交流电驱动生物电极原位耦合还原与氧化过程高效矿化难降解污染物

远野; 张俊杰; 殷万欣; 张璐璐; 李林; 陈天明; 丁成; 刘文宗; 王爱杰; 陈帆

doi:10.1016/j.eng.2024.05.009

Engineering ›› 2024, Vol. 43 ›› Issue (12) : 125 -138. DOI: 10.1016/j.eng.2024.05.009

研究论文

交流电驱动生物电极原位耦合还原与氧化过程高效矿化难降解污染物

远野 ^a ,
张俊杰 ^a ,
殷万欣 ^a ,
张璐璐 ^a ,
李林 ^a ,
陈天明 ^a ,
丁成 ^a ,
刘文宗 ^c ,
王爱杰 ^a^,^c ,
陈帆 ^a^,^b

作者信息 +

In Situ Coupling of Reduction and Oxidation Processes with Alternating Current-Driven Bioelectrodes for Efficient Mineralization of Refractory Pollutants

Ye Yuan ^a^,^# ,
Junjie Zhang ^a^,^# ,
Wanxin Yin ^a ,
Lulu Zhang ^a ,
Lin Li ^a ,
Tianming Chen ^a ,
Cheng Ding ^a ,
Wenzong Liu ^c ,
Aijie Wang ^a^,^c^,^* ,
Fan Chen ^a^,^b^,^* ,

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摘要

有效去除废水中的芳香族化合物对生态环境保护至关重要。耦合阴极还原与阳极氧化的生物电化学过程是矿化芳香族化合物的一种有前景的方式。然而，传统直流生物电化学方法存在固有局限性。本文提出了一种低频低电压交流电（LFV-AC）驱动的生物电极，通过周期性原位耦合还原与氧化过程，实现芳香族化合物的生物矿化。以茜素黄R（AYR）的降解为例，受LFV-AC刺激的生物膜展示了高效的双向电子传递和氧化还原双重功能，显著提高了AYR的还原率（63.07% ± 1.91%）和中间产物的矿化率（98.63% ± 0.37%）。LFV-AC刺激促进了高效代谢AYR的微生物组形成，显著提升了擅长偶氮染料还原[如寡养单胞菌（Stenotrophomonas）和慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）]、芳香族中间体氧化[如鞘氨醇盒菌（Sphingopyxis）和鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）]以及电子传递[如地杆菌（Geobacter）和假单胞菌（Pseudomonas）]菌属的丰度。功能菌群显著富集了编码偶氮和硝基还原酶、邻苯二酚加氧酶和氧化还原介体蛋白的功能基因。本研究证实了LFV-AC刺激在促进偶氮染料生物矿化方面的高效性，为废水中难降解有机污染物的处理提供了一种新颖且可持续的方法。

Abstract

The effective elimination of aromatic compounds from wastewater is imperative for safeguarding the ecological environment. Bioelectrochemical processes that combine cathodic reduction and anodic oxidation represent a promising approach for the biomineralization of aromatic compounds. However, conventional direct current bioelectrochemical methods have intrinsic limitations. In this study, a low-frequency and low-voltage alternating current (LFV-AC)-driven bioelectrode offering periodic in situ coupling of reduction and oxidation processes was developed for the biomineralization of aromatic compounds, as exemplified by the degradation of alizarin yellow R (AYR). LFV-AC stimulated biofilm demonstrated efficient bidirectional electron transfer and oxidation-reduction bifunctionality, considerably boosting AYR reduction (63.07% ± 1.91%) and subsequent mineralization of intermediate products (98.63% ± 0.37%). LFV-AC stimulation facilitated the assembly of a collaborative microbiome dedicated to AYR metabolism, characterized by an increased abundance of functional consortia proficient in azo dye reduction (Stenotrophomonas and Bradyrhizobium), aromatic intermediate oxidation (Sphingopyxis and Sphingomonas), and electron transfer (Geobacter and Pseudomonas). The collaborative microbiome demonstrated a notable enrichment of functional genes encoding azo- and nitro-reductases, catechol oxygenases, and redox mediator proteins. These findings highlight the effectiveness of LFV-AC stimulation in boosting azo dye biomineralization, offering a novel and sustainable approach for the efficient removal of refractory organic pollutants from wastewater.

关键词

交流电 / 生物电极 / 氧化还原过程 / 生物矿化 / 电极微生物组 / 难降解有机污染物

Key words

Alternating current / Bioelectrode / Redox process / Bio-mineralization / Electrode microbiome / Refractory organic pollutants

Highlight

• A single bioelectrode achieved in-situ coupling of reduction and oxidation processes.

• Alternating current boosted azo dye initial reduction and subsequent mineralization.

• Bidirectional EET in electro-biofilms through cytochromes, pili, and redox mediators.

• A collaborative microbiome facilitated efficient bioelectro-metabolism of azo dyes.

• Multiple mechanisms of alternating current-driven bioelectrode were deciphered.

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远野,张俊杰,殷万欣,张璐璐,李林,陈天明,丁成,刘文宗,王爱杰,陈帆. 交流电驱动生物电极原位耦合还原与氧化过程高效矿化难降解污染物[J]. 工程（英文）, 2024, 43(12): 125-138 DOI:10.1016/j.eng.2024.05.009

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1 引言

芳香族化合物广泛应用于各种工业过程和产品中，尤其在工业废水中普遍存在[1]。它们进入自然生态系统后，会带来显著的环境风险，包括毒性、致癌性、持久性及生物累积性[2]。芳香族化合物通常具有稳定的芳香环结构和明确的π-共轭分子构型，使其在传统生物废水处理工艺中对直接氧化和降解具有强抗性[3]。因此，开发高效废水处理技术以有效去除芳香族化合物成为当务之急。

羟基化和环裂解是芳香族化合物生物降解的关键前提，而厌氧生物还原则是实现这些基本转化的优先方法[4]。近年来，以生物催化阴极为核心的生物电化学系统（BES）在降解包括偶氮染料、硝基苯和卤化有机化合物在内的芳香族化合物方面受到广泛关注[5‒6]。与传统厌氧生物还原工艺相比，生物阴极通过持续供应电子并为功能微生物提供有利的氧化还原条件，显著增强了芳香族化合物的还原效果。然而，生物阴极在实现还原产物完全矿化方面的能力仍有限，阻碍了其作为废水处理单元的独立应用潜力[7]。因此，生物电化学技术与厌氧还原-好氧氧化过程相结合，通过整合阴极还原与阳极氧化（CR-AO），可实现芳香族化合物的全面矿化[7]。已有研究表明，诸如无膜升流式生物催化电解反应器[8]、内置BES的混合厌氧生物反应器[9]和BES辅助升流式还原-氧化反应器[10]等集成型BES反应器，能够高效结合阴极还原与阳极氧化过程，并具有简化反应器结构、减少空间需求和提升污染物去除效率的优势。

目前，直流电（DC）是维持生物电化学CR-AO过程的主要驱动形式。然而，直流驱动存在诸多限制，影响其实际可扩展性。由于阴极与阳极生物膜的电子传递和成膜特性不同，这要求两者在培养条件上有所区分[10‒11]。此外，直流驱动需要高电流密度，可能导致电极损耗，并产生诸如·

O H

、O₃、H₂O₂、Cl₂和

S O 4 ·

^-等对微生物有害的副产物[12‒14]。更重要的是，阴极和阳极之间的距离优化对于有效的质量和电子传递至关重要[15]。相比之下，交流电（AC），尤其是低频低压正弦交流电（LFV-AC），已成为一种新型的BES驱动方法，能够在单个电极表面交替进行氧化和还原过程[16]。交流电驱动的极性反转可促进双向电子传递生物膜的形成[17]，显著增强微生物与电极间的细胞外电子传递（EET），并促进电活性微生物（EAB）的富集[18‒19]。双向EET生物膜具有在原位实现芳香族化合物还原与氧化的潜力。此外，LFV-AC可通过电流体动力极化增强电生物膜的代谢活性[13,20]。同时，由于整个循环过程中的净电荷为零，交流电可减少不良副产物的生成，并降低电极腐蚀[18,21]。因此，交流电驱动的电化学过程有望克服直流驱动的局限性，从而提升芳香族污染物矿化效率。目前尚无研究报道LFV-AC在生物电极上应用，以实现芳香族化合物周期性还原-氧化循环的矿化过程。此外，LFV-AC刺激对微生物群落组成、关键功能基因及其代谢特征、电子传递路径和电化学性能的影响仍不明确。

本研究开发了一种LFV-AC驱动的生物电极系统，原位耦合还原与氧化过程，用于高效矿化废水中的难降解污染物（如偶氮染料）。研究旨在揭示LFV-AC驱动的周期性还原与氧化过程对偶氮染料矿化效率的影响；采用电子平衡分析、循环伏安法和电化学阻抗等方法探讨电子传递能力与路径；并通过宏基因组测序分析功能微生物群落的组成、关键基因及代谢途径。研究结果为废水中难降解有机污染物的高效矿化提供了一种新颖且可行的解决方案。

2 材料与方法

2.1 LFV-AC驱动的生物电极的构建

LFV-AC驱动生物电极的示意图如附录A图S1所示，其电化学反应器的详细结构见附录A。基于双室反应器的基本框架构建了LFV-AC驱动生物电极。交流电由函数发生器（型号：SDG2000X；深圳鼎阳科技有限公司）提供，直流电由直流电源（型号：MS152D；东莞迈豪电子科技有限公司）维持。工作电极、对电极、参比电极及外部电阻（10 Ω）均与数据记录仪（Keithley 2700；美国吉时利有限公司）连接，每10 min记录电极电势及电阻两端的电压。密封铝箔袋（14 cm × 20 cm；盐城普瑞奇实验仪器有限公司）固定于工作室顶部，用于平衡室内气压。所有电位均基于饱和甘汞电极（SCE）。

2.2 LFV-AC驱动的生物电极的培养和操作

电极生物膜的接种使用了来源于浓缩活性污泥的种子污泥（盐城城东污水处理厂）。在接种前，通过筛网（0.2 mm）去除污泥中的无机颗粒，并使用纯氮气吹扫过夜以去除溶解氧。茜素黄R（AYR）被选为典型的芳香族化合物，它是一种广泛应用于印染工业的偶氮染料[22]。实验中，AYR的初始浓度设定为100 mg∙L^-1，与实际废水处理需求及相关研究数据一致[10]。在工作室中，制备了包含AYR（9 mg）、KCl（11.7 mg）、NH₄Cl（27.9 mg）、NaH₂PO₄·2H₂O（249.3 mg）、Na₂HPO₄·12H₂O（1039.5 mg）、Wolf维生素溶液（0.09 mL）和Wolf微量元素溶液（0.09 mL）的电解质溶液，体积为90 mL，使用1 mol∙L^-1 HCl或NaOH调节pH至7.0 ± 0.1。Wolf维生素和微量元素溶液的配方已在我们先前的研究中详细描述[10]。计数器室的电解质溶液包含K₃Fe(CN)₆（2962.8 mg）、K₄Fe(CN)₆（3314.7 mg）、NaH₂PO₄·2H₂O（249.3 mg）和Na₂HPO₄·12H₂O（1039.5 mg），同样为90 mL。在装填电解质溶液前，用氮气吹扫10 min以去除溶解氧。在还原阶段，K₄Fe(CN)₆中的Fe²⁺作为电子供体，为工作电极提供还原AYR所需的电子；而在氧化阶段，K₃Fe(CN)₆中的Fe³⁺作为电子受体，从工作电极接受电子以促进中间产物的矿化。

实验设定了四组BES，其参数和条件如图1（a）及附录A表S1所示。三组并联BES反应器施加正弦交流电（峰值电压，V _peak = 0.7 V和-0.7 V；频率为0.83 mHz，每10 min切换极性），另一组三组并联BES反应器施加方波交流电（电压为0.5 V和-0.5 V；频率为0.83 mHz，每10 min切换极性）。此外，分别有三组BES生物阴极和生物阳极反应器分别施加0.5 V的直流电进行刺激。正弦交流电的有效电压值（均方根电压，V _rms）为0.5 V（

V p e a k / 2

），与直流电0.5 V产生的功率相等[23]。直流电压的选择基于AYR还原和中间产物氧化的电势[22,24]。所有BES反应器均进行了平行操作，并采用一致的驯化步骤以保持种子污泥接种的一致性。初始阶段，在工作室中加入100 mL接种混合物（10 mL种子污泥和90 mL电解质溶液），使用磁力搅拌器（250 r∙min^-1）培育5天。随后，通过三次重复操作，用新鲜接种物替换电解质溶液以形成稳定的电极生物膜。在液体充分交换后，附着于电极表面的生物膜基本稳定。BES反应器逐渐适应相应的电压模式，每五天更换一次电解质溶液。通过观察数个间歇循环后，AYR和总有机碳（TOC）的去除率稳定，从而确认启动成功。为进一步探究LFV-AC对AYR降解的作用机制，设置了以下对照组：① 非生物DC刺激组：未接种生物膜，仅施加直流电；② 非生物AC刺激组：未接种生物膜，仅施加正弦交流电；③ 开路BES组：接种生物膜但未施加电压。所有反应器均在环境温度[(25 ± 2) ℃]下操作，并进行三次重复实验以保证结果的可靠性。

2.3 分析方法和计算

从所有反应器的工作室中收集水样，使用0.22 μm滤膜（上海星亚材料有限公司）进行过滤，并将样品稀释三倍后进行测定。AYR及其中间产物[对苯二胺（PPD）和5-氨基水杨酸（5-ASA）]的测量方法可参考我们之前的研究[10]。总有机碳浓度的测定采用TOC分析仪（MultiN/C2100；德国耶拿分析公司）。富集生物膜的电化学特性检测使用电化学工作站（CHI660D；辰华有限公司，软件版本V13.12），分别进行循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）测试。测试在三电极配置下进行，以饱和甘汞电极作为参比电极、工作电极和对电极。生物电极CV测试的电压范围为-0.8 ~ +0.6 V，扫描速率为1~10 mV∙s^-1，通过分析循环伏安图确定生物膜与电极间的主要电子转移机制[17]。EIS测试结果以Nyquist图形式呈现，并采用Randles等效电路进行分析，具体细节见附录A。

分别使用等式（1）~（4）计算AYR去除效率（

R E A Y R

，%）、中间产物积累率（

A R

，%），中间产物降解效率（

C A R

，%）和TOC去除效率（

R E T O C

，%）；使用方程式（5）中的表观一级反应模型拟合AYR和TOC去除动力学。

R E A Y R = C 0 - C t C 0 × 100 %

（1）

A R = C P P D + C 5 - A S A C 0 - C t × 100 %

（2）

C A R = 100 % - A R

（3）

R E T O C = C 0 - T O C - C t - T O C C 0 - T O C

（4）

C t X = C 0 X e - k t

（5）

式中，

t

表示反应时间（h或d）；

C 0

表示初始AYR浓度（mg∙L^-1）；

C t

代表在时间t（h）的AYR浓度（mg∙L^-1）；

C P P D

表示在时间t（h）的PPD浓度（mg∙L^-1）；

C 5 - A S A

表示在时间t（h）的5-ASA浓度（mg∙L^-1）；

C 0 - T O C

表示初始TOC浓度（mg∙L^-1）；

C t - T O C

表示在时间t（h）的TOC浓度（mg∙L^-1）；

C t X

表示在时间t（d）的AYR/TOC浓度（mg∙L^-1），

C 0 X

表示初始AYR/TOC浓度（mg∙L^-1）；

k

表示速率常数（d^-1）。所有数据和标准偏差均基于一式两份反应器的平均值获得。

使用等式（6）计算有效电流值（

I E V

，mA）[25]。

I E V = 1 T ∫ 0 T i t d t

（6）

式中，

T

是时间周期（h）；i(t)是时间

t

（h）处的输入电流；

d t

是时间微分。

电子利用效率（EUE，%）的计算见附录A。

2.4 微生物群落结构与功能分析

为研究正弦交流电、方波交流电、生物阴极和生物阳极条件下微生物群落的结构与功能，共采集了12个样品，来自3个生物复制反应器。在实验结束时采集样品，进行冷冻保存后开展宏基因组测序。DNA提取、PCR扩增、测序和分类学分析的具体步骤见附录A。通过非度量多维标度分析（NMDS）和基于Bray-Curtis距离的热图可视化（使用Lingbo MicroClassy工具，http://www.cloud.biomicroclass.com），探索和展示微生物群落组成的差异。宏基因组测序结果进一步揭示了微生物群落的结构特征、功能基因的相对丰度以及相关的代谢途径。标准化丰度以每百万转录物（TPM）表示。

3 结果与讨论

3.1 交流电驱动周期性还原-氧化过程的性能

3.1.1 AYR去除与中间产物矿化

经过七个批次的循环实验后，所有生物反应器在不同电刺激模式下均实现了AYR和TOC去除的稳定运行（附录A图S2）。如图1（b）所示，正弦和方波交流电刺激下的AYR去除效率分别达到63.07% ± 1.91%和56.89% ± 0.71%，显著高于生物阴极（53.13% ± 1.15%）和生物阳极（40.61% ± 0.15%）。这一结果表明，周期性还原-氧化过程较单一的还原或氧化过程更能高效去除AYR。这与先前的研究一致，表明还原与氧化过程的整合是实现AYR生物矿化的有效途径[7,10]。此外，正弦交流电刺激对AYR的去除效果优于方波，这与之前关于异养-全营养反硝化效率的研究结果一致[18]。正弦交流电的连续梯度电压变化比方波直接极性反转更能显著提升微生物的代谢活性[26]，从而增强了微生物与电极之间的EET效率。梯度电压的逐步变化使生物电极能够识别最佳电子供体与电子受体，从而促进更高效的微生物代谢。相较于生物阳极，生物阴极表现出更高的AYR去除效率，表明偶氮染料的阴极还原过程较阳极氧化更易实现[27‒28]。这是因为偶氮染料是一种缺电子的外源性物质，难以通过氧化降解[29]。而生物阴极通过向偶氮染料中的缺电子基团供给电子，有效促进了还原降解。在开路条件下，120 h内AYR去除效率仅为19.82% ± 0.35%，远低于电刺激条件下的效率。这一结果表明，电刺激能够显著增强微生物的降解能力。此外，在非生物直流或交流刺激条件下，120 h内AYR去除效率不足7%，明显低于BES模式下的去除效率，进一步强调了微生物催化在AYR去除中的关键作用，与之前研究一致[11,30]，即电活性生物膜从阴极捕获电子，用于难降解污染物的生物还原。考虑反应体积，持续时间和初始浓度，正弦交流电刺激下AYR的去除速率为(62.41 ± 1.81) mg∙L^-1∙d^-1，接近于添加500 mg∙L^-1乙酸钠作为共底物的直流刺激BES系统去除速率[(66.51 ± 0.12) mg∙L^-1∙d^-1] [31]。表1和图1（b）显示，在所有电模式下，AYR的去除与一级动力学模型拟合良好（0.930 ≤ R ² ≤ 0.988）。正弦交流电刺激的表观反应速率常数（k）是其他电模式的1.19~14.57倍，表明其在AYR去除中的显著优势。

AYR降解的关键中间产物（5-ASA和PPD）的累积受初始还原与随后的氧化反应速率差异影响。如图1（c）所示，在正弦和方波交流电刺激下，中间产物的累积率（120 h内）均低于10%，显著低于生物阳极（> 30%）和生物阴极（> 40%）的观察值。此外，正弦和方波交流电刺激条件下的TOC去除效率显著高于生物阴极与生物阳极，表明周期性还原与氧化的切换有效地促进了AYR的深度降解和矿化。尽管正弦与方波交流电刺激下的中间产物累积率相似，但正弦波组的AYR去除总量更高，表明其对初始底物与中间产物的降解能力更强。在LFV-AC刺激条件下，中间产物的矿化率达到98.63% ± 0.37%，高于先前报道的间歇电场刺激耦合过程（89.01% ± 1.32%）[10]。与传统方法需要额外碳源不同，LFV-AC生物电极无需额外碳源即可有效实现中间产物的还原与矿化。表1和图1（d）显示，所有电模式下的TOC去除均与一级动力学模型吻合良好（0.971 ≤ R ² ≤ 0.996）。正弦交流电刺激的k值是其他电模式的1.10~32.00倍，进一步表明其对中间产物降解的高效性。这归因于LFV-AC刺激下AYR的阴极还原（生成5-ASA和PPD）与氧化矿化（生成CO₂）的高效耦合[10,24]。

3.1.2 电流变化与电子利用效率

电流是评估电子传递能力的重要指标，用以分析正弦与方波交流电刺激的特性[图2（a）和（b）]。在两种刺激模式下，电流均呈现负值与正值之间的周期性交替，反映出还原与氧化过程之间的稳定切换。需要注意的是，交流电的有效电流值与等效直流电所产生的加热效应相同[25]。正弦交流电刺激的有效电流值（I _EVA = ± 1.05 mA）比方波交流电刺激（I _EVB = ± 0.77 mA）高出1.36倍。方波交流电的瞬时极性反转可能引发欧姆损失和离子传输障碍[32]，从而降低了电流幅度。电活性生物膜在高电流环境中表现出卓越的适应能力，因为这种环境为其生长和活性提供了充足能量[33]。正弦交流电刺激下观察到的较高电流，为EAB的富集和生物膜催化活性的提升提供了有利的环境[34]。

尽管如此，在120 h时，正弦交流电刺激的电子利用效率为22.26% ± 1.67%，显著高于方波交流电刺激（12.16% ± 0.23%），提升了1.83倍[图2（c）和（d）]。这一现象表明，在AYR降解过程中，正弦交流电刺激下的电极电子传递能力更强[35]。在还原阶段[图2（e）和（f）]，正弦交流电刺激的平均EUE为8.34% ± 1.86%，明显高于方波交流电刺激的4.54% ± 0.46%。尽管正弦交流电刺激的总电子通量低于方波交流电，但用于AYR还原的电子通量相近（1.62 mmol∙L^-1 vs 1.54 mmol∙L^-1）。这表明正弦交流电刺激的生物膜在电子转移效率上表现更优，为 AYR 的还原降解提供了更有效的电子供给。在氧化阶段[图2（g）和（h）]，正弦交流电刺激的EUE为37.07% ± 0.31%，显著高于方波交流电刺激（19.57% ± 1.21%）。虽然正弦交流电刺激的总电子通量低于方波交流电，但两种模式下用于氧化中间产物（PPD和5-ASA）的电子通量几乎一致（7.87 mmol∙L^-1 vs 6.93 mmol∙L^-1）。这一结果表明，正弦交流电刺激的生物膜能够更高效地从中间产物（PPD和5-ASA）氧化过程中获取电子。电活性生物膜具备复杂的电子传递与储存机制，表现出显著的赝电容特性[30]。赝电容特性反映了动态电子控制能力，在电流产生与基质降解过程中发挥关键作用[17]。正弦交流电刺激通过优化赝电容行为，有效调控了生物反应，促进了AYR的还原以及中间产物的氧化。

3.1.3 生物膜的电化学表征

为深入探究不同电模式下电极生物膜与AYR之间的相互作用，我们对生物膜的电化学性能进行了表征。正弦和方波交流电刺激的循环伏安法谱图展示了两对明显的氧化还原峰，分别位于E _1a = -115 mV、E _1b = 895 mV和E _2a = -136 mV、E _2b = 665 mV [图3（a）和（b）]。正弦交流电刺激的还原和氧化峰的中心分别靠近生物阴极（E ₃ = -98 mV）和生物阳极（E ₄ = 634 mV）[图3（c）和（d）]。这些氧化还原峰表明交流电刺激的生物膜能够整合有效的还原和氧化功能，在AYR降解过程中发挥协同作用。相较于方波交流电刺激（E _2a和E _2b），正弦交流电刺激的氧化还原峰中心（E _1a和E _1b）分别向正方向偏移了21 mV和230 mV。这种偏移表明正弦交流电刺激能够提高电极生物膜的催化活性，并显著增强AYR降解过程中的电子传递速率[11]。与生物阴极和生物阳极相比，正弦和方波交流电刺激下的AYR去除效率更高，120小时内分别达到63.07% ± 1.91%和56.89% ± 0.71%，显著高于生物阴极（53.13% ± 1.15%）和生物阳极（40.61% ± 0.15%）[图1（b）]。这些去除效率对应于单位电极面积上的特定AYR去除速率分别为(249.04 ± 7.64) mg∙L^-1∙m^-2、(242.00 ± 2.84) mg∙L^-1∙m^-2、(210.08 ± 4.60) mg∙L^-1∙m^-2和(159.08 ± 0.60) mg∙L^-1∙m^-2。随着扫描速率从1 mV∙s^-1增加到10 mV∙s^-1，还原和氧化峰电流与扫描速率平方根之间呈现线性关系[图3（a）~（d）]。这表明正弦和方波交流电刺激的还原和氧化反应均为扩散控制型反应[36]。

电化学阻抗谱进一步揭示了不同电模式下的内阻变化[图3（e）]。通过等效电路拟合得出的结果表明，造成电极电压损失的三个主要原因，溶液电阻（R _s）、电荷转移电阻（R _ct）和有限扩散电阻（R _d）[37]，在正弦交流电刺激下分别为0.28 Ω、0.24 Ω和0.06 Ω [图3（f）]，均显著低于方波交流电、生物阴极和生物阳极的对应值。较低的R _s值表明正弦交流电刺激的生物膜具有更优异的电子传导性能[38]，与其更高的电流值及AYR去除效率一致。较低的R _ct值反映了电极生物膜在还原期与电子受体（AYR）及氧化期与电子供体（PPD和5-ASA）之间的电子传递更加高效，表现出优异的赝电容行为[24]。低频区间的容抗弧可归因于溶液扩散层和电极内部传质过程引起的有限扩散效应。较低的R _d值则说明正弦交流电刺激能够显著促进生物膜层和电极内的扩散过程[38]。因此，正弦交流电刺激通过降低表观电阻、增强电子传递能力以及优化生物膜赝电容行为，为最大化AYR降解效率提供了有效途径。

3.2 微生物群落组成和功能

3.2.1 微生物群落多样性和分化

在不同电模式下，生物样本的Shannon指数显示出相似的数值（附录A表S2），表明微生物群落多样性在统计上无显著差异。此外，样本的Simpson指数普遍较低，反映出其多样性较为有限。这一现象可能归因于电刺激和污染物暴露条件下，选择性环境促使特定功能性微生物物种的富集。基于Bray-Curtis距离度量生成的热图进一步揭示，不同电模式下微生物群落存在显著分化。具体而言，正弦交流电和方波交流电刺激的群落组成高度相似[图4（a）]，但与生物阳极（BA）和生物阴极（BC）表现出明显差异。

NMDS分析表明，电刺激模式显著重塑了微生物群落结构，导致形成了四个明确的分组[图4（b）]。在NMDS1维度上，正弦/方波交流电（簇1/簇2）与BC/BA（簇3/簇4）有较大分离，表明交流电刺激的微生物群落与直流电驱动的生物阳极和生物阴极的群落组成存在显著差异。沿NMDS2维度的分析揭示了每个簇内部的微生物群落差异。值得注意的是，BC和BA表现出更分散的分布，而正弦交流电和方波交流电则形成了更加紧密且均匀的簇结构。这一现象表明，与直流电相比，交流电刺激能够更有效地提升微生物群落的稳定性和均匀性。此外，微生物迁移、突变及其与环境的相互作用等随机事件可能在每个反应器中独立发生，导致形成独特的微生物群落结构。即便在相似的运行条件下，这些随机因素仍可能引发不可预测的结果，从而解释了NMDS维度上的观测变化[39]。未来研究可以通过深入比较反应器的运行历史、微生物群落组成及相关的环境变量，对这些差异背后的具体机制进行系统阐述。

3.2.2 微生物群落结构和潜在功能

附录A中图S3展示了不同电模式下电极生物膜在门和纲层面的微生物群落结构。在所有电刺激条件下，变形菌门、蓝细菌门和拟杆菌门为主要门类，这些门类中富含具有电活性及降解AYR功能的细菌[40]。电刺激模式的差异在门层面上导致显著变化。例如，变形菌门的丰度依次为：正弦交流电刺激（68.75% ± 3.51%）>方波交流电刺激（63.17% ± 0.42%）>生物阴极（53.10% ± 5.52%）>生物阳极（52.81% ± 0.32%）[图S3（a）]。在纲层面，变形菌门下的α-变形菌纲占据主导地位，其丰度排名如下：正弦交流电刺激（46.53% ± 4.30%）>方波交流电刺激（41.4% ± 3.70%）>生物阳极（31.01% ± 5.70%）>生物阴极（29.97% ± 10.00%）[41]，如图S3（b）所示。

在属层面上，电刺激与污染物选择的共同作用显著增加了偶氮染料还原菌、芳香氧化菌和EAB的种群丰度。然而，这些功能细菌的丰度在不同电模式下存在显著差异[图5（a）和（b）]。例如，鞘氨醇盒菌（Sphingopyxis）在所有电刺激模式下均为优势属，其丰度依次为：正弦交流电刺激（17.99% ± 2.01%）>方波交流电刺激（17.12% ± 2.50%）>生物阳极（9.55% ± 4.21%）>生物阴极（8.30% ± 3.30%）。鞘氨醇盒菌是一种具有强羟基化、环裂解及次生代谢产物降解能力的芳香污染物降解细菌，在偶氮染料降解方面表现出优异的多功能性[42‒43]。地杆菌（Geobacter）是一种典型EAB，具有双向EET和强大的污染物转化能力[40]，在交流电刺激下丰度显著高于直流电刺激模式：正弦交流电刺激（3.30% ± 0.94%）>方波交流电刺激（2.79% ± 1.10%）>生物阳极（1.69% ± 1.34%）>生物阴极（1.37% ± 0.78%）。另一种典型偶氮染料还原菌寡养单胞菌（Stenotrophomonas），以擅长偶氮键破坏和硝基还原而闻名[44]，在正弦交流电刺激下的丰度（3.00% ± 0.33%）是方波交流电刺激（1.48% ± 0.34%）的2.03倍，是生物阴极（0.92% ± 0.03%）的3.26倍，是生物阳极（0.73% ± 0.01%）的4.11倍[44]。

基于属的功能分类，电极生物膜中的主要属分为三类：偶氮染料还原菌、芳香氧化菌和EAB [图5（c）]。正弦交流电刺激下偶氮染料还原菌[如慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）[41]、寡养单胞菌[44]和小球藻（Chlorella）[45] ]的丰度（5.24% ± 0.34%）较方波交流电刺激（2.94% ± 0.33%）高1.78倍，较生物阴极（2.41% ± 0.01%）高2.17倍，较生物阳极（2.02% ± 0.02%）高2.59倍。此外，交流电（特别是正弦交流电）显著促进了芳香氧化菌[如鞘氨醇盒菌、鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）、鞘氨醇杆菌（Sphingobium）和阿菲波菌（Afipia）[43,46‒47]]的富集，其丰度排名依次为：正弦交流电刺激（24.52% ± 2.71%）>方波交流电刺激（22.51% ± 2.63%）>生物阴极（12.25% ± 1.23%）>生物阳极（14.72% ± 1.21%）。EAB的富集[如地杆菌[40]、假单胞菌（Pseudomonas）[22]和申氏菌（Shinella）[44] ]表现出类似的趋势：正弦交流电刺激（6.39% ± 0.20%）>方波交流电刺激（5.24% ± 0.11%）>生物阳极（2.71% ± 0.11%）。此外，假单胞菌还展现了降解多种污染物（包括重金属如钒）的能力，这与其显著的细胞外电子转移能力有关[48‒49]。这些结果表明，交流电刺激能够有效促进偶氮染料还原菌、芳香氧化菌和EAB的富集，并显著提高AYR去除、中间产物氧化及电子利用效率。值得注意的是，氨氧化细菌（如亚硝化单胞菌）在正弦交流电刺激下显著富集[图5（a）]。这一结果可能归因于偶氮染料降解过程中释放的氨的去除。这表明正弦交流电模式下形成的功能菌群是支持AYR高效原位矿化的重要生物学基础。

3.3 关键功能基因和代谢途径

通过宏基因组测序分析了不同电刺激模式下电极微生物组的基因组潜力（图6）。偶氮还原酶是关键酶，其利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和（或）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[NAD(P)H]作为电子供体催化偶氮键的还原裂解，生成相应的芳香胺[50]。在正弦交流电刺激条件下，偶氮还原酶基因（K01118）及NAD(P)H脱氢酶基因（K00355、K03809和K19267）的丰度显著高于其他模式[图6（a）]。此外，硝基还原酶基因（K10679）在正弦交流电刺激下的TPM值也显著提高，该酶通过NAD(P)H催化硝基的还原过程[51]。这些还原酶基因与偶氮染料和硝基化合物的生物还原密切相关。邻苯二酚加氧酶参与芳香化合物降解过程中芳香环的氧化裂解，是AYR还原中间体矿化的关键酶[52‒53]。在正弦交流电刺激下，邻苯二酚加氧酶基因（K00446、K03381和K21726）的总TPM值高于其他模式。与其他模式相比，正弦交流电刺激下偶氮还原酶（宿主细菌：寡养单胞菌）[54]、硝基还原酶（宿主细菌：慢生根瘤菌）[55]和邻苯二酚加氧酶（宿主细菌：鞘氨醇盒菌、鞘氨醇单胞菌和鞘氨醇杆菌）[56]的典型宿主细菌丰度明显更高[图6（a）]。这些结果表明，正弦交流电刺激有效促进了与AYR还原和中间产物氧化相关的关键基因和功能菌的富集。

EAB和电极间的EET在AYR降解过程中至关重要。EET包括直接和间接传递机制，其中直接EET依赖C型细胞色素和e-pili，间接EET则通过核黄素和吩嗪等氧化还原介质进行。尽管编码核黄素（K00793）、吩嗪（K20940）和e-pili（K02651）的基因丰度在各模式下差异不显著[36,57‒58]，如图6（b）所示，但正弦交流电刺激显著提高了编码C型细胞色素的基因丰度。这表明正弦交流电刺激增强了微生物与电极之间的直接EET通路。功能性细菌（如地杆菌和假单胞菌）在正弦交流电刺激下的富集进一步验证了生物膜的电活性效率显著提高。

KEGG代谢途径分析显示，正弦交流电刺激条件下，与信号转导、氨基酸代谢以及全局与概览图相关的KEGG 2级功能基因的相对丰度显著增加[图6（c）]。在KEGG 3级中，双组分系统是正弦交流电刺激中的主要功能途径，与提高细菌存活率和偶氮染料降解能力密切相关[59]。此外，赖氨酸降解、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢等途径的增强，表明细菌在适应偶氮染料降解产物时表现出更高的细胞内代谢活性[60‒61]。脂肪酸代谢的增加进一步表明，偶氮染料降解过程中脂肪酸降解增强了能量和碳源供应，从而支持了微生物群落的代谢活动[62]。

3.4 交流电驱动生物电极工作机理的概念模型

基于AYR的矿化效率、降解路径以及相关微生物信息，本文提出了交流电驱动生物电极用于AYR生物矿化的工作机制模型（图7）。在交流电刺激下的AYR降解循环中，观察到交替的还原和氧化阶段。在还原过程中，电极提供的电子促进偶氮键的断裂与硝基的还原。正弦交流电刺激下，AYR的去除率显著高于其他模式，达到1.12~1.57倍。此外，在正弦交流电刺激下，偶氮还原菌的选择性富集程度比其他模式高1.78~2.59倍，同时偶氮还原酶和硝基还原酶基因的增加也验证了其优异的AYR去除效率。在氧化阶段中，AYR的主要还原中间产物PPD和5-ASA被进一步降解。正弦交流电刺激下，PPD和5-ASA的去除率（基于累积的中间产物比率）是其他模式的1.03~4.15倍。通过代谢物分析（附录A图S4和表S3），正弦交流电刺激显著提高了PPD和5-ASA的代谢效率，使其生成更简单、毒性更小的代谢物（如3-氨基邻苯二酚、3-氧代己二酸和琥珀酸）。这得益于正弦交流电刺激显著富集芳香氧化菌及其编码邻苯二酚加氧酶的关键基因，从而加速了中间产物的降解。此外，正弦交流电刺激选择性增加了具有双向电子转移功能的EAB（如地杆菌和假单胞菌），其丰度比其他模式高1.26~2.90倍。与EAB相关的基因，包括编码细胞色素、吩嗪合成、核黄素和e-pili的基因，在正弦交流电刺激生物膜中显著增加。这表明正弦交流电刺激通过多途径相互作用的协同效应，有效耦合了还原、氧化及双向电子转移，从而提升了AYR生物矿化效率。交流电驱动的优势在于，其通过单个生物电极实现了原位的还原与氧化过程耦合，从而在TOC去除方面实现高效。

交流电刺激过程中，中间产物的降解生成可满足电极生物膜代谢需求的小分子有机物[63]，消除了对外部碳源的依赖。此外，交流电刺激增强了功能菌群与相关基因的富集，同时调节了电极生物膜内的种间合作。反应器的配置和操作参数（如施加电压、电极材料及交流频率）对AYR去除效率具有重要影响。进一步优化这些参数有望提升AYR的去除性能。交流频率是关键参数，直接决定极性反转的次数与持续时间，从而影响还原与氧化过程的耦合效率。过高频率可能对微生物代谢和细胞膜产生损害，而过低频率可能降低通过电刺激选择微生物群的效率[20]。此外，还需要探索电极的空间分布、表面修饰、模块设计、电源管理系统和反应堆配置等方面的优化。对于其他难降解芳香化合物（如硝基苯和抗生素）的处理能力也需进一步研究。在AYR的交替还原与氧化降解过程中，氮转化表现出复杂路径。该过程始于偶氮键的断裂，生成含氮中间产物（如芳香胺）。在还原阶段，中间产物可被还原为NH₃；而在氧化阶段，NH₃可被氧化为NO₂ ^-和NO₃ ^-，随后通过反硝化还原为N₂。值得注意的是，AYR生物降解过程中的氮转化涉及额外的中间反应，具体的氮转化路径依赖于反应条件及微生物群落构成，需要深入研究以全面理解其环境影响。交流电刺激的经济可行性令人关注，其优势在于无需额外的处理单元和有机碳补充，为废水中芳香化合物的高效处理提供了一种可持续且具有前景的方法。

4 结论

采用低频低压交流电驱动生物电极，实现了芳香族化合物（如偶氮染料AYR）的高效生物矿化。这种方式通过提供周期性的还原-氧化循环，与生物阴极、生物阳极以及直流极性反转模式相比，在AYR还原及中间产物氧化方面表现出显著优势。低频低压交流电刺激的生物膜表现出强化的生物催化氧化与还原功能、双向电子转移特性及赝电容特性，进一步提高了矿化效率、氧化还原活性介质产量及电子利用率。正弦交流电刺激显著促进了专用于AYR代谢的协作微生物组的组装，其特点为功能菌群数量的增加，包括擅长偶氮染料还原的寡养单胞菌和慢生根瘤菌，善于进行芳香族中间体氧化的鞘氨醇盒菌和鞘氨醇单胞菌，以及具有强大电子转移能力的地杆菌和假单胞菌。协作微生物组表现出编码关键功能基因的富集，包括偶氮和硝基还原酶、邻苯二酚加氧酶及氧化还原介体蛋白。这些功能基因的富集进一步促进了AYR的还原与中间产物的氧化降解过程。未来研究需重点解决交流驱动生物电极的效率限制，深入阐明伴随组件的转化途径，以推进其在实际废水处理中的广泛应用。

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