 nm获取的荧光图像平均SBR最高（附录A中图S3）。

3.2 患者特征

本研究招募了8名接受过三种不同手术的患者。这三种不同类型的手术包括糖尿病足伤口清创术、跟骨骨折切开复位内固定术（ORIF）以及皮瓣手术。所有这些手术都需要对缺血范围进行精准判断。附录A中表S1提供了患者的详细信息。我们研究中每次使用的ICG剂量为7.5 mg，因为我们发现，无论患者体重如何，该剂量都足以获取令人满意的NIR-II荧光图像，进而满足这些手术的需求。

3.3 实验室自建的NIR-II荧光成像手术导航系统

PDE®近红外荧光成像仪被用于传统的NIR-I荧光成像手术导航[图2（a）]。这是一套成熟的商用系统，在肝癌成像、前哨淋巴结追踪以及骨科手术等临床实践中广泛应用。我们实验室自建的NIR-II手术导航系统主要包括一台InGaAs相机、808 nm激光器、计算机以及移动台车[图2（b）和（c）]。808 nm激光的最大功率密度为30 mW∙cm-2。

不同类型的足踝手术由商用系统引导，以此确保患者能接受标准化治疗。手术期间，收集NIR-II荧光图像，用于比较商用NIR-I成像手术导航系统与我们实验室自建的NIR-II成像手术导航系统的成像质量。我们选取了两个具有代表性的区域，即胫骨前肌区域和足背区域。NIR-II成像的对比度优于NIR-I成像。为了进一步开展定量分析，从NIR-I和NIR-II图像中截取代表性部分（红色虚线框），并使用FFT分析其频谱图，如图2（d）所示。在足背区域，NIR-II荧光图像中的高频信息占比为0.65，高于NIR-I荧光图像中的占比（0.41）。在胫骨前肌区域也观察到了类似结果，NIR-II图像中的高频信息占比（0.57）高于NIR-I图像中的占比（0.22）。显然，与NIR-I成像相比，NIR-II成像能提供更多细节。为进一步比较图像质量，我们还分析了该患者NIR-I和NIR-II图像的SBR。在足背区域，NIR-II图像的SBR为2.67，高于NIR-I图像的SBR（1.18）。在胫骨前肌区域，NIR-II图像的SBR同样更高（NIR-I与NIR-II对比：1.31 vs 2.12，附录A中图S4）。根据上述发现，NIR-II成像技术在手术导航方面的表现明显优于传统的NIR-I技术。

3.4 NIR-II荧光成像有助于判断糖尿病足的坏死区域

糖尿病足疾病是糖尿病最棘手的并发症之一，也是造成糖尿病致残负担的主要原因[29]。据估计，19%~34%的糖尿病患者在一生中会出现足部溃疡[29]。手术是治疗糖尿病足不可或缺的一环。大约20%的糖尿病足患者需要进行小型或大型下肢截肢手术[30]。在糖尿病足手术中，确定切除范围至关重要。在最大限度地去除坏死组织与最大限度地保留下肢健康部分之间取得平衡，对外科医生来说是一项重大挑战，为此人们研发了各类技术来解决这一问题。然而，包括收缩压测量、踝肱指数以及经皮氧分压在内的传统方法，可重复性和准确性都较低[31]。由于存在神经病变和微血管功能障碍，与非糖尿病患者相比，对糖尿病患者微循环的评估难度更大[32]。迄今为止，清创或截肢的范围主要取决于外科医生的经验。鉴于NIR-II荧光成像具有高SBR和空间分辨率，我们将该技术应用于糖尿病足手术。

本研究招募了5名糖尿病足患者，他们均接受了小型截肢手术。手术期间，患者注射了ICG（7.5 mg），除了进行传统的NIR-I荧光成像外，还接受了NIR-II荧光检查。我们首先采集了明场、NIR-I荧光和NIR-II荧光图像，以比较NIR-I和NIR-II荧光的质量[图3（a）~（c）]。采用CV和SMD2这两个评估参数对图像质量进行定量分析。如图3（d）所示，在三种情况下，NIR-II图像的CV值均超过了NIR-I图像的CV值，这表明NIR-II图像具有更好的成像性能。如图3（e）所示，NIR-II图像的SMD2值始终高于NIR-I图像的SMD2值，进一步证实了NIR-II成像系统成像能力的提升。我们还发现，NIR-II图像中的背景明显少于NIR-I图像中的背景，这意味着NIR-II受环境光的影响更小。

糖尿病足是由糖尿病相关的周围神经病变、周围动脉疾病和感染所引发的[33]。糖尿病足疾病的三个主要致病因素如图4（a）所示。了解糖尿病足的自然病程对于其预防和管理至关重要，该病程可分为五个不同阶段：正常足、浅表溃疡、深溃疡、骨髓炎以及坏疽（部分或整个足部）[34]，如图4（b）所示。3号患者有两种类型的糖尿病足溃疡。红圈中的病变被视为浅表溃疡，而蓝圈中的病变被视为深溃疡。在NIR-II荧光图像中，可以观察到浅表溃疡并未出现信号减弱[图4（c）]。然而，对于3号患者的深溃疡，NIR-II信号在溃疡中心显著下降，在边缘处则有所上升。这一特征有助于区分浅表溃疡与深溃疡，从而为不同类型的溃疡制定精准的治疗策略。4号患者呈现出一个有意思的糖尿病足病例。在此病例中，肉眼观察足部中心并未发现明显坏死迹象。然而，在NIR-II图像中，从足外侧缘到足底中央区域的荧光信号极其微弱，这表明足部内部存在坏死组织[图4（c）]。在NIR-II荧光成像引导下切开皮肤后，坏死组织暴露出来（附录A中图S5）。这一病例意味着NIR-II成像能够在肉眼观察到坏死区域之前就发现它们。针对5号患者，获取了其足部背侧和足底侧的NIR-II图像。大脚趾足底侧的荧光信号微弱，提示出现坏疽[图4（c）]。此外，在足部背侧，除大脚趾外，内侧边缘的荧光信号低于足部其他部位（附录A中视频S1）。该病例同样表明，NIR-II荧光强度的变化比形态变化更为明显，这有助于外科医生开展更精准的手术。所有五名患者的伤口均愈合。

3.5 NIR-II荧光成像有助于评估跟骨骨折手术中手术切口的血供情况

闭合性跟骨骨折占所有骨折的2%，通常需要ORIF [35]。伤口感染和坏死是ORIF术后常见的两种短期并发症，可能导致住院时间延长、再次手术，甚至残疾[35]。跟骨ORIF术后伤口坏死率[图5（a）]高于其他ORIF手术，这是由于跟骨及周围皮肤局部血供具有独特的解剖学特点[36]。对伤口血供进行全面评估对于跟骨ORIF手术也很重要。先前的研究使用激光辅助ICG血管造影来评估伤口血供[37]。以往研究中使用的生物成像窗口位于NIR-I光谱范围。如前所述，NIR-II成像在跟骨ORIF中的价值值得探索。

本研究招募了两名跟骨骨折患者。这两名患者在术后即刻及术后5天均接受了ICG辅助荧光成像检查。患者1是一名56岁男性，因跟骨骨折接受ORIF。术后初次检查显示，伤口血供良好，未见无荧光区域[图5（b）]。在后续检查中，伤口愈合过程与NIR-II荧光信号均表现良好。患者2为女性，术后其伤口周围的NIR-II荧光信号微弱[图5（b），附录A中视频S2]。对伤口进行了密切监测。术后5天，在伤口一角的小区域观察到坏死现象，且该区域无法观察到近红外二区荧光信号。伤口愈合是一个动态过程。术后血供不佳虽未导致糟糕结果，但增加了伤口坏死的风险。

3.6 NIR-II荧光成像辅助皮瓣手术

由于下肢软组织较薄，足部或踝部的严重损伤往往伴有骨骼与肌腱外露，这给重建手术带来了巨大挑战[38]。皮瓣重建，包括游离皮瓣和带蒂皮瓣，是大面积骨骼与肌腱外露的常见治疗方法[39]。确保皮瓣存活是外科医生普遍关心的问题。因此，在皮瓣移位手术前后评估皮瓣的局部血供非常重要，尤其是对于带蒂皮瓣而言。目前的方法包括超声检查[40]和红外热成像[41]。然而，NIR-II成像在皮瓣手术中的价值仍不明确。

一名下肢严重受伤的患者接受了皮瓣延迟术[图6（a）和（b）]。该手术包括两个步骤：皮瓣预处理和皮瓣移位。皮瓣预处理过程[图6（b）上图]阻断了皮瓣周围的血供，仅保留来自皮瓣蒂部的血供，这可以增加蒂部的血流量，提高后续移位步骤中皮瓣的存活率。一周后，血供模式逐渐转为单向，于是进行移位手术。在皮瓣移位手术前，我们为患者注射ICG，使用实验室自建的NIR-II成像系统观察皮瓣的荧光信号。如图6（c）和附录A中视频S3所示，源自蒂部的血管很容易识别，皮瓣不同区域的血供分布也各不相同。靠近蒂部区域的NIR-II信号比远端区域出现得更早。由于NIR-II成像的分辨率较高，我们精确展示了皮瓣成像的整个过程，随后也证明血供如预期那样是单向的。信号出现约2 min后，整个皮瓣逐渐显现出NIR-II荧光，表明皮瓣血供良好[图6（d）]。随后进行了移位手术[图6（b）和附录A中图S6（a）]。患者随后再次注射ICG，以评估皮瓣移位后的血管灌注情况。皮瓣在旋转180°后也呈现出良好的血供[附录A中图S6（b）]。皮瓣的荧光强度逐渐增加，在信号改变开始后的90 s内达到最大值。这一观察结果表明，皮瓣移位前后血供的变化很小，该患者的皮瓣在移位手术后存活良好。

4 讨论

随着荧光成像技术的不断进步以及其融入精准医疗理念，个性化、智能化骨科手术已在临床实践中成为现实。在本研究中，我们利用实验室自建的手术导航系统，将NIR-II荧光成像技术引入足踝手术，在糖尿病足、跟骨骨折以及皮瓣手术中均取得了令人满意的导航效果。结果表明，与目前常用的NIR-I荧光成像相比，NIR-II荧光成像能够生成高质量图像，具有更高的SBR以及更出色的成像细节。

由于NIR-II荧光信号在生物组织中的光吸收适中、光子散射较低，在进行深层组织生物成像时，NIR-II成像技术展现出比NIR-I更高的对比度，因而在临床实践中逐渐成为一项更具前景的技术[7]。在ICG这一美国食品和药品管理局批准的传统近红外荧光染料的辅助下，NIR-I荧光成像已在临床上广泛用于血管造影、腹腔镜手术引导、恶性淋巴结追踪以及肿瘤切除导航[10]。鉴于ICG强光谱尾延伸至NIR-II窗口，研究人员已开始探索NIR-II成像在手术导航方面的巨大潜力。

本研究将NIR-II成像技术的应用拓展到了骨科手术领域，并初步验证了其应用价值。在足踝手术中，评估血供对术中决策十分关键，而NIR-II成像为这一过程提供了极大的便利。血供变化通常早于形态改变发生。手术中使用NIR-II成像能够帮助外科医生精准评估血供，并做出恰当的术中决策。多普勒测量是评估血供最常用的方法之一[19]，它的优势在于便捷且可实时检查。与这种传统方法相比，NIR-II成像技术能够实现非接触式、实时、高分辨率且视野更大的成像。此外，由于我们实验室自建的NIR-II荧光成像设备便于携带，它具备床边检查或门诊检查的潜力。除了本文所述的应用场景，NIR-II荧光成像在其他骨科手术中也有潜在应用。对于慢性骨髓炎患者，该技术有助于识别坏死骨组织，确保清创彻底。在下肢淋巴水肿患者中，皮下注射ICG后，可通过NIR-II荧光成像使淋巴管可视化。这项技术还能协助识别下肢恶性肿瘤的前哨淋巴结。尽管我们强调了NIR-II荧光成像的卓越性能，但这并不意味着NIR-II成像技术未来会取代NIR-I成像技术，它可以成为现有手术导航系统的重要补充。结合NIR-I成像，多通道成像引导手术能够提供全新的导航模式。

在NIR-II成像引导手术领域，未来有三个颇具前景的探索方向。其一，研发具有更长峰值发射波长与更高量子产率的创新型NIR-II荧光探针。尽管我们先前的研究表明，另一种经临床批准的染料——亚甲基蓝，也能实现NIR-II荧光成像[42]，但其强度还不足以完全满足临床需求。另一项研究显示，NIR-IIx子窗口（1400~1500 nm）内的荧光成像在NIR-II成像中表现最佳，因为在该光谱区域，生物组织适度的光吸收能最有效地衰减散射的NIR-IIx荧光光子[7]。然而，荧光探针的亮度仍是阻碍NIR-IIx成像应用于临床实践的主要限制因素。所以，应当合成更多光学性能更佳的荧光团，以满足NIR-IIx成像的要求[43]。此外，人们期待具有更长血液循环时间或组织特异性靶向能力的NIR-II荧光探针能实现临床转化[44‒46]。其二，我们认为开发腹腔镜用的NIR-II荧光成像系统是另一个方向。提升InGaAs相机的像素，并研制用于NIR-II成像的腹腔镜镜头，或许是关键点。其三，引入人工智能（AI）以最大程度发挥NIR-II成像的优势，是潜在的方向。我们团队近期研发出一种经AI增强的NIR-II荧光宽场显微镜，其光通量得到显著提升[47]。类似理念可应用于面向临床的NIR-II荧光成像，基于经AI增强的更高质量NIR-II荧光图像，有望协助开展更精准的手术。

然而，本研究的主要局限性在于患者数量较少，这使得难以通过统计分析得出结论。为了获得更可靠的结果，未来的研究应致力于纳入更多患者，并设置严格合理的对照组和实验组。此外，本研究仅对病变部位的血供进行了定性评估，并分析了绝对荧光强度。在队列研究中，相对荧光强度（定义为测量强度与最大强度之比）更适合用于统计分析，因为不同患者的成像距离、曝光时间以及激发光功率强度各不相同。在未来研究中，有望对荧光强度进行更客观的评估。要得出更可靠的结论，还必须纳入更多参数。灌注时间（定义为从荧光出现到峰值的时间）是一个很有价值的参数，它反映了血液微循环状况。当血液微循环不佳时，灌注时间可能会延长。此外，记录从最大荧光到荧光消失的时长也很有意义，这有助于评估静脉功能。血管出现的顺序是另一个有趣的参数，它有助于区分动脉和静脉。最后，必须考虑其他可能影响荧光强度的因素，包括瘢痕组织、痂皮、水肿及其他相关变量，这些因素有可能影响手术过程中临床评估的准确性。

5 结论

本文展示了NIR-II荧光成像技术在足踝手术中的应用。研究涵盖了三种不同的临床应用场景：糖尿病足、跟骨骨折以及下肢创伤。我们实验室自建的NIR-II荧光成像设备能够获取比传统NIR-I成像仪质量更高的图像。NIR-II成像有潜力帮助外科医生精确判断手术切缘，尽早发现缺血性病变，并动态追踪灌注过程。

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