同时提升糖氨基转移酶热稳定性及对非天然底物催化活性实现糖苷酶抑制剂井冈霉烯胺的高效合成

王润希 ,  乔路 ,  刘慕非 ,  冉艳朋 ,  王军 ,  闫武鹏 ,  冯雁 ,  崔莉

工程（英文） ›› 2024, Vol. 42 ›› Issue (11) : 194 -205.

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工程（英文） ›› 2024, Vol. 42 ›› Issue (11) : 194 -205. DOI: 10.1016/j.eng.2024.04.026
研究论文

同时提升糖氨基转移酶热稳定性及对非天然底物催化活性实现糖苷酶抑制剂井冈霉烯胺的高效合成

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Development of an Engineered Sugar Aminotransferase with Simultaneously Improved Stability and Non-Natural Substrate Activity to Synthesize the Glucosidase Inhibitor Valienamine

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摘要

糖氨基转移酶（SAT）可在特定酮糖的结构上引入氨基，生成具有生物学活性的氨基糖。这一特性已被应用于氨基糖的人工设计合成。例如，利用糖氨基转移酶WecE将井冈霉烯酮转化为高价值的α-葡萄糖苷酶抑制剂井冈霉烯胺。然而，WecE的低热稳定性及其对非天然底物催化活性不足限制了其应用。受限于广泛存在的酶稳定性-活性权衡（stability-activity trade-off）效应，同时提升酶热稳定性和催化活性具有技术挑战性。为了实现WecE热稳定性和催化活性的高效进化，我们使用进化保守性和平均突变折叠能等指标对WecE活性中心57个氨基酸残基进行评估，筛选到14个有助于同步提升热稳定性和催化活性的潜在热点，并采用组合活性中心饱和突变-迭代饱和突变（CAST-ISM）策略针对热点残基进行了正向突变筛选和迭代组合。与WecE野生型相比，第四轮迭代突变体M4（Y321F/K209F/V318R/F319V）在40 °C的半衰期提高了641.49倍，对非天然底物井冈霉烯酮的催化活性提高了31.37倍。第三轮迭代突变体M3（Y321F/K209F/V318R）在40 °C的半衰期提高了83.04倍，对井冈霉烯酮的活性提高了37.77倍。催化性能提升机制分析显示，与野生型相比，热稳定性和催化活性同时提升的突变体蛋白界面相互作用增强、氨基转移反应亲核进攻催化距离缩短。本文提供了一种热稳定性-催化活性热点评估的通用策略，为氨基糖类化合物的人工生物合成提供高稳定性和高催化活性的糖氨基转移酶。

Abstract

Sugar aminotransferases (SATs) catalyze the installation of chiral amines onto specific keto sugars, producing bioactive amino sugars. Their activity has been utilized in artificial reactions, such as using the SAT WecE to transform valienone into the valuable α-glucosidase inhibitor valienamine. However, the low thermostability and limited activity on non-natural substrates have hindered their applications. Simultaneously improving stability and enzyme activity is particularly challenging owing to the acknowledged inherent trade-off between stability and activity. A customized combinatorial active-site saturation test-iterative saturation mutagenesis (CAST-ISM) strategy was used to simultaneously enhance the stability and activity of WecE toward valienone. Fourteen hotspots related to improving the stability-\activity trade-off were identified based on evolutionary conservation and the average mutation folding energy assessment of 57 residues in the active site of WecE. Positive mutagenesis and combinatorial mutations of these specific residues were accomplished via site-directed saturation mutagenesis (SSM) and iterative evolution cycles. Compared with those of the wild-type (WT) WecE, the quadruple mutant M4 (Y321F/K209F/V318R/F319V) displayed a 641.49-fold increase in half-life (t1/2) at 40 °C and a 31.37-fold increase in activity toward the non-natural substrate valienone. The triple mutant M3 (Y321F/K209F/V318R) demonstrated an 83.04-fold increase in (t1/2) at 40 °C and a 37.77-fold increase in activity toward valienone. The underlying mechanism was dependent on the strengthened interface interactions and shortened transamination reaction catalytic distance, compared with those of the WT, which improved the stability and activity of the obtained mutants. Thus, we accomplished a general target-oriented strategy for obtaining stable and highly active SATs for artificial amino-sugar biosynthesis applications.

关键词

糖氨基转移酶 / 热稳定性-活性trade-off / 组合活性中心饱和突变 / 迭代饱和突变 / 设计反应 / 井冈霉烯胺

Key words

Sugar aminotransferase / Stability-activity trade-off / Combinatorial active-site saturation test / Iterative saturation mutagenesis / Artificial reaction / Valienamine

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王润希,乔路,刘慕非,冉艳朋,王军,闫武鹏,冯雁,崔莉. 同时提升糖氨基转移酶热稳定性及对非天然底物催化活性实现糖苷酶抑制剂井冈霉烯胺的高效合成[J]. 工程（英文）, 2024, 42(11): 194-205 DOI:10.1016/j.eng.2024.04.026

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1 引言

氨基糖类化合物（amino sugars）中的氨基葡萄糖是微生物初级代谢中大分子多糖的组成模块，用于结构多糖的生物合成。同时，氨基糖类化合物也作为诸多微生物次级代谢产物的前体，参与大环内酯、蒽环、糖肽和多烯类等抗生素的合成[1‒2]。由于氨基糖类化合物具有广泛的生物学活性和应用价值，对其合成方法的探索是药物合成研究领域的热点。受限于反应过程的低立体选择性，其化学合成方法面临挑战[3‒4]。糖氨基转移酶（SAT）属于5′-磷酸吡哆醛（PLP）依赖性天冬氨酸转氨酶I型（AAT-I）超家族[5]，可以高立体选择性地在酮糖底物上引入手性氨基，实现氨基糖类化合物的生物合成[6]，为氨基糖类药物与化合物的生物合成提供有力工具[7‒9]。

对糖氨基转移酶的研究揭示了其生物学功能，以及氨基糖类化合物在天然产物生物合成中的作用[2]。来自不同细菌、不同天然产物生物合成途径的多种糖氨基转移酶的特征结构已有各种报道[10‒11]，其中包括来自大肠杆菌（E.coli）的WecE [12]、来自委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）的DesV [13]和来自核糖链霉菌（Streptomyces ribosidificus）的RbmB [14]。它们分别是以二磷酸核苷（NDP）-4-酮糖、NDP-3-酮糖和青蟹肌糖（scyllo-inosose）为底物的三个亚家族的代表。

井冈霉烯胺是类寡糖化合物的代表，具有多种生物学活性，是抗糖尿病药物阿卡波糖和抗水稻纹枯病药物井冈霉素A的功能单元[15‒16]。井冈霉烯胺的结构与葡萄糖类似，具有出色的糖苷酶抑制作用，可作为新药开发的功能性前体[17]。其独特的多手性中心结构意味着它很难通过立体选择性较低的化学方法实现规模合成[18]。目前，井冈霉烯胺通过复杂的半生物合成过程生产，其步骤主要包括：首先由吸水链霉菌5008（Streptomyces hygroscopicus 5008）生产井冈霉素A，随后利用嗜糖黄杆菌（Flavobacterium saccharophilum）或其他微生物降解井冈霉素A得到[19‒20]。这一复杂工艺涉及两种不同微生物的发酵过程，并且由于C-N-C键裂解位点的特异性较差，降解过程效率低下的同时会产生许多副产物[19‒20]。相比之下，井冈霉素A生物合成的中间体（井冈霉烯酮）更适合作为井冈霉烯胺直接合成的前体[21]。

在前期研究[12]中，我们发现在大肠杆菌中负责催化天然底物二磷酸胸苷（TDP）-4-羰基-6-脱氧-D-葡萄糖（TDP-Glc4O）转氨反应的糖氨基转移酶WecE可以仅通过一步简单的氨基转移反应，高立体选择地催化非天然底物井冈霉烯酮生成井冈霉烯胺[对映体过量（e.e.）值> 99%]，如图1所示[7]。与其他生物催化的候选酶类似[22]，WecE也表现出一些缺点，包括热稳定性低（40 ℃半衰期为2.07 min）和对非天然底物井冈霉烯酮的活性不足，限制了这一合成方案的应用。

组合活性中心饱和突变（CAST）和迭代饱和突变（ISM）策略可以提升酶的催化性能。这些策略通过创建高质量突变文库，对活性中心残基进行定向进化[23]。CAST-ISM策略已被应用于一些ω-氨基转移酶的性能进化，例如，Novick等[24]对来自Vibrio fluvialis JS17的氨基转移酶ATA-217活性中心底物结合区域的残基进行了进化，大幅提高了其对沙库巴曲手性前体的催化活性。此外，Jia等[25]对一种R构型选择性的氨基转移酶（Capronia epimyces TA）活性中心大底物结合口袋中的残基进行了饱和突变与组合突变，获得了催化活性和热稳定性都显著提升的突变体。然而，迄今为止，还没有利用CAST或其他方法对糖氨基转移酶进行热稳定性-催化活性工程化改造的研究报道。

本研究针对糖氨基转移酶WecE热稳定性和催化活性共同提升，制定了可通用的半理性CAST-ISM进化策略，获得了具有更高的热稳定性同时对非天然底物井冈霉烯酮催化活力更高的突变体。以进化保守性和突变折叠自由能变化等多个指标系统评估了WecE活性中心潜在的提升热稳定性和催化活性热点残基，从WecE活性中心的57个残基中发现了14个与提高热稳定性和催化活性相关的潜在位点，然后以其为靶点构建了高质量CAST-ISM突变文库，获得了热稳定性和催化活性均优于野生型（WT）的突变体。本研究展示了一种可推广的氨基转移酶半理性进化方案，针对靶向热点残基同时提高糖氨基转移酶的热稳定性和催化活性，为今后改造生物合成途径中的酶以及开发新生物合成途径奠定基础。

2 材料与方法

2.1 通用材料

蛋白质表达载体pET28a和大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞分别购自Novagen公司（德国）和诺唯赞生物技术有限公司。基因扩增和突变体文库构建使用购自Takara公司（中国）的高保真DNA聚合酶。井冈霉烯酮由药明康德公司合成。井冈霉烯胺标准品购自上海海翔医药发展有限公司。所有其他化学试剂购自美国Sigma-Aldrich公司，均为试剂级或更高级别。

2.2 热点残基的筛选

2.2.1 进化保守性分析

使用HHblits算法[26]在UniRef30数据库[27]中搜索WecE的同源序列；使用由EMBL-EBI支持的Clustal Omega在线工具[28]对获得的94 680个条目进行比对。使用MEGA X软件（v10.0.2）[29]构建系统发育树，以ConSurf服务器上[30]的最佳拟合氨基酸替换模型对WecE组成氨基酸进行进化保守性分析。使用贝叶斯方法计算了保守性得分，生成了由2105个同源序列组成的多序列比对。WecE的组成残基被赋予1~9分的保守性得分，得分越高表示保守性越强。使用LigPlot+ [31]对蛋白质数据库（PDB ID: 4PIW）中WecE的LLP内醛亚胺中间体进行了相互作用分析，确定相互作用关键残基的保守性，定义可变残基。

2.2.2 稳定性影响评估

为了评估WecE活性中心39个可变残基的饱和突变对其热稳定性的潜在影响，我们使用集成并行DDGScan工作流程[32]中的FoldX和ABACUS2算法计算了每个突变相对于野生型WecE的相对折叠自由能（ΔΔG = ΔG substitution－ΔG WT）。其中，FoldX使用经验有效力场（EEEF）算法获得 Δ Δ G F o l d X，ABACUS2则基于骨架折叠能量计算算法获得 Δ Δ G A B A C U S 2。使用统计软件SPSS v26.0（IBM，美国）对饱和突变的ΔΔG 值（ Δ Δ G F o l d X和 Δ Δ G A B A C U S 2）进行min-max归一化处理[33]。标准分数（Z-score）[33]作为统计测量方法，用于量化数据集平均值与某一数据点的标准差，使用SPSS®软件（v26.0）计算了每个位点饱和突变平均突变折叠能 ( Δ Δ G F o l d X ¯ 和 Δ Δ G A B A C U S 2 ¯ )的Z-score，与整个数据集的平均值进行比较，评估突变位点对稳定性的潜在影响。

2.3 酶分子进化突变体性质表征

2.3.1 定点饱和突变与筛选

使用聚合酶链反应（PCR）从大肠杆菌MG1655基因组中扩增出编码WecE的基因，使用NheI/XhoI限制性内切酶与DNA连接酶将其连接到pET28a表达载体中，作为初始进化模板。使用NNK简并引物（附录A中表S1）通过全质粒PCR构建定点饱和突变（SSM）文库[34]。利用基于SAT和L-谷氨酸脱氢酶（L-GDH）偶联的高通量方法（附录A中表S1）[35‒36]，在96孔板中对突变库进行筛选。转化子菌体在20 mmol∙L-1磷酸盐缓冲液（pH = 7.5）中裂解，于37 °C 孵育30 min后，添加1 mmol∙L-1井冈霉烯酮、5 mmol∙L-1谷氨酸（Glu）、50 μmol∙L-1 PLP开始转氨反应；转氨反应进行2 h后与0.5 单位（U）L-GDH、0.5 mmol∙L-1还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和5 mmol∙L-1 NH4Cl组成的指示反应相偶联。使用多扫描光谱微孔板分光光度计（SpectraMax®M5 Multimode Plate Reader; Molecular Devices，美国），以340 nm处吸光度的下降值作为报告信号来检测NADH的消耗，筛选稳定性和活力提升的突变体。

2.3.2 蛋白酶表达与纯化

野生型WecE和突变体的重组菌株在LB培养基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化钠和 50 μg∙mL-1卡那霉素）中培养（37 °C, 220 r∙min-1）至600 nm处的光密度（OD600nm）达到0.5。加入0.5 mmol∙L-1异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），37 °C诱导12 h。培养液于4 °C、12 000 r∙min-1离心15 min，收集菌体，在20 mmol∙L-1磷酸盐缓冲液（pH = 7.5）中超声裂解。使用镍离子螯合亲和层析法分离可溶性蛋白，200 mmol∙L-1咪唑溶液洗脱。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）确认蛋白质的表达和纯化，并使用NanoDrop Lite分光光度计（Thermo Fisher Scientific Inc.，美国）根据紫外（UV）吸光度测定蛋白质浓度。

2.3.3 催化活性与动力学评估

在20 mmol∙L-1磷酸盐缓冲液（pH = 7.5）中，添加10 mmol∙L-1井冈霉烯酮、40 mmol∙L-1 L-谷氨酰胺（Gln）、50 μmol∙L-1 PLP和1 mg∙mL-1纯化酶进行反应，以不含酶的混合物为对照，测定WecE及其突变体对非天然底物井冈霉烯酮的催化活性。反应在37 °C进行2 h，使用等体积的甲醇终止反应，将混合物在12 000 r∙min-1转速下离心10 min去除蛋白沉淀。反应产物井冈霉烯胺在25 ℃下用邻苯二甲醛（OPA）在硼酸盐缓冲液（pH = 9.0）中衍生化30 s，使用Eclipse XDB-C18色谱柱（5 μm, 4.6 mm × 150.0 mm），以22%的乙腈作为流动相，在Agilent 1200 Infinity LC系统上使用荧光检测器在445 nm发射波长和340 nm激发波长下进行检测[37]。

在96孔板中添加100 μL反应混合物（0.85 mg∙mL-1纯化酶、5 mmol∙L-1 L-Glu和5 μmol∙L-1 PLP），以依赖NADH的L-GDH作为偶联酶（0.5 U L-GDH、0.5 mmol∙L-1 NADH和5 mmol∙L-1 NH4Cl），在pH = 7.5和25 °C条件下测定WecE野生型及突变体对井冈霉烯酮的酶反应动力学参数[35]。在井冈霉烯酮浓度梯度为0.01~1.50 mmol∙L-1下测定初始反应速率。在340 nm波长下连续监测NADH的氧化过程。每分钟能够还原1 μmol NADH的酶量被定义为一个酶活单位（U）[12]，采用Origin 2021软件（Origin Lab，美国）Michaelis-Menten方程进行非线性回归分析确定分别代表酶对底物的亲和力和酶催化效率的动力学参数K M和k cat。

2.3.4 热稳定性参数表征

采用差示扫描荧光法（DSF）测定WecE及突变体M3和M4的热半解折叠温度（T m）[38]。将每种混合物（含有终浓度0.2 mg∙mL-1酶和终浓度1 μL 1× SYPRO橙色荧光染料）的等分样品（20 μL）在4 °C下预孵育20 min。初始温度设定为25 °C，以2 ℃∙min-1的速度升至85 ℃。采用实时PCR技术检测激发波长为490 nm，发射波长580 nm处的荧光信号。通过Origin2021软件（Origin Lab）将荧光信号变化曲线拟合至波尔兹曼曲线，拐点即为T m。

T 50 15代表在15 min热处理后酶活性降至50%的温度[39]。为确定T 50 15值，将纯化的蛋白质放入0.2 mL PCR管中热处理，使用可编程热循环仪将温度精确控制在35~50 °C。在20 mmol∙L-1磷酸盐缓冲液（pH = 7.5）中，1 mg∙mL-1酶在不同温度下处理15 min，随后4 °C冷却10 min。在转氨反应体系中37 °C孵育2 h后，测定残余活性。利用Origin 2021软件（Origin Lab）的波尔兹曼S型拟合法确定特定温度下残余活性的拐点，即为T 50 15。

t 1/2指的是酶失活的半衰期[40]。为确定该值，野生型WecE和突变体M3和M4（2 mg∙mL-1）在40 °C孵育0~20 min，随后在冰上冷却10 min。如2.3.3节所述，在37 ℃下测定酶的残余催化活性。一阶速率常数（k d）通过Origin 2021软件（Origin Lab）中通过残余活性对数与培养时间（t）的线性回归确定。40 ℃下的t 1/2值通过公式t 1/2 = ln 2/k d计算得到[40]。

2.3.5 半制备合成井冈霉烯胺

在15 mL反应体系中，使用10 mg∙mL-1纯化的突变体M3、M4和野生型WecE、20 mmol∙L-1井冈霉烯酮（52.6 mg）、80 mmol∙L-1 L-Gln和100 mmol∙L-1 PLP，进行了50 mg制备规模的井冈霉烯胺的预制备酶法合成。反应在20 mmol∙L-1磷酸盐缓冲液（pH =7.5）、37 °C、50 r∙min-1条件下反应12 h。每隔2 h使用OPA柱前衍生化-高效液相色谱（HPLC）分析法[37]，检测产物井冈霉烯胺的生成。

2.4 分子动力学模拟与分析

为了分析WecE野生型和突变体的结构-功能关系，我们以蛋白质数据库中WecE野生型的结构（PDB ID: 4ZAH）为模板，使用SWISS-MODEL在线服务器构建了突变体M3和M4的同源二聚体模型。使用蛋白质结构验证工具MolProbity [41]、GMQE和SWISS-MODEL提供的QMEANDisCo Global对模型进行评估。使用Discovery Studio 3.5（Accelrys，美国）构建了井冈霉烯酮结合5′-磷酸吡哆胺（PMP）的外醛亚胺中间体（井冈霉烯酮-PMP）。使用Amber 2022在ff14SB和GAFF2力场下分别对蛋白质（WecE和野生型突变体M3、M4）和配体（井冈霉烯酮-PMP）进行100 ns的分子动力学（MD）模拟。

使用PyMol（v2.6.0）可视化酶-中间体复合物结构，并计算静电势。配体接触表面积（LCSA）计算使用Discovery Studio 3.5（Accelrys）的蛋白质界面分析模块（Analyze Protein Interface module）。模拟过程中的均方根偏差（RMSD）、均方根波动（RMSF）、平均结构模型、催化距离测量、二聚体界面和酶-中间体氢键（HB）相互作用、溶剂可及表面积（SASA）和回旋半径（RoG）均使用Amber 2022的CPPTRAJ套件进行计算。使用Amber 2022的MMPBSA.py计算分子力学泊松-玻尔兹曼表面积（MM/PBSA）受体能量和井冈霉烯酮-PMP过渡态的结合能。使用VMD 1.9.4分析盐桥（SB）相互作用，氧-氮距离截止值为3.2 Å。使用PDBsum [42]分析模拟过程中平均结构模型的结构特征，包括界面面积、底物结合位点体积和二聚体界面的相互作用。

3 结果

3.1 活性中心中可变残基的鉴定

利用ConSurf服务器对WecE活性中心残基进化保守性进行评估，依据同源序列之间的系统发育关系确定高保守性重要残基的位置[30]，结果显示，与TDP-Glc4O在WecE活性中心的结合区域相比，辅因子PLP的结合区域包含更多的保守残基[图2（a）]；结合使用LigPlot+ [31]对WecE的晶体结构（PDB ID：4ZAH和4PIW）[43]与保守辅因子PLP具有相互作用的氨基酸残基进行分析发现，与PLP相互作用的残基保守性分数均为8分及以上[图2（b）；附录A中图S1和图S2]。因此，我们将保守性分数8定义为区分WecE活性中心可突变残基和不可突变残基的阈值。

根据氨基转移的催化机理[44]，转氨反应由两个可逆的半反应组成，分别涉及一个由氨基供体和氨基受体形成的外部醛亚胺中间体（附录A中反应流程S2）。根据4ZAH中TDP-Glc4O外醛亚胺过渡态（TDP-Glc4O-PMP）的晶体结构[43]，我们构建了井冈霉烯酮-PMP的外醛亚胺过渡态，并将其对接到WecE的活性中心[图2（c）]。依据蛋白质中残基的作用距离[45]，在与井冈霉烯酮-PMP结合的8 Å范围内筛选到57个残基（附录A中图S3）。依据氨基酸残基进化保守性分析，在以上57个残基中，有18个残基的保守性得分为8分及以上[图2（c）]。这些残基被排除在活性中心候选进化残基之外，以尽量减少CAST文库中的失活突变。

3.2 稳定性有利残基分析

为了进一步锁定热稳定性-催化活力提升的热点残基，提升CAST的进化效率，在利用保守性评估分数确定了WecE活性中心可变残基之后，我们对获得的39个可变残基进行了稳定性提升潜力评估。根据低折叠自由能有利于蛋白质稳定性的原理[46]，我们采用基于蛋白质结构的相对折叠自由能（ΔΔG）计算作为评价指标。使用两种基于不同力场的预测工具——FoldX [47‒48]和ABACUS2（a backbone-based amino acid-usage-survey）[49]，评估了39个可变残基所有可能的饱和突变ΔΔG及其对稳定性的潜在影响。针对39个可变残基的饱和突变共获得1560（39 × 20 × 2）个饱和突变折叠自由能（ Δ Δ G F o l d X和 Δ Δ G A B A C U S 2），通过min-max归一化处理[33]，使预测的ΔΔG分布范围为0~1 [图3（a）]。

为了比较各残基对稳定性的影响，我们计算了每个位点饱和突变的平均突变自由能 Δ Δ G F o l d X ¯和 Δ Δ G A B A C U S 2 ¯，及其相对于整个数据集平均值的Z-score [33]。Z-score小于0的位点表示该残基的 Δ Δ G F o l d X ¯或 Δ Δ G A B A C U S 2 ¯低于测试数据集的平均值。依据较低的平均突变折叠自由能与较高的稳定性相关[46]，Z-score小于0的残基被认为是潜在的提升稳定性的残基。其中，基于经验有效力场（EEEF）的FoldX [48]确定了20个稳定性有利热点残基，基于统计能量函数（SEF）的ABACUS2 [49]确定了19个稳定性提升残基[图3（b）]。同时考虑两种折叠自由能评估，最终14个 Δ Δ G F o l d X ¯和 Δ Δ G A B A C U S 2 ¯值均低于测试数据集平均值（Z-score < 0）的残基被认为是有利于稳定性提升的“热点”残基。

3.3 针对热点残基的定点饱和突变

以野生型WecE为初始模板，使用简并NNK密码子（N = A/C/G/T和K = G/T，附录A中表S1），针对WecE活性中心14个潜在的关键热点残基，构建SSM [50]文库[图4（a）；附录A中表S2]。将菌体破碎液在37 ℃孵育30 min后，使用NADH依赖的L-GDH偶联高通量方法（反应流程S1）在96孔板上对突变文库进行筛选[35‒36]，以获得同时提高稳定性及氨基转移活性的突变体。通过测定热半解折叠温度（T m）[38]、40 ℃半衰期（t 1/2）[40]以及15 min热处理后活性降至50%的温度（T 50 15）[39]评估突变体的稳定性。同时，使用OPA柱前衍生化高效液相色谱检测产物井冈霉烯胺[7,37]评价突变体对井冈霉烯酮的转氨活性。

结果表明，残基Y321、K209、V318和F319是可以同时增强热稳定性和转氨活性的有益位点[图4（a）]。每个残基位点活性提高程度最大的突变体分别是Y321F、K209F、V318R和F319V。与野生型WecE相比，突变体对井冈霉烯酮的催化活性分别提高了4.82倍、3.52倍、2.37倍和1.87倍[图4（b）；附录A中图S4]。与之相应，各突变体的T m值与野生型WecE相比，增加了1.28~5.03 °C；T 50 15值增加了1.52~4.93 °C；40 °C t 1/2增加了4.29~39.83倍（附录A中表S3）。其中，Y321F和V318R对活性提高的贡献更大，而F319V和K209F更有利于稳定性的提高[图4（b）]。

3.4 迭代饱和突变增强热稳定性和催化活性

为了最大限度地发挥Y321、K209、V318和F319位点的潜在协同作用，我们依据ISM策略[51]，以活性提升最大的Y321F突变体（M1）为起始模板，按照K209、V318和F319的活性提高顺序进行了三轮迭代饱和突变。在迭代饱和突变库筛选期间，使用每轮迭代的模板突变体和野生型作为对照，以确定“稳定性-活性权衡”的影响是否导致活性的降低。在每一轮迭代中表现最佳的突变体分别被命名为M2、M3、M4。对每个突变体进行纯化，测定其稳定性参数和以井冈霉烯酮为底物的动力学常数（表1；附录A中图S5至图S8）。

与野生型WecE相比，每轮迭代突变筛选中表现最佳的突变体都显著提高了热稳定性和对井冈霉烯酮的活性。此外，迭代的多位点突变表现出了不同位点突变的非加性效应。突变体M3和M4在40 °C时的t 1/2分别表现出83.04和641.49倍的增强（表1；附录A中图S5至图S7），而在体外催化井冈霉烯酮合成井冈霉烯胺的实验中，M3的活性与野生型相比增加了37.77倍，M4则增加了31.37倍（附录A中图S4）。在4个有益突变位点的迭代过程中，我们也观察到了稳定性和活性之间的权衡（trade-off）效应[图5（a）]。测定得到的稳定性参数和动力学常数表明，与M3相比稳定性最佳的突变体M4经过F319V突变后，40 ℃的t 1/2值提高了7.73倍，而催化井冈霉烯酮k cat/K M值降低了11.3%。相反，当突变体M2经过V318R突变后，得到活性最佳的突变体M3，其k cat/K M值增加了2.93倍，40 ℃的t 1/2值降低了16.7% [图5（a）和表1]。

随后，我们进行了50 mg规模的制备反应，并使用OPA柱前衍生化及高效液相色谱[37]，在12 h内每2 h检测井冈霉烯胺的产量。在M3和M4的制备反应过程中，井冈霉烯胺产量在1~8 h内显著增加，并在随后4 h内保持稳定。在总时长12 h的反应结束时，M3和M4的井冈霉烯胺产量分别是野生型WecE的20.03倍和17.67倍[图5（b）]。

3.5 探索WecE突变体稳定性提升机制

为了研究突变体热稳定性和催化活性的提升机制，我们以野生型WecE（PDB ID: 4ZAH）为模板，使用SWISS-MODEL构建了活性提升最佳突变体M3和稳定性提升最佳突变体M4的同源二聚体模型。蛋白结构检测工具MolProbity [41]对模型的评估结果表明，突变体M3和M4模型中96.79%和96.52%的残基符合拉氏偏好（Ramachandran favored），确保了模型的质量（附录A中图S9和图S10）。采用获得的模型进行了MD模拟（附录A中图S11），以研究二聚体蛋白界面的结构特征及其与井冈霉烯酮-PMP外醛亚胺过渡态的相互作用。

使用PDBsum [42]对100 ns MD获得的M3、M4和野生型WecE与井冈霉烯酮-PMP平均模拟结构的特征分析表明，突变体M3和M4活性中心的形状和静电势发生了改变，突变体平均模拟结构的二聚体界面面积增加，相应底物结合口袋的体积减小[图6（a）；附录A中图S12至图S14]。突变体M3和M4的平均模拟结构的界面相互作用显著加强，同时伴随着SB和HB相互作用的增加（附录A中图S12至图S14）。这些发现表明，界面相互作用的加强有助于亚基间的组装，从而增强多聚体酶分子的稳定性并保护蛋白质免受分解[52‒53]。

我们对野生型WecE与突变体M3和M4在MD模拟过程中的SB相互作用变化进行了分析和比较。与野生型WecE相比，M3和M4突变体亚基作用界面上形成的SB数量更多[图6（b）]。在野生型和突变体中，参与SB相互作用的氨基酸残基数目相同；然而，残基K209在野生型WecE中形成SB，突变为F209后在突变体M3和M4中则不再参与SB相互作用。相反，残基V318在野生型中不参与SB作用，但突变为R318后在突变体M3和M4中形成了新的SB相互作用（附录A中图S15）。

蛋白界面HB相互作用的分析表明，与野生型相比，M3和M4中HB相互作用的总数和在残基307至321区域（附录A中图S16），参与HB相互作用的残基数量都有所增加[图6（b）]。残基209和残基319在野生型和突变体M3、M4中都参与了HB相互作用，而Y321F和V318R只在突变体M3和M4中蛋白界面引发了新的HB相互作用[图6（c）；附录A中图S16]。此外，突变体M3和M4的RoG、SASA、MM/PBSA受体能值（receptor energy values），以及代表蛋白质内部相互作用总量的蛋白质自由能，与野生型相比有所下降，与观察到的稳定性增强现象一致[图6（d）]。

3.6 解析催化活性增强机制

对氨基转移反应的研究表明，活性中心保守赖氨酸残基对外醛亚胺的亲核进攻需要与反应原子非常接近[44,54]。WecE活性中心保守的K181（附录A中图S17）作为亲核进攻的催化残基，在晶体结构中与PLP形成内部席夫碱（Schiff base）[43]。利用MD模拟计算野生型WecE、突变体M3和M4残基K181的ε-氨基到井冈霉烯酮-PMP中间体C=N键的N原子的催化距离发现，与野生型WecE相比，突变体M3和M4显示出更短的原子距离[图7（a）；附录A中图S18]，与催化距离缩短有利于亲核进攻的观点一致[44,54]。

MD模拟酶和底物中间体HB相互作用[图7（b）]分析发现，突变体M3和M4的活性提升与K181和井冈霉烯酮-PMP之间的HB相互作用的总数呈正相关[图7（c）]，这与催化距离分析一致。与野生型相比，突变体中井冈霉烯酮-PMP与残基K209F和Y321F之间的HB相互作用数量减少[图7（c）；附录A中图S19]，这一观察结果符合氨基酸残基化学性质的改变。其中，Y321和K209的极性酪氨酸和带正电的赖氨酸突变为疏水的苯丙氨酸会引起这些位点从亲水作用到疏水作用的改变[55]，从而减弱了与高极性、多羟基的井冈霉烯酮-PMP的相互作用。

我们最后评估了MM/PBSA结合能，这是蛋白质和配体之间相互作用强度和结合稳定性的指标[56]。同时，我们研究了LCSA。与野生型相比，突变体M3和M4计算得到的井冈霉烯酮-PMP结合能的MM/PBSA值降低。此外，M3的预测结合能低于M4，这与其催化活性相比M4有更大的提升相一致。而增加的LCSA表明二聚体界面与底物配体之间的接触面积增加（附录A中表S4），突变体与井冈霉烯酮-PMP之间的相互作用增强[图7（d）]。

4 讨论

在化学、生物学和医学领域，简捷、经济地获得具有生物活性的手性胺十分重要[57]。然而，生物合成途径容易受到催化酶低热稳定性和催化活性等固有缺陷的阻碍[22]。蛋白质工程是一项改善酶活性和稳定性的有效方法[58]。然而，在酶进化过程中，稳定性和催化活性之间普遍存在负相关关系，这种现象通常被称为“稳定性-活性权衡”[59‒60]。因此，相比针对蛋白质单一性质的工程设计与改造，同时对热稳定性和催化活性进行提升的成功案例较少[61]。

为了寻找同时具有高稳定性和高催化活性的酶，研究人员将研究重心聚焦于和活性中心距离较远的界面残基，并以此来维持酶的催化活性。例如，多聚赖氨酸脱羧酶CadA的进化[62]和来源于Aspergillus terreus的转氨酶At-ATA的热稳定性和活性进化[63]。或者使用来自嗜热生物具有高稳定性的酶为初始模板，进一步提高酶的催化活性[64]。同源二聚体WecE两个单体均为活性中心提供功能残基，并且WecE活性中心区域也构成了二聚体界面的一部分[43,65]。由于WecE活性中心同时包含催化残基和界面作用残基，我们推测在该区域引入突变可以同时增强稳定性和催化活性。

热点残基的精准定位被认为是实现CAST-ISM高效进化的前提[58]。许多酶进化的研究倾向于针对非保守残基进行突变，以期最大限度地减少有害突变并提高CAST文库的质量[66]。当使用进化保守性评估作为保护活性位点催化功能必需残基的指标时[如使用ConSurf服务器分析保守性，获得1~9的评分，评分越高表示保守性越高，如图2（a）所示]，缺少简便的基于序列保守性评分来定义可变残基的标准。WecE与辅因子PLP在晶体结构中（PDB ID: 4PIW）的HB相互作用分析表明，与PLP相互作用的残基高度保守（保守性评分≥ 8）[图2（b）]。因此，我们将得分低于8的残基定义为可变残基。该方案为评估候选残基的可突变性提供了基于序列、结构和相互作用的多维标准。

使相对折叠自由能降低的突变可能有助于增强蛋白质稳定性[46]。为了提高预测的准确性，我们使用两种算法对WecE活性中心井冈霉烯酮-PMP结合区域8 Å范围内的57个残基中的39个可变残基进行虚拟饱和突变，得到1560个（39 × 20 × 2）突变体的ΔΔG值。需要解决的问题是，仅根据ΔΔG值来评估突变对稳定性的影响缺少明确的阈值。已报道方法通常选择ΔΔG值小于0的突变以获得有利于稳定性的低能量位点[67‒68]。对于特定位点的饱和突变，20个突变体产生的ΔΔG值十分发散，难以用简单的正值或负值测量，无法形成该残基对稳定性影响的理性判断。

本研究中针对上述问题提出了流程化的可行性解决方案：首先，对ΔΔG值进行归一化，使数据具有统一的维度，并保留原始数据之间的相对关系[33]，如附录A中图S20（a）和（b）所示。其次，计算每个突变位点的平均突变折叠自由能（ ∆ ∆ G ¯），以便与其他位点进行比较，确定候选的稳定残基。最后，计算39个残基的标准分数Z-score，以描述每个 ∆ ∆ G ¯值与数据集均值（ ∆ ∆ G ̿）的关系。Z-score为负的残基突变能低于平均值，被预测为候选位点更有利于提高稳定性，定义其为有益于稳定性提升的残基[附录A中图S20（c）]。

总之，我们根据晶体结构中与辅因子相互作用残基的保守性分数确定了可变残基的阈值，通过比较候选位点饱和突变的平均突变能量评估候选位点对稳定性的影响，基于数据集平均值来获得稳定性热点残基（低于平均值）。突变可行性和稳定性的评估使我们能够在WecE活性中心57个残基中预先筛选出14个潜在的稳定性和活性提升热点残基。与传统定向进化的随机突变文库相比[70]，我们运用CAST-ISM策略进行定向进化的筛选规模显著减少到2000个以下[69]，实现酶稳定性-催化活性共同提升的同时，大幅提高了酶分子进化的效率。

5 结论

本研究中，我们针对糖氨基转移酶WecE设计定制了半理性CAST-ISM进化策略，并成功获得了与野生型WecE相比，对非天然底物井冈霉烯酮具有更高催化活性和热稳定性的突变体。为了提高进化效率，在构建CAST文库之前，基于进化保守性和相对折叠能量等多指标评估，在WecE活性中心的确定了潜在稳定性-活性提升热点残基。这种热稳定性和催化活性的协同提升的进化策略成功克服了酶进化过程中热稳定性和催化活性之间的“权衡”效应。两个表现最佳的突变体M3和M4在40 ℃的半衰期分别提高了83.04倍和641.49倍，其催化井冈霉烯酮合成井冈霉烯胺的活性分别提高了37.77倍和31.37倍。本研究针对同时提高稳定性和活性的挑战，提出了一种以热点残基分析为导向的进化方法，可快速获得稳定和高活性的糖氨基转移酶，以用于生产高价值的氨基糖类化合物。

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