靶向PKM2可通过巨噬细胞和肝脏特异性机制改善NASH纤维化

曲桁东; 张迪; 刘均立; 邓洁萍; 谢若研; 张珂珂; 李红梅; 陶萍; 汪根树; 孙健; 罗钧洪; 曲辰; 叶文才; 洪健

doi:10.1016/j.eng.2024.05.005

工程（英文） ›› 2024, Vol. 41 ›› Issue (10) : 198 -213. DOI: 10.1016/j.eng.2024.05.005

研究论文

靶向PKM2可通过巨噬细胞和肝脏特异性机制改善NASH纤维化

曲桁东 ^a^,^b ,
张迪 ^a^,^b ,
刘均立 ^a^,^b ,
邓洁萍 ^c ,
谢若研 ^b ,
张珂珂 ^b ,
李红梅 ^b ,
陶萍 ^a^,^b ,
汪根树 ^d ,
孙健 ^e ,
罗钧洪 ^c ,
曲辰 ^a^,^b ,
叶文才 ^a ,
洪健 ^a^,^b^,^e

作者信息 +

Therapeutic Targeting of PKM2 Ameliorates NASH Fibrosis Progression in a Macrophage-Specific and Liver-Specific Manner

Hengdong Qu ^a^,^b^,^# ,
Di Zhang ^a^,^b^,^# ,
Junli Liu ^a^,^b^,^# ,
Jieping Deng ^c^,^# ,
Ruoyan Xie ^b ,
Keke Zhang ^b ,
Hongmei Li ^b ,
Ping Tao ^a^,^b ,
Genshu Wang ^d ,
Jian Sun ^e ,
Oscar Junhong Luo ^c ,
Chen Qu ^a^,^b ,
Wencai Ye ^a^,^* ,
Jian Hong ^a^,^b^,^e^,^*

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摘要

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）已成为全球终末期肝病的重要原因，目前尚无有效治疗手段。肝纤维化作为NASH进展的关键环节，主要由慢性炎症和肝星状细胞（HSC）活化驱动，并直接决定了NASH患者的预后。研究表明丙酮酸激酶M2（PKM2）参与调控多种免疫细胞的激活及炎症性肝病进展。然而，其在NASH相关肝纤维化中的功能和治疗潜力尚不明确。通过分析公共数据库并在NASH患者和小鼠肝脏组织中进行验证，我们发现PKM2在伴有肝纤维化的NASH肝脏的非实质细胞（NPC），尤其是巨噬细胞中的表达显著上调。基于巨噬细胞条件性PKM2敲除小鼠（PKM2^FL/FLLysM-Cre），我们在蛋氨酸和胆碱缺乏（MCD）饮食、高脂高胆固醇（HFHC）饮食和西式饮食联合四氯化碳（WD/CCl₄）三种NASH模型中，均观察到PKM2缺失可显著改善肝脏炎症微环境并抑制纤维化进程。单细胞转录组测序分析表明，敲除巨噬细胞PKM2显著减少了促纤维化Ly6C^high巨噬细胞浸润。机制研究提示，PKM2通过调控糖酵解促进了炎性巨噬细胞中含NLR家族pyrin域蛋白3（NLRP3）的激活，从而诱导HSC活化及NASH相关肝纤维化进展。靶向作用PKM2（PKM2变构剂）在体外和体内均有效地减弱了巨噬细胞和HSC之间的促纤维化串扰。具有肝脏靶向特性的胆固醇偶联异源双链寡核苷酸药物（Cho-HDO）可剂量依赖性地逆转NASH相关的纤维化，且无明显肝毒性。本研究阐明了巨噬细胞PKM2在促进NASH纤维化中的关键作用，因此以巨噬细胞或肝脏特异性方式调控PKM2，将有助于为NASH相关肝纤维化治疗提供新的理论依据。

Abstract

Nonalcoholic steatohepatitis (NASH) may soon become the leading cause of end-stage liver disease worldwide with limited treatment options. Liver fibrosis, which is driven by chronic inflammation and hepatic stellate cell (HSC) activation, critically determines morbidity and mortality in patients with NASH. Pyruvate kinase M2 (PKM2) is involved in immune activation and inflammatory liver diseases; however, its role and therapeutic potential in NASH-related fibrosis remain largely unexplored. Bioinformatics screening and analysis of human and murine NASH livers indicated that PKM2 was upregulated in nonparenchymal cells (NPCs), especially macrophages, in the livers of patients with fibrotic NASH. Macrophage-specific PKM2 knockout (PKM2^FL/FLLysM-Cre) significantly ameliorated hepatic inflammation and fibrosis severity in three distinct NASH models induced by a methionine- and choline-deficient (MCD) diet, a high-fat high-cholesterol (HFHC) diet, and a western diet plus weekly carbon tetrachloride injection (WD/CCl₄). Single-cell transcriptomic analysis indicated that deletion of PKM2 in macrophages reduced profibrotic Ly6C^high macrophage infiltration. Mechanistically, PKM2-dependent glycolysis promoted NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3) activation in proinflammatory macrophages, which induced HSC activation and fibrogenesis. A pharmacological PKM2 agonist efficiently attenuated the profibrotic crosstalk between macrophages and HSCs in vitro and in vivo. Translationally, ablation of PKM2 in NPCs by cholesterol-conjugated heteroduplex oligonucleotides, a novel oligonucleotide drug that preferentially accumulates in the liver, dose-dependently reversed NASH-related fibrosis without causing observable hepatotoxicity. The present study highlights the pivotal role of macrophage PKM2 in advancing NASH fibrogenesis. Thus, therapeutic modulation of PKM2 in a macrophage-specific or liver-specific manner may serve as a novel strategy to combat NASH-related fibrosis.

关键词

丙酮酸激酶M2 / 巨噬细胞 / 非实质细胞 / 异源双链寡核苷酸 / 非酒精性脂肪性肝炎 / 肝纤维化

Key words

Pyruvate kinase M2 / Macrophages / Nonparenchymal cells / Heteroduplex oligonucleotide / Nonalcoholic steatohepatitis / Liver fibrosis

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曲桁东,张迪,刘均立,邓洁萍,谢若研,张珂珂,李红梅,陶萍,汪根树,孙健,罗钧洪,曲辰,叶文才,洪健. 靶向PKM2可通过巨噬细胞和肝脏特异性机制改善NASH纤维化[J]. 工程（英文）, 2024, 41(10): 198-213 DOI:10.1016/j.eng.2024.05.005

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1 引言

随着饮食和生活方式的急剧变化，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）已成为最常见的慢性肝病之一，影响全球超过四分之一的成年人群[1‒2]。大约30%的NAFLD患者进展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH），并可进一步发展为肝纤维化甚至是肝细胞癌（HCC）[3]。肝纤维化严重程度是NASH患者肝脏相关不良预后的最强组织学预测因素[4‒5]。肝纤维化的特征表现为肝星状细胞（HSC）的异常激活及细胞外基质的过度沉积。这一过程受到来自肝实质细胞和非实质细胞（NPC）的多重信号调控，包括肝细胞、肝窦细胞（LSEC）和巨噬细胞等[6‒8]。其中，巨噬细胞是肝脏炎症和肝纤维化进展的关键调节因子[9]。目前，直接调控HSC活化的临床抗纤维化疗法有限。因此，探索HSC与其他细胞之间的促纤维化串扰，对于NASH相关肝纤维化的治疗具有重要的科学意义。

丙酮酸激酶（PK）通过将磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸来催化糖酵解的最后一步，其家族包含PKL、PKR、PKM1和PKM2四种同工酶[10]。与其他亚型不同，PKM2具有二聚体和四聚体等多种构型，可调控代谢从氧化磷酸化向有氧糖酵解转变。此外，PKM2二聚体可入核作为转录辅激活因子调节基因表达[11]。归因于PKM2的这些特性，其参与调控多种免疫细胞的代谢重编程及激活后增强有氧糖酵解[12]。PKM2在多种炎症性疾病中发挥重要作用。髓系PKM2缺失可抑制糖酵解和循环巨噬细胞的炎症反应，从而减少动脉粥样硬化的发生[13]。巨噬细胞PKM2敲除通过抑制促炎因子的分泌，保护小鼠免受致死性内毒素血症和脓毒症的侵害[14]。越来越多的证据表明，PKM2促进炎性肝病的进展[15‒17]。脂肪肝中PKM2表达上调，特异性敲除PKM2可逆转辅助性T细胞17（Th17）介导的肝损伤和NAFLD严重程度[18]。多项研究表明靶向PKM2可通过调控巨噬细胞极化改善NASH [19‒21]。PKM2的核转位促进NASH中巨噬细胞M1极化[22]。我们前期报道过PKM2对HSC的活化和增殖起着关键作用[23]。然而，关于PKM2在NASH相关纤维化中的作用尚不明确，PKM2是否可作为NASH纤维化的治疗靶点有待进一步探讨。

异源双链寡核苷酸（HDO）由反义寡核苷酸（ASO）及其互补RNA（cRNA）组成，通过Watson-Crick碱基配对结合特异性RNA靶序列发挥强大的治疗作用。HDO可用于调控基因表达，是一种有效的靶向策略[24]。对磷酸骨架、核糖及碱基的特异性化学修饰，可有效增强HDO的体内递送效率并优化其药理特性。基于肝脏独特的脂质代谢特性，胆固醇偶联的HDO（Cho-HDO）能够实现肝脏特异性蓄积，增强其在肝脏特异性基因编辑中的应用[24‒25]。

本研究发现，PKM2在NASH相关纤维化患者肝脏的NPC（尤其是巨噬细胞）中上调。为确定巨噬细胞PKM2在NASH相关纤维化中的作用，我们构建巨噬细胞PKM2敲除小鼠，并发现巨噬细胞PKM2缺失可显著减轻肝脏炎症并减缓NASH相关纤维化的进展。此外，本研究评估了Cho-HDO在NASH相关纤维化中的治疗潜力。Cho-HDO以剂量依赖性的方式降低了肝脏和巨噬细胞的PKM2表达，从减缓了NASH相关纤维化的进展。综上，本研究将PKM2确定为治疗NASH相关纤维化的潜在药理学靶点，Cho-HDO对PKM2的治疗性调节可作为对抗NASH相关纤维化的有效策略。

2 实验方法

2.1 人肝脏样本

从中国暨南大学第一附属医院获得诊断为NASH的患者（接受肝活检）和肝血管瘤的患者（阴性对照）的石蜡包埋人肝脏样本。对照组无病毒性肝炎、酗酒或其他肝病病史。在获得书面知情同意书并获得暨南大学附属第一医院机构伦理委员会伦理批准后采集人肝脏样本。

2.2 小鼠与处理

将小鼠饲养在特定的无病原体环境中，从早上7点开始进行12 h光照-黑暗循环，温度恒定在22~24 ℃。PKM2^FL/FL 和LysM-Cre小鼠购自Jackson Laboratory（美国），C57BL/6小鼠购自广州锐格生物科技有限公司。通过将PKM2^FL/FL 小鼠与LysM-Cre小鼠（C57BL/6背景）杂交产生巨噬细胞PKM2特异性基因敲除的（PKM2^ΔMAC ）小鼠。

以下引物用于基因分型（5′-3′）：CCTTCAGGAAGACAGCCAAG和AGTGCTGCCTGGAATCCTCT用于PKM2^FL/FL；CCCAGAAATGCCAGATTACG、CTTGGGCTGCCA-GAATTTCTC和TTACAGTCGGCCAGGCTGAC用于LysM-Cre。

为了诱导NASH和轻度纤维化表型，将6~8周龄雄性PKM2^ΔMAC 和PKM2^FL/FL 小鼠（每组n = 6~8只）随机分配到蛋氨酸和胆碱缺乏（MCD）饲养组（A02082002BR；Research Diets, Inc.，美国）饲养4周或8周[26‒27]。

为了诱导NASH伴晚期纤维化，将6~8周龄雄性PKM2^ΔMAC 和PKM2^FL/FL 小鼠（每组n = 6~8只）随机分配至正常饲养或高脂高胆固醇（HFHC）饲养小组（根据热量摄入，含42%脂肪、42.7%碳水化合物和15.2%的蛋白质，外加2%的胆固醇）（北京科澳协力饲料有限公司）如前所述[28]饲养16周。

为了诱导更严重的NASH伴晚期纤维化和HCC，喂食9周龄雄性PKM2^ΔMAC 和PKM2^FL/FL 小鼠（每组n = 6~8只）西式饮食（按重量计含21.1%脂肪、41%蔗糖和1.25%胆固醇）以及含23.1 g∙L^-1 D-果糖和18.9 g∙L^-1 D-葡萄糖的高糖水溶液（北京索莱宝科技有限公司）12周或24周。如前所述[29]，该饮食方案与每周一次四氯化碳[CCl₄；0.2 μL∙g^-1体重（BW）；天津市富宇精细化工有限公司]腹膜内给药同时开始。对于NASH-HCC组，小鼠在接受22周的西式饮食和每周四氯化碳注射（WD/CCl₄）后，接受了超声分析（VINNO 6 Lab）以检测HCC。

对于ML265（PKM2激活剂；MedChemExpress，美国）治疗，在HFHC饮食喂养10周或MCD饮食喂养6周后，分别给6~8周龄的雄性C57BL/6小鼠（每组6~10只）服用ML265（连续30 mg∙kg^-1∙d^-1；i.p.）或对照[10%的二甲亚砜（DMSO）+ 90%的20%磺丁基醚-β-环糊精（SBE-β-CD）盐水溶液]。

使用每天称重的架子，在常规笼子中测量喂食HFHC的小鼠一周内的摄食量，并在所示时间内以每天千卡数计算每周的食物摄入量。实验结束时，小鼠禁食，采集血清和组织方法如前所述[30]。切除肝脏并立即称重。所有动物程序均按照暨南大学《实验动物护理和使用指南》进行，并获得暨南大学动物伦理委员会批准（动物伦理许可证编号为20230419-04）。为避免雌激素和月经周期的干扰，本研究仅使用雄性动物。

2.3 组织学、免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）

用苏木精-伊红（H&E）和天狼星红（26357-02；海德创业（北京）生物科技有限公司]对福尔马林固定的、石蜡包埋的肝组织样品（4 μm）进行染色[31‒32]。对于油红O染色，将冷冻肝脏切片（10 μm）用60%异丙醇冲洗，然后用油红O溶液（西格玛奥德里奇，美国）染色，如前所述[33]。所有明场图像均使用奥林巴斯BX51荧光显微镜拍摄。对于IF染色，将福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片或用冷甲醇固定的细胞与指定的一抗共同染色，并根据生产商说明用Alexa 488或Alexa 555标记的适当二抗（美国赛默飞世尔科技公司）进一步检测。细胞核用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，赛默飞世尔科技公司）标记。用蔡司LSM 880共聚焦激光扫描显微镜（德国）拍摄IF图像。如前所述[34]，通过Image J对天狼星红、IHC、油红O和IF染色进行定量分析。本研究中使用的一抗见附录A中的表S1。

2.4 组织学检查

采用双盲法，由两名经验丰富的肝脏病理学家独立评估H&E染色的肝组织切片。对每例肝组织标本进行非酒精性脂肪性肝病活动度评分（NAS），NAS大于或等于5判定为NASH。

2.5 HDOs

靶向作用PKM2的Cho-HDO由擎科生物科技有限公司完成合成，复合物包含ASO及其cRNA，具体序列信息详见附录A表S2。花青素5（Cy5）与ASO的5′端共价结合，而胆固醇与cRNA链的5′端相结合。Cho-HDO的制备过程如下：将等摩尔浓度的ASO和cRNA链溶解并混合在的适当溶剂中[体外研究使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）；体内研究使用生理盐水]，充分混合后，经95 °C变性5 min，随后梯度降温至37 °C，退火时间持续1 h。对于体内研究，在MCD饮食喂养四周后，通过尾静脉注射单剂量1 mg∙kg^-1和10 mg∙kg^-1的Cho-HDO，并在四周后评估治疗和基因敲低效果。对最佳切割温度（OCT）复合物包埋的冷冻肝脏切片进行IF染色，分离原代肝细胞进行流式细胞术和定量聚合酶链反应（qPCR）分析。

2.6 生化分析

使用自动化学分析仪（雷杜生命科学股份有限公司）测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）的水平。根据生产商的说明，使用市售试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]检测肝甘油三酯（TG）水平。

2.7 小鼠原代细胞分离、细胞培养和处理

如前所述[35]，用10 ng∙mL^-1巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF; 315-02；派普泰克，美国）在含10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养小鼠骨髓7天，诱导骨髓源性巨噬细胞（BMDM）分化。采用脂多糖（LPS; 10 ng∙mL^-1；西格玛奥德里奇）和干扰素-γ（IFN-γ; 25 ng∙mL^-1；派普泰克）刺激 BMDM 16 h，以诱导巨噬细胞促炎表型[35]。加入2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG，糖酵解抑制剂；S4701；Selleck化学，美国）、乳酸盐（糖酵解的副产物；L8601；北京索莱宝科技有限公司），imoxin、C16（咪唑氧吲哚PKR抑制剂；HY-13977A；麦克默克斯）、ML265（HY-18657; MedChemExpress）或MCC950（NLRP3抑制剂；HY-12815A; MedChemExpress），在LPS诱导前对细胞进行预处理，如前所述[14,17,36]。

根据先前描述的方法[31]分离小鼠原代HSC，简言之，用乙二醇四乙酸（EGTA）溶液、胶原酶D（罗氏，瑞士）溶液和链霉蛋白酶（西格玛奥德里奇）溶液连续灌注进行肝脏原位消化。分离肝脏，切碎并使用含有胶原酶D、蛋白酶和脱氧核糖核酸酶（DNase；罗氏）的缓冲液进一步离体消化。最后，经70 μm细胞筛过滤后通过密度梯度离心分离细胞。

BMDM-HSC共培养系统的建立：用1 ng∙mL^-1转化生长因子-β（TGF-β）预处理HSC，诱导基础活化状态[6]。分别用靶向作用PKM2的短发夹RNA（shPKM2）或阴性对照（shScramble）转染的BMDM条件培养基刺激HSC（分离后第5天），在含或不含10 μmol·L^-1 MCC950的条件下培养。含有shPKM2的慢病毒颗粒购自吉凯基因。相关序列如表S2所示。

永生化人髓系白血病单核细胞（THP-1）细胞系购自武汉普诺赛生命科技有限公司，并在添加了10% FBS和1%青霉素-链霉素的Roswell Park Memorial Institute（RPMI）-1640培养基（Gibco，美国）中培养。永生化人HSC LX-2细胞系购自中国科学院建立的细胞库，并在添加了10% FBS的DMEM中培养。两种细胞系均通过多态性短串联重复序列（STR）识别，并进行了常规检测以排除支原体污染。THP-1细胞经20 ng∙mL^-1佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA; AbMole BioScience，美国）刺激48 h分化为巨噬细胞，并用于随后的实验。

对于涉及THP-1和LX-2细胞的共培养系统，用LPS刺激的THP-1巨噬细胞的条件培养基（CM）刺激LX-2细胞，用ML265和MCC950预处理或不预处理，然后评估LX-2细胞的活化状态。

2.8 qPCR

使用TRIzol试剂（Invitrogen，美国）从指定的肝组织或细胞中提取总RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度计测定总RNA浓度。根据生产商的说明，使用PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒（宝生物工程，日本）合成互补DNA（cDNA）。使用PowerUp SYBR Green Master Mix（赛默飞世尔科技公司）进行实时定量PCR（qRT-PCR）。扩增条件：94 ℃下3 min；95 ℃下20 s 40个循环，60 ℃下40 s，72 ℃下20 s；72 ℃下延长5 min。将靶信使RNA（mRNA）水平归一化为β-肌动蛋白管家基因水平，该基因被用作内源性对照。本文中使用的PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。所用引物的序列列于表S2中。

2.9 蛋白质印迹分析

用添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰冷放射免疫沉淀法（RIPA）裂解缓冲液（P0013B；碧云天生物技术）裂解肝组织和细胞，并将裂解物在14000 r∙min^-1下离心15 min。使用二辛可宁酸（BCA）试剂盒（23225；赛默飞世尔科技公司）测量蛋白质浓度，并使用4×十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）加载缓冲液制备蛋白样品。将等量的蛋白质加载到10% SDS-PAGE凝胶上，并将分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（3010040001；罗氏）。用含吐温20的tris缓冲盐水（TBST）的5%脱脂乳封闭膜，并与指定的一抗在4 ℃下孵育过夜。然后洗涤膜，并用辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗在室温下孵育1 h。最后，使用增强化学发光（ECL）试剂盒（170-5061；伯乐生命医学，美国）检测条带，并用ChemiDoc MP成像系统（伯乐生命医学）定量。用于蛋白质印迹分析的抗体见表S1。

2.10 肝NPC的分离和单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析

如前所述[37]，将喂食MCD饲料8周的PKM2^ΔMAC 和PKM2^FL/FL 小鼠的肝脏NPC分离出来，然后进行scRNA-seq。将细胞悬液加载至含有3′化学成分（v2或v3，取决于项目）的铬微流控芯片中，并使用10X铬控制器（10X Genomics，美国）进行条形码编码。随后对条形码细胞的RNA进行逆转录，并使用铬单细胞3′试剂盒（v2或v3，取决于项目；10X Genomics）中的试剂构建测序文库。根据生产商说明（因美纳，美国），使用Illumina HiSeq 2000或NovaSeq（取决于项目）进行测序。数据分析如前所述[38‒39]。

2.11 荧光激活细胞分选（FACS）分析

取MCD饲料喂养8周的PKM2^ΔMAC 和PKM2^FL/FL 小鼠，以及Cho-HDO干预组小鼠，采用上述方法分离肝脏NPC，用于后续流式细胞术分析。染色前，将细胞与分化簇16（CD16）/CD32 Fc块一起孵育。使用荧光素异硫氰酸酯（FITC）偶联的抗小鼠CD45（553079；BD生物科学，美国）、藻红蛋白（PE）偶联抗氰化物7偶联的抗小鼠CD45（103114；BioLegend公司，美国）、PE偶联的抗小鼠F4/80（565410；BD生物科学）、Alexa Fluor 647偶联大鼠抗小鼠F4/80（565854；BD生物科学）、FITC偶联的抗小鼠CD11b（557396；BD生物科学）和PE偶联的抗小鼠Ly-6C（128007；BioLegend公司）的组合来揭示巨噬细胞PKM2缺失对Ly6C^high巨噬细胞浸润和Cho-HDO体内递送效率的影响。

2.12 RNA测序和分析

对来自PKM2^ΔMAC 和PKM2^FL/FL 小鼠的LPS/IFN-γ刺激的BMDM进行RNA测序分析（每组n = 3）。用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA。根据生产商说明，使用NEBNext^® Ultra^TM RNA Library Prep Kit for Illumina^®（NEB，美国）为每个混合的RNA样品构建cDNA文库。根据京都基因和基因组数据库（KEGG）分析了差异表达基因（DEG）的重要途径。

2.13 细胞外酸化率（ECAR）监测

使用Seahorse XFe96细胞外通量分析仪（安捷伦科技，美国）实时记录ECAR。简言之，将从PKM2^ΔMAC 和PKM2^FL/FL 小鼠中提取的BMDM接种在Seahorse XF-96微孔板（4 × 10⁵个细胞∙孔^-1）中，用/不用LPS/IFN-γ处理16 h。分析前，将细胞转移到ECAR培养基在37 °C下培养1 h。基线测量后，如前所述[17]，在指定的时间点依次加入10 mmol∙L^-1葡萄糖、1 μmol∙L^-1寡霉素和50 mmol∙L^-1 2-DG。

2.14 酶联免疫吸附试验（ELISA）

使用指定的ELISA试剂盒，根据制造商的说明，检测小鼠肝脏细胞因子水平[包括单核细胞趋化因子蛋白1（MCP1；生工生物工程）和I型胶原α1（COL1A1；科鹿生物科技）]，以及人和小鼠细胞释放的细胞因子的浓度[包括白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-18、高迁移率组盒1（HMGB1；生工生物工程）、金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP1；武汉圣洛捷生物技术）和COL1A1]。使用乳酸测定试剂盒（BioVision，美国），根据制造商的说明，测定细胞外乳酸水平。

2.15 统计分析

数据表示为平均值±标准差（SD）。使用GraphPad Prism 9.0进行统计分析。使用双尾Student t检验或单因素方差分析（ANOVA）对所有数据进行分析。P ≤ 0.05表明存在显著差异。

3 实验结果

3.1 纤维化NASH患者肝脏NPC中PKM2上调

为探究PKM2在NASH相关纤维化中的作用，对GSE135251数据集（含206例NAFLD/NASH患者及10例对照）进行生物信息学分析，结果发现编码PKM1和PKM2的PKM mRNA水平在NASH患者肝组织中显著升高，并与NAS评分和纤维化严重程度呈正相关[图1（a）]。蛋白质印迹和IHC结果表明，PKM2（而非PKM1）在患者和小鼠NASH纤维化肝组织中显著上调[图1（b）、附录A中的图S1]。IHC分析表明，PKM2主要在NPC中上调，肝细胞中未见PKM2表达显著变化。结合scRNA-seq公共数据库[37,40]与IF染色分析进一步证实，在NASH相关纤维化进展期间，PKM2主要在巨噬细胞中高表达[图1（c）和（d），附录A中的图S2]。为明确巨噬细胞PKM2在NASH相关纤维化中的作用，我们构建了MCD饮食诱导的小鼠NASH模型，评估巨噬细胞PKM2、CD11b（免疫浸润）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，HSC活化）的表达。随着纤维化进展，PKM2阳性巨噬细胞的占比增加，伴随CD11b和α-SMA水平升高，提示巨噬细胞PKM2在肝脏炎症和NASH相关纤维化进展中发挥重要作用[图1（e）]。上述数据表明，巨噬细胞PKM2驱动NASH相关纤维化的进展。

3.2 巨噬细胞PKM2敲除改善MCD饮食诱导的NASH小鼠脂肪性肝炎和纤维化进展

为阐明巨噬细胞PKM2在NASH相关纤维进程中的作用，通过PKM2^FL/FL 小鼠与LysM-Cre小鼠杂交，培育了髓系特异性PKM2敲除小鼠（PKM2^ΔMAC ）[图2（a）]。巨噬细胞中PKM2的敲除效率得到了验证[图2（b）、附录A中的图S3（a）~（c）]。使用三种不同方式诱导的小鼠NASH模型评估巨噬细胞PKM2敲除对NASH相关纤维化的影响[附录A中的图S3（d）]。

MCD饮食诱导的小鼠NASH模型可模拟人类NASH的病理特征，包括肝细胞气球样变、Mallory-Denk体形成和炎症浸润等[38]。分别给予PKM2^ΔMAC 和野生型（PKM2^FL/FL ）小鼠MCD饮食饲养4周[图2（c）]，来验证巨噬细胞PKM2缺失是否可预防脂肪性肝炎。结果发现，与对照小鼠相比，PKM2^ΔMAC 小鼠的肝重（LW）和肝重/体重比（LW/BW）显著降低[图2（d）]，血清ALT与AST水平明显改善[图2（e）]，肝组织病理学评分、巨噬细胞浸润和促炎基因表达（Tnfa、Il1b、Il6、Cxcl10和Mcp1）均显著降低[图2（f）和（g）]。巨噬细胞已被公认具有调节肝细胞脂质生成的作用[33]。此外，本文进一步探究了巨噬细胞PKM2敲除是否影响肝脏脂肪变性和脂质蓄积。油红O染色、肝脏TG含量测定与脂肪生成相关基因（Pparg、Srebp-1c、ChREBP和Fasn）和脂肪酸降解相关基因（Ppara、Acadl、Acox和Cpt1a）表达分析提示，巨噬细胞PKM2缺乏可有效改善肝脏脂肪变性和脂肪生成（附录A中的图S4）。这些结果表明，巨噬细胞PKM2缺失可改善NASH进展。

为了诱导NASH相关纤维化，将MCD饮食干预从4周延长至8周。结果显示，PKM2^ΔMAC 小鼠的NASH及其相关纤维化严重程度改善，表现为NAS评分降低、胶原沉积和HSC激活减少[图2（h）]。此外，PKM2^ΔMAC 小鼠中炎症（Tnfa、Il1b、Il6、Cxcl10和Mcp1）和纤维化（Tgfb1、Acta2、Col1a1和Timp1）相关基因表达水平显著低于对照小鼠[图2（i）]。促炎（MCP1）和促纤维化（COL1A1）因子水平降低，进一步证实了巨噬细胞PKM2缺失对NASH相关纤维化的保护作用[图2（j）]。上述数据表明，巨噬细胞PKM2敲除可显著改善MCD饮食诱导的小鼠NASH及其相关纤维化。

3.3 巨噬细胞PKM2敲除保护小鼠免受HFHC饮食诱导的NASH纤维化

上述结果表明，巨噬细胞PKM2敲除可显著改善MCD饮食诱导的早期NASH相关纤维化。为了进一步分析巨噬细胞PKM2在晚期NASH纤维化中的作用，用HFHC饮食诱导PKM2^ΔMAC 和PKM2^FL/FL 小鼠[图3（a）]。该模型能更准确地模拟人类NASH进行性纤维化的组织学特征[41]。

巨噬细胞PKM2缺失显著抑制了HFHC饮食诱导的BW、LW和LW/BW的增加，而对摄食量无明显影响[图3（b）、附录A中的图S5（a）~（d）]。PKM2^ΔMAC 小鼠的血清ALT和AST以及肝脏TG水平较对照组均显著降低[图3（c）、附录A中的图S5（e）]。此外，巨噬细胞中PKM2缺失可明显改善脂肪性肝炎与肝纤维化程度，并抑制HSC激活[图3（d）]。与MCD饮食诱导的小鼠NASH模型结果一致，喂食HFHC饲料的PKM2^ΔMAC 小鼠肝脏炎症和纤维化相关基因表达及因子水平显著低于对照组小鼠[附录A中的图S5（f）和（g）]。上述数据表明，巨噬细胞PKM2敲除可改善HFHC饮食诱导的晚期NASH纤维化。

3.4 巨噬细胞PKM2缺失减轻WD/CCl4诱导的NASH纤维化和继发HCC

多数NASH纤维化患者最终进展为肝硬化（肝纤维化末期）甚至肝细胞癌[42]。为进一步探索巨噬细胞PKM2在NASH-HCC转变中的功能，采用WD联合CCl₄诱导的小鼠NASH模型该模型在第12周诱导晚期纤维化（F3），在第24周诱导HCC形成[29]，如图3（e）所示。

与对照小鼠相比，WD/CCl₄诱导12周后PKM2^ΔMAC 小鼠的LW、LW/BW、血清ALT水平和血清AST水平显著降低[图3（f）和（g）；附录A中的图S6（a）和（b）]，脂肪性肝炎、纤维化沉积和HSC激活显著改善[图3（h）]。此外，PKM2^ΔMAC 小鼠的炎症和纤维化相关基因表达和因子水平降低[附录A中的图S6（c）和（d）]。上述数据提示巨噬细胞PKM2敲除可有效逆转WD/CCl₄诱导的NASH相关纤维化进展。

接下来，评估巨噬细胞PKM2敲除对WD/CCl₄诱导的NASH-HCC的影响。所有小鼠在24周时出现肿瘤，表现出脂肪肝HCC的特征。与对照小鼠相比，PKM2^ΔMAC 小鼠的肿瘤负荷显著降低，尤其是较大肿瘤（直径> 4 mm）的数量明显减少，表面PKM2缺失抑制了与NASH纤维化/肝硬化相关的肿瘤发生和进展[P < 0.001；图3（i）]。此外，PKM2^ΔMAC 小鼠的Ki67阳性细胞（肿瘤区域内）数量低于对照小鼠，提示肿瘤增殖活性受抑制[图3（j）、附录A中的图S6（e）]。已有研究证明Trem2⁺ NASH相关巨噬细胞（NAM）在NASH-HCC发生期间可诱导CD8⁺ T细胞耗竭和免疫抑制微环境[39]。本研究表明，PKM2^ΔMAC 小鼠中的Trem2⁺ NAM（F4/80⁺Gpnmb⁺）比例显著降低，伴随耗竭的PD1⁺CD8⁺ T细胞恢复[附录A中的图S6（f）]。上述结果表明巨噬细胞PKM2敲除可逆转NASH-HCC肿瘤微环境形成。综上所述，巨噬细胞PKM2缺乏可缓解晚期NASH纤维化的进展，并部分逆转后续的HCC形成和发展。

3.5 巨噬细胞PKM2缺失通过调控Ly6C^high巨噬细胞数量抑制NASH纤维化进程

由于PKM2^ΔMAC 小鼠表现出肝脏炎症和NASH纤维化严重程度降低，本节旨在确定PKM2是否通过调节巨噬细胞活化进而促进NASH纤维化。对MCD诱导的PKM2^ΔMAC 和PKM2^FL/FL 小鼠的肝脏NPC进行scRNA-seq分析[图4（a）]。聚类分析将肝脏NPC分为11个簇[图4（b）]，NPC的均匀流形近似和投影分析显示，PKM2^ΔMAC 小鼠中浸润的单核细胞源性巨噬细胞（MDM）的占比显著降低[图4（c）]。IF染色证实，PKM2^ΔMAC 小鼠的MDM（CLEC4F^-IBA1⁺）数量明显减少，而驻留库普弗细胞（KC; CLEC4F⁺IBA1⁺）的数量无明显变化[附录A中的图S7（a）]。这些结果表明巨噬细胞PKM2介导的促炎反应主要依赖于MDM。

进一步分析受巨噬细胞PKM2缺失显著影响的MDM亚群。MP0巨噬细胞被定义为促纤维化Ly6C^high巨噬细胞（Ly6c2、Chil3、F13a1和Fn1）[39]。巨噬细胞PKM2敲除有效地降低了Ly6C^high MDM（MP0）的数量占比，导致HSC活化相关标志物（Timp1和Tgfb1）表达下调[图4（d）和（e）]。流式细胞术分析进一步证实，MCD饮食的PKM2^ΔMAC 小鼠中，Ly6C^high巨噬细胞（CD11b⁺F4/80⁺-Ly6C^high）数量显著减少[图4（f）]，表明PKM2通过诱导Ly6C^high MDM促进NASH纤维化进展。与对照组小鼠相比，PKM2^ΔMAC 小鼠的中性粒细胞（Ly6G⁺）的浸润和对信号转导子和转录激活子1（STAT1；M1巨噬细胞标志物）磷酸化减少，但STAT6（M2巨噬细胞标志物）磷酸化增加，这可能是由于巨噬细胞PKM2缺乏引起的肝脏炎症减弱[附录A中的图S7（b）和（c）]。综上，PKM2介导的NASH纤维化进展与促纤维化Ly6C^high巨噬细胞相关。

3.6 PKM2依赖性糖酵解调控巨噬细胞促炎反应和NLRP3活化

进一步探究PKM2调控巨噬细胞活化的分子机制。糖酵解过程增强是巨噬细胞促炎反应的先决条件[43]。在本研究中，PKM2^ΔMAC BMDM在促炎激活（用LPS和IFN-γ刺激）期间表现出显著的糖酵解抑制作用，具体表现为ECAR和乳酸释放的减少[附录A中的图S8（a）和（b）]。蛋白质印迹分析证实了巨噬细胞中的PKM2缺失下调了糖酵解相关蛋白的表达[附录A中的图S8（c）]。此外，添加糖酵解抑制剂2-DG后，PKM2缺失对巨噬细胞计划标志物的调控作用（M1标志物Tnfa、Il1b和Il6，M2标志物Il10）消失，表明PKM2介导的巨噬细胞促炎激活具有糖酵解依赖性[附录A中的图S8（d）]。通过ML265（也称为TEPP-46）限制PKM2的核转位抑制了巨噬细胞活化，证实了PKM2核转位是巨噬细胞代谢重编程和促炎活化的关键[36]，如附录A中的图S8（e）所示。上述结果表明，PKM2通过调控糖酵解促进巨噬细胞向促炎表型转变。

为了更好地阐述PKM2在巨噬细胞促炎激活中的调控机制，提取PKM2^ΔMAC 和PKM2^FL/FL 小鼠的BMDM（用LPS和IFN-γ刺激）进行RNA测序（RNA-seq）[图5（a）]。结果显示，巨噬细胞PKM2敲除显著抑制了巨噬细胞的促炎相关基因表达，并特异性下调Nlrp3、Il1b和Tgfb1等促纤维化基因[图5（b）~（d）]。

进一步研究PKM2是否通过NLRP3信号传导促进NASH纤维化。蛋白质印迹分析证实，巨噬细胞PKM2敲除可抑制MCD诱导的小鼠NLRP3活化[图5（e）]。蛋白激酶R（PKR）已被证明可以调节NLRP3的活化[14]。PKM2的缺失抑制了体内和体外PKR磷酸化和NLRP3活化[图5（f）]。为确定PKM2介导的糖酵解是否参与NLRP3活化，在用乳酸盐刺激LPS处理的BMDM中测量p-PKR和NLRP3的表达。与先前的研究[14,44]一致，本研究表明，在LPS刺激的巨噬细胞中，添加乳酸盐显著诱导PKR磷酸化和NLRP3活化[图5（g）]。此外，ML265和C16逆转了乳酸诱导的NLRP3活化和下游细胞因子的分泌，这表明PKM2介导的糖酵解以PKR依赖性方式促进NLRP3活化[图5（h）和（i）]。此外，PKM2的缺失显著抑制了BMDM分泌IL-1β、IL-18和HMGB1，MCC950消除了这种抑制作用[图5（j）]。这些结果表明，PKM2依赖性糖酵解促进巨噬细胞中的NLRP3活化，导致促炎和促纤维化细胞因子的分泌[图5（k）]。

3.7 巨噬细胞PKM2通过NLRP3信号传导诱导HSC活化

HSC活化是肝纤维化进展的关键环节。为评估巨噬细胞PKM2是否通过NLRP3信号传导直接调节HSC活化，建立体外共培养系统：收集短发夹RNA（shRNA）转染后的BMDM（用或不用MCC950处理）CM与小鼠原代HSC共培养（第5天）[图6（a）、附录A中的图S8（f）]。LPS/IFN-γ刺激的shScramble转染BMDM CM可促进HSC活化，而在BMDM中敲低PKM2基因可逆转这一效应[图6（b）和（c）]。此外，如qPCR和ELISA分析所示，添加MCC950消除了巨噬细胞中PKM2基因敲低引起的差异[图6（b）和（d）]。

建立人巨噬细胞（THP-1）与人HSC（LX-2）共培养系统，以验证NLRP3介导的促纤维化串扰[图6（e）]。ML265有效阻断了促炎巨噬细胞中的PKM2核转位，从而抑制了PKM2的促HSC活化作用[图6（f）~（h）]。与小鼠原代细胞实验结果相似，NLRP3抑制消除了ML265引起的THP-1和LX-2之间的促纤维化串扰差异[图6（f）和（h）]。综上，上述结果表明巨噬细胞PKM2通过激活NLRP3信号传导，促进HSC活化[图6（i）]。

3.8 靶向作用PKM2可改善小鼠NASH及其相关纤维化

我们前期已报道，在CCl₄诱导的小鼠肝纤维化中，PKM2激活剂的抗纤维化疗效优于PKM2抑制剂[23]。在本文中，我们评估了ML265对MCD和HFHC诱导的小鼠NASH相关纤维化的治疗效果。首先，我们评估了ML265对HFHC饲料诱导的NASH相关纤维化的影响[附录A中的图S9（a）]。ML265不影响正常饲养的小鼠的BW，但显著抑制了HFHC饮食诱导的LW、BW和LW/BW的增加[附录A中的图S9（b）~（d）]。与对照组小鼠相比，ML265处理后的小鼠的肝功能（血清ALT和AST）和脂质蓄积（肝脏TG）相关参数显著改善[附录A中的图S9（e）和（f）]。组织病理学分析显示，经ML265处理的HFHC饲养的小鼠脂肪性肝炎程度、胶原沉积及HSC活化均明显减轻[附录A中的图S9（g）]，ELISA结果显示炎症反应和肝纤维化标志物水平也显著下调[附录A中的图S9（h）]。ML265的效果在MCD饮食诱导的NASH模型中得到进一步证实[附录A中的图S10（a）]表现为LW/BW、肝功能（血清ALT和AST）、脂质蓄积（肝脏TG）和肝脏组织学的改善，且伴随炎症和纤维化的细胞因子水平降低（附录A中的图S10）。此外，IF染色表明，PKM2激活剂使巨噬细胞从促炎表型转变为抗炎表型[附录A中的图S11（a）和（b）]。蛋白质印迹分析进一步证实，ML265处理抑制了STAT1的磷酸化但增强了STAT6的磷酸化，这表明限制PKM2核转位可以抑制促炎性巨噬细胞活化，从而改善NASH相关纤维化[附录A中的图S11（c）]。综上，PKM2激活剂可通过逆转巨噬细胞和HSC之间的促纤维化串扰，有效缓解NASH相关纤维化的进展。

鉴于PKM2在NASH纤维化患者多种肝脏NPC（包括HSC、LSEC和T细胞）中均表达上调，全肝PKM2靶向清除可能改善NASH相关纤维化患者的预后。为验证这一假设，通过优先在肝脏中蓄积的Cho-HDO，消耗巨噬细胞和其他NPC中的PKM2 [图7（a）]。鉴于PKM2在HCC细胞和免疫细胞中显著上调[15]，我们首先在Hepa 1-6细胞和BMDM（分别代表肝实质细胞和NPC）中验证了Cho-HDO对PKM2的敲低效果。我们发现，Cho-HDO3对PKM2（而非PKM1）的表达表现出最佳的敲低效应，呈剂量依赖性[附录A中的图S12（a）和（b）]。

尾静脉注射后24 h，观察到体内Cy5信号显著蓄积[图7（b）]。为了确定Cho-HDO对NASH纤维化的治疗效果，将两个剂量的Cy5标记的Cho-HDO给予MCD饲养小鼠。流式细胞术分析显示，接受Cho-HDO给药的小鼠的NPC和肝巨噬细胞中Cy5显著蓄积[图7（c）]。值得注意的是，Cho-HDO以剂量依赖的方式降低肝脏PKM2表达和巨噬细胞PKM2表达[图7（d）、附录A中的图S12（c）]。重要的是，Cho-HDO以剂量依赖的方式改善NASH和NASH纤维化进展，表现为血清ALT水平、血清AST水平、肝脏TG含量、NAS、脂滴蓄积、胶原沉积、免疫细胞浸润、HSC激活、促炎介质水平和促纤维化介质水平降低[图7（e）~（g）；附录A中的图S12（d）和（e）]。此外，与既往研究[24]一致，Cho-HDO不会对肝脏、心脏或肾脏产生明显毒性（附录A中的图S13）。上述结果表明，Cho-HDOs可剂量依赖性地调控肝脏NPCs PKM2表达水平，改善NASH相关纤维化进展，有望成为对抗NASH相关纤维化的有效策略。

4 讨论

PKM2调节多种肝脏NPC（包括巨噬细胞、HSC [23]和T细胞[18]）的代谢重编程，并通过促进巨噬细胞M1极化参与NASH进展[22]。鉴于并非所有NASH患者都伴有显著纤维化[45]，因此PKM2是否促进NASH纤维化进展仍不清楚。本文提供了体内证据，表明PKM2通过调节巨噬细胞促炎活化而极大地促进NASH纤维化。此外，转基因小鼠中巨噬细胞PKM2的基因敲除或Cho-HDO对肝脏PKM2的抑制，减轻了NASH纤维化。

巨噬细胞PKM2敲除小鼠对饮食诱导的NASH相关纤维化具有明显抗性，伴随肝脏炎症减轻。该结果与既往研究一致，即PKM2与NASH的肝巨噬细胞极化有关[20,22]。本研究进一步证明，巨噬细胞中的PKM2缺失可减少Ly6C^high巨噬细胞的数量，Ly6C^high巨噬细胞是一种已被广泛认为可促进肝纤维化的巨噬细胞亚型[6,46]。关于PKM2在巨噬细胞活化中的调节作用，几项研究[36,47]已证明PKM2通过缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）调节巨噬细胞代谢重编程和促炎活化。当前结果表明，缺乏PKM2的巨噬细胞糖酵解水平下调，HIF-1α、己糖激酶2（HK2）和乳酸脱氢酶A（LDHA）的表达降低，证实PKM2通过调节糖酵解来调节巨噬细胞的表型偏移。此外，我们在PKM2^ΔMAC 小鼠的BMDM中观察到PKM1表达增强。鉴于PKM1和PKM2由Pkm基因编码，并且在转基因小鼠中Pkm基因的外显子10被特异性删除，因此PKM1表达的增加可能归因于PKM1前体mRNA的代偿性转录。此外，PKM1可诱导氧化磷酸化，可能进一步促进巨噬细胞向M2表型偏移。

作为炎性小体家族的成员，NLRP3是脂肪性肝炎和肝纤维化的关键调节因子[33,48]。NASH中NLRP3介导的促炎反应主要依赖于髓系细胞[49]。在小鼠脂肪性肝炎模型中，NLRP3过表达诱导慢性髓外骨髓生成和Ly6C^high巨噬细胞浸润[50]。本研究发现，巨噬细胞PKM2缺失显著抑制了NLRP3的活化，提示PKM2^ΔMAC 小鼠中Ly6C^high MDM的减少可能部分归因于巨噬细胞NLRP3信号的下调。NLRP3调节半胱天冬酶1活化以及IL-1β和IL-18的产生[14]，两者均为公认的促纤维化细胞因子[49,51]。本研究表明，巨噬细胞PKM2通过NLRP3信号传导促进HSC活化和NASH纤维化。

PKM2靶向药物主要分为抑制剂和激活剂。抑制剂抑制高活性PKM2四聚体的形成，而激活剂促进PKM2四聚体的形成，从而限制PKM2核转位。我们先前的研究[23]表明，PKM2激活剂和抑制剂均可有效改善CCl₄诱导的肝纤维化，并且PKM2激活剂表现出比PKM2抑制剂更好的抗纤维化疗效，表明PKM2核转位是调节HSC活化和纤维化的主要机制。此外，ML265（PKM2激活剂）已被证明可缓解早期脂肪性肝炎[52]。本研究中使用激活剂对抗NASH相关的纤维化，进一步验证了PKM2激活剂对NASH纤维化的治疗作用，表明PKM2核转位也可能是NASH纤维化进展的驱动因素。

近年来，PKM2靶向治疗已在基础研究和临床转化领域得到广泛研究。地高辛是一种强心苷，通过阻断PKM2介导的HIF-1α转录激活改善无菌性炎症[19]。一种新型PKM2激活剂TP-1454已进入I期临床试验，正在用于治疗包括HCC在内的实体肿瘤。除治疗性化合物外，PKM2的基因疗法在临床前研究中也显示出巨大的潜力。携带PKM2-小干扰RNA（siRNA）的纳米颗粒可有效抑制肿瘤糖酵解和三阴型乳腺癌的进展[53]。腺相关病毒（AAV）导向的PKM2敲除可有效改善癫痫患者的神经炎症和神经元丢失[54]。此外，通过ASO调控PKM剪接可将促癌的PKM2亚型转化为抗肿瘤的PKM1亚型，进而有效抑制需氧糖酵解和HCC进展[55]。本研究表明，靶向作用PKM2的Cho-HDO可作为抗NASH相关纤维化的有效策略。我们前期已报道，靶向作用TRAF相关NF-κB激活剂（TANK）结合激酶1（TBK1）的Cho-HDO可有效限制胆管癌的进展和转移[32]。与主要影响肝实质细胞的传统肝脏靶向基因治疗不同，Cho-HDO已被证明可有效调节胆管细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等多种非实质细胞的基因表达[56‒58]。本研究发现，Cho-HDO可特异性靶向作用NPC（包括巨噬细胞）并有效调控NASH小鼠肝脏中的基因表达，为肝脏NPC的靶向干预提供了新的技术平台。此外，在巨噬细胞中，高剂量Cho-HDO（10 mg∙kg^-1）表现出比巨噬细胞PKM2敲除更优的抗纤维化疗效，这可能与其同时作用于多种NPC（如HSC、中性粒细胞和T细胞）有关。

综上所述，本研究提出巨噬细胞PKM2通过代谢重编程刺激促纤维化的Ly6C^high巨噬细胞活化，进而促进肝脏炎症和NASH相关纤维化进展。采用巨噬细胞特异性或肝脏特异性靶向策略干预PKM2表达，可有效逆转NASH相关纤维化进程。此外，Cho-HDOs可为NASH和其他慢性肝病的基因靶向治疗提供有效的治疗平台。

5 结论

本研究在现有的体内和体外模型之外，为PKM2在NASH相关纤维化中的调控机制和治疗潜力提供了理论依据。本研究将有助于确立PKM2作为NASH相关纤维化的药物靶点，并强调Cho-HDO在NASH相关纤维化和其他肝脏疾病治疗中的应用价值。

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Received	Accepted	Published
2023-12-14	2024-05-05
Issue Date
2024-10-01

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