X射线增敏剂——直接被X射线激活的有机药物中间体高效产生三重态激子用于癌症治疗

Engineering ›› 2024, Vol. 43 ›› Issue (12) : 180 -189. DOI: 10.1016/j.eng.2024.06.010

研究论文

林诺 ^a^,^b ,
徐晗 ^a^,^b ,
刘海超 ^c ,
马晓倩 ^a^,^b ,
石群英 ^a^,^b ,
杨晴 ^a^,^b ,
温雅婷 ^c ,
韦黄磊 ^a^,^b ,
胡可 ^a^,^b ,
杨兵 ^c ,
陈洪敏 ^a^,^b

作者信息 +

X-Ray-Sensitizers: Organic Pharmaceutical Drug Intermediates Activated Directly by X-Rays to Efficiently Populate Triplet Excitons for Cancer Treatment

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Received	Accepted	Published
2024-03-27	2024-06-26
Issue Date
2024-06-26

PDF (8797K)

摘要

放射疗法是癌症的一种重要治疗手段，但因辐射剂量高（通常超过50 Gy），而有严重的副作用。由于小剂量（< 2 Gy）的分次放疗辐射急性低、毒性晚，许多肿瘤采用其进行治疗。基于闪烁体的X射线诱导光动力疗法是一种有效的癌症治疗方法，可在一个复杂过程中采用小剂量X射线照射（< 2 Gy）。本研究筛选了噻吨酮（TX）衍生物类的药物中间体，并研究了TX衍生的有机药物分子，这些分子在低剂量X射线照射下能有效发生X射线敏化，产生三重态激子（单线态氧）用于癌症治疗。通过在2-位修饰烷氧基侧链取代基来调节分子堆积和分子间相互作用，本研究评估了一系列TX衍生物在X射线照射下的荧光和室温磷光性能。鉴于此类有机分子在超低剂量X射线照射下可直接产生大量三重态激子，这些衍生物产生单线态氧的能力及其治疗肿瘤的潜力，为开发具有简单化学结构的有机分子提供了新机遇。

Abstract

Radiotherapy is an important treatment for cancer, but it is associated with major side effects due to the high dose of radiation (generally more than 50 Gy). Because radiation’s low acute and late toxicity, many tumors are treated with fractionated radiation in small doses (< 2 Gy). Scintillator X-ray-induced photodynamic therapy is an efficient methodology for cancer management that employs small doses of X-ray irradiation (< 2 Gy) in a complex process. Here we screened pharmaceutical drug intermediates that are derivatives of thioxanthone (TX) and investigated TX-derived organic pharmaceutical molecules that efficiently undergo X-ray-sensitization to populate triplet excitons (singlet oxygen) for cancer therapy when exposed to low-dose X-ray irradiation. By modifying alkoxy side chain substitutions at the 2-position to tune the molecular packing and intermolecular interactions, the fluorescence and room-temperature phosphorescence of a series of TX derivatives were assessed under X-ray irradiation. The ability of these derivatives to generate singlet oxygen and their potential for treating tumors provide new opportunities for developing organic molecules with simple chemical structures, in which large numbers of triplets can be populated directly under ultralow-dose X-ray irradiation.

关键词

X射线增敏剂 / 定制噻吨酮衍生物 / 三重态激子 / 单线态氧 / 癌症治疗

Key words

X-ray-sensitizer / Tailored thioxanthone derivatives / Triplet excitons / Singlet oxygen / Cancer treatment

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林诺,徐晗,刘海超,马晓倩,石群英,杨晴,温雅婷,韦黄磊,胡可,杨兵,陈洪敏. X射线增敏剂——直接被X射线激活的有机药物中间体高效产生三重态激子用于癌症治疗[J]. 工程（英文）, 2024, 43(12): 180-189 DOI:10.1016/j.eng.2024.06.010

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1 引言

基于光敏剂（PS）的光动力疗法（PDT）作为安全的肿瘤治疗手段，已被广泛应用[1]。通常，光敏剂为有机发色团，在光照射下可产生活性氧（ROS）[2‒3]。然而，光的穿透深度有限，制约了其在多种癌症临床治疗中的使用。与光不同，X射线几乎具有无限的组织穿透力，且用于临床诊断成像和放射治疗已超过100年[4‒5]。受闪烁体辐射诱导发光的启发，X射线已替代光产生光子，用于深部肿瘤的生物成像与治疗[6‒7]。并非所有有机PS均可被X射线激活并产生足够量的ROS来诱导细胞死亡，因此在X射线诱导光动力疗法（X-PDT）过程中，通常需借助无机换能器将X射线能量转化为单重态发射光，进而激发光敏剂[6‒7]。但鉴于结构的精准调控以及表面修饰等面临挑战，制备高光产额的无机换能器难度较大[8]。最重要的是，复杂的多步骤转移构造不可避免地造成能量损失，降低了X-PDT的功效。

对有机闪烁体的研究历史悠久，蒽和二苯乙烯作为纯有机晶体，已被广泛用于辐射探测领域。有机闪烁体主要由低原子序数元素（如H、C、N、O）组成。这些传统有机闪烁体仅通过电离激发从单重态激子产生荧光[9‒11]。在高电离区域通常会发生显性闪烁现象，而最终由离子和次级电子产生闪烁体发光[8]。原则上，根据自旋守恒定律[12‒14]，单重态与三重态的生成比例为1∶3。这意味着大多数有机闪烁体中约四分之三的三重态未被有效利用。随着纯有机室温磷光（RTP）领域的不断发展，有望通过实现三重态激子生成的有效系间跨越（ISC）或超越非辐射过程的策略来促进RTP [15‒16]。通过引入重原子增强自旋-轨道耦合，以及刚性疏水结构抑制非辐射能量耗散，咔唑基有机分子晶体已实现了高效X射线激发发光[17‒19]。本研究设计了一种受体-苯氧基金刚烷叉骨架，可实现光和超声诱导发光而用于肿瘤特异性诊疗，且可生成辐射诱导发光，对深部肿瘤有治疗作用[20‒22]。在后一种情况中，单线态氧（辐射产生的单线态氧通过诱导环加成反应释放环张力并发光）可诱导化学发光[22]。由于上述文献中讨论的分子结构极为复杂，目前仅有极少数报道研究简单结构有机分子促进生成三重态激子以及在X-PDT过程中产生单线态氧[23‒24]。因此，急需开发创新型电离能诱导RTP有机分子。为区别于放射增敏剂（即辐射增强剂），本研究将此类分子命名为X射线增敏剂（XS），即一种可直接被X射线激活高效产生三重态激子的分子。

本研究筛选了噻吨酮（TX）衍生物类的药物中间体，并研究了TX衍生的有机分子。这些有机分子在低剂量X射线照射下，能高效地发生X射线敏化，产生单线态氧，用于癌症治疗。通过在2-位修饰烷氧基侧链取代基来调控分子堆积和分子间相互作用，我们在低剂量X射线照射下对一系列TX衍生物的荧光和RTP进行了评估。此外，本文还评估了单线态氧的产生及其治疗肿瘤的潜力。这些研究结果为开发低剂量X射线照射下可直接产生大量三重态的有机分子提供了新契机。

2 材料与方法

2.1 材料、细胞系和实验动物

1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基（聚乙二醇）]（DSPE-PEG-NH₂；铵盐）购自上海芃硕生物科技有限公司。N-（3-二甲氨基丙基）-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC；99%）与N-羟基琥珀酰亚胺（NHS；98%）购自北京百灵威科技有限公司。维替泊芬、四氢呋喃（THF）、二甲基甲酰胺（DMF）、单线态氧绿色荧光探针（SOSG）及4-硝基苯氯甲酸酯3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴盐（MTT）购自美国西格玛奥德里奇公司。胎牛血清（FBS）购自美国HyClone公司。二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）购自上海懋康生物科技有限公司。组蛋白家族成员X（H2AX）Ser-139磷酸化抗体（cH2AX抗体）购自爱必信（上海）生物科技有限公司。BODIPY^TM 581/591 C11购自美国赛默飞世尔科技公司。JC-1线粒体膜电位检测试剂盒购自美国MedChemExpress公司。异硫氰酸荧光素（FITC）偶联膜联蛋白V（Annexin V-FITC）凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。4T1小鼠乳腺癌细胞系取自中国生物化学与细胞生物学研究所。5~6周龄雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司和上海斯莱克实验动物有限公司。

2.2 XS分子制备

合成TX及2-位修饰烷氧基TX衍生物。合成并纯化TX、2-羟基硫杂蒽酮和2-烷氧基硫杂蒽酮[R = ‒CH₃(M-TX)、‒CH₂CH₃(E-TX)、‒CH₂CH₂CH₃(np-TX)和‒CH(CH₃)₂(ip-TX)]，用于后续研究。

将2-氯硫杂蒽酮（4.9 g, 20.0 mmol）、KOH（2.5 g, 44 mmol）、Pd₂(dba)₃（365 mg, 0.4 mmol）和t-Bu XPhos（680 mg, 1.6 mmol）置于经烘箱干燥的Schlenk烧瓶中，通入氩气保护。向混合物中加入二𫫇烷（18 mL）和水（10 mL），所得溶液在100 ℃下搅拌16 h。反应混合物冷却至室温后，用稀盐酸水溶液酸化，过滤得黄色沉淀，依次用水和乙醚清洗，制得2-羟基硫杂蒽酮（3.9 g, 16.95 mmol，产率为85%）。

将2-羟基硫杂蒽酮（500 mg, 2.19 mmol）、碘甲烷（777 mg, 5.47 mmol）和 K₂CO₃（1.51 g, 10.95 mmol）置于经烘箱干燥的Schlenk烧瓶中，通入氩气保护。随后向混合物中加丙酮（15 mL），所得溶液回流3 h。反应混合物用水稀释后，用二氯甲烷萃取，合并有机相，用无水MgSO₄干燥。除去溶剂后，粗产物经硅胶柱色谱纯化（以二氯甲烷/石油醚为洗脱剂），分离得黄绿色固体（460 mg, 1.9 mmol，产率为88%）。用相同方法合成其他2-位修饰烷氧基TX衍生物。

2.3 XS粒子制备

用纳米沉淀法合成XS粒子。简言之，将XS分子（1 mg）溶解于含DSPE-PEG-NH₂（7 mg）的四氢呋喃（1 mL）中，室温持续搅拌过夜，制得ip-TX纳米粒子（简称ip-TX）。通过离心纯化纳米粒子，用Millipore超滤离心过滤器[截留分子量（MWCO）：3000 kD]清洗三次，最终产物悬浮于1 mL蒸馏水中作为储备液备用。

用EDC-NHS法使纳米粒子与PS进行反应，从而偶联PS。具体步骤如下：将1 mg维替泊芬溶解于1 mL DMF，用10 mL去离子水稀释后，加入21 mg NHS和36 mg EDC作为共价偶联试剂，室温下搅拌30 min。调节pH至7.0~7.4，向活化溶液中加200 μL制备好的ip-TX，混合物在室温下持续搅拌反应24 h。随后，用Millipore超滤离心过滤器（MWCO: 3000 kD）纯化维替泊芬偶联的ip-TX（Vip-TX），并用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗三次。合成过程中未见异常高的安全风险。

2.4 Vip-TX中ip-TX与维替泊芬的负载率

用Millipore超滤离心过滤器以3000 r∙min^-1的转速浓缩DSPE-PEG-NH₂包裹的维替泊芬分子（简称VP）和Vip-TX，收集上清液并溶于二甲基亚砜（DMSO），用标准吸收曲线法计算ip-TX或维替泊芬的负载率，公式如下：

负载率=（W _ip-TX/W _Vip-TX）×100%

式中，W _ip-TX为ip-TX的重量；W _Vip-TX为Vip-TX的重量。

2.5 X射线照射下溶液中单线态氧（¹O₂）的生成

使用SOSG进行检测，根据其在吸收光谱中的变化确认溶液中¹O₂的生成。具体而言，SOSG（5 μmol∙L^-1）与ip-TX和Vip-TX分别悬浮于水中（15 μg ip-TX∙mL^-1），再以2 Gy（160 kV）剂量X射线照射后，测定荧光光谱。

2.6 细胞摄取

所有细胞系在使用前未进一步鉴定，但进行常规支原体污染检测。4T1细胞用含10%胎牛血清、100 U∙mL^-1青霉素G钠和100 μg∙mL^-1硫酸链霉素的培养基，于37 ℃、5% CO₂湿润环境下培养。

用12孔板（每孔5 × 10⁵个细胞）继续培养4T1细胞12 h。向细胞中加Vip-TX（15 μg ip-TX∙mL^-1），孵育不同时间。用奥林巴斯FV1200共聚焦激光扫描显微镜获取荧光图像。

2.7 细胞毒性

4T1细胞用含10%胎牛血清的杜氏改良Eagle培养基，于37 ℃、5% CO₂湿润环境中培养24 h。用标准MTT法检测细胞活力。用96孔板（每孔10⁴个细胞）孵育24 h后进行后续实验。随后在培养基中加不同浓度（0 μg ip-TX∙mL^-1、3.6 μg ip-TX∙mL^-1、7.2 μg ip-TX∙mL^-1、15 μg ip-TX∙mL^-1、30 μg ip-TX∙mL^-1和60 μg ip-TX∙mL^-1）Vip-TX纳米粒子，与细胞共孵育24 h。最后进行MTT 检测。

2.8 体外单线态氧生成

用DCFH-DA试剂检测¹O₂。将4T1细胞接种于12孔板（每孔10⁵个细胞）培养过夜，随后在细胞中加ip-TX、VP和Vip-TX（15 μg ip-TX∙mL^-1），以PBS培养的细胞为对照。孵育6 h后再用PBS清洗，加入10 μmol∙L^-1 DCFH-DA继续培养30 min。再次用PBS清洗，以2 Gy（160 kV）剂量X射线照射细胞，用奥林巴斯FV1200共聚焦激光扫描显微镜获取发光图像。

2.9 脂质过氧化检测

将4T1细胞（2 × 10⁵个）接种于玻璃细胞培养皿（直径为10 mm）孵育24 h。细胞随机分为四组：空白对照组（仅PBS）、PBS + X射线组、Vip-TX（15 μg ip-TX∙mL^-1）组和Vip-TX（15 μg ip-TX∙mL^-1）+ X射线组。对两个实验组照射X射线（2 Gy, 160 kV）。之后用1 μmol∙L^-1 BODIPY^TM 581/591 C11染色结合共聚焦显微镜分析，评估脂质过氧化水平。

2.10 线粒体膜电位检测

将4T1细胞（2 × 10⁵个）接种于玻璃细胞培养皿（直径为10 mm）孵育24 h。细胞随机分为四组：空白对照组（仅PBS）、PBS + X射线组、Vip-TX（15 μg ip-TX∙mL^-1）组和Vip-TX（15 μg ip-TX∙mL^-1）+ X射线组。对两个实验组照射X射线（2 Gy, 160 kV）。之后，按试剂盒说明书，用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒检测细胞线粒体膜电位变化。

2.11 DNA 损伤检测

将4T1细胞（2 × 10⁵个）接种于玻璃细胞培养皿（直径为10 mm）孵育24 h。细胞随机分为四组：空白对照组（仅PBS）、PBS + X射线组、Vip-TX（15 μg ip-TX∙mL^-1）组和Vip-TX（15 μg ip-TX∙mL^-1）+ X射线组。对两个实验组照射X射线（2 Gy, 160 kV）。之后用cH2AX染色结合共聚焦显微镜分析评估DNA损伤水平。

2.12 细胞凋亡评估

用不同培养基处理细胞以评估凋亡情况，包括经PBS（对照）、Vip-TX（15 μg ip-TX∙mL^-1）、X射线、Vip-TX（15 μg ip-TX∙mL^-1）+ X射线不同处理。之后孵育细胞4 h，用PBS清洗两次。将经处理的细胞继续孵育4 h，通过胰蛋白酶消化和离心后收集细胞。用PBS重悬沉淀细胞，以Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）标记15 min，然后用流式细胞仪分析。

2.13 动物实验

5~6周龄雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司与上海斯莱克实验动物有限公司。所有动物实验操作均遵循《区域动物实验伦理委员会指南》和厦门大学实验动物使用与管理委员会批准的护理规范执行。

2.14 Vip-TX的体内成像、生物分布及血液清除评估

通过皮下注射2 × 10⁶个4T1细胞构建荷瘤小鼠模型。当肿瘤体积达到60~80 mm³时，静脉注射Vip-TX（1.5 mg ip-TX∙kg^-1）。注射后0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h和24 h，用IVIS Lumina II体内成像系统获取荧光图像。同时进行离体成像。荷瘤小鼠于注射后24 h安乐死并解剖，用IVIS Lumina II系统分析主要解剖器官及肿瘤组织。采集200 μL血液并检测荧光强度，用单室药代动力学模型计算Vip-TX的体内血液循环半衰期。

2.15 体内X-PDT试验

在肿瘤治疗试验中，将4T1荷瘤小鼠随机分为四组：仅PBS组、Vip-TX组、X射线组和Vip-TX + X射线组。第一天给小鼠注射Vip-TX（1.5 mg ip-TX∙kg^-1），注射后2 h对肿瘤区域照射1 Gy（160 kV）X射线，用铅板遮盖小鼠身体其他部位。在14天治疗期内，隔天记录各组小鼠体重和肿瘤大小。按以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积=（宽度² ×长度）/2。肿瘤治疗结束后，所有小鼠被安乐死，切除肿瘤并拍照。随后，将切除的肿瘤和主要器官切片，通过标准苏木精-伊红染色进行组织学分析。

2.16 血清生化与血液学分析

对小鼠静脉注射Vip-TX（1.5mg ip-TX∙kg^-1），分别于治疗前（第0天）和治疗后第3天、7天、14天采集血样，进行血清生化分析和全血细胞分析。用全自动生化分析仪（迈瑞BC-220）检测小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、血清白蛋白（ALB）、血尿素氮（UREA）、肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酐（CREA）和肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）。用全自动三分类血细胞分析仪（迈瑞BC-2600）检测小鼠血液中的白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）、血细胞比容（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞分布宽度（RDW-SD）、血小板计数（PLT）和平均血小板体积（MPV）。

2.17 数据统计分析

所有数据均以均值±标准差（SD）表征。用单因素方差分析（ANOVA；SPSS Statistics 2 软件）对比数据并计算P值。以下情况差异有统计学意义：^* P < 0.05，^** P < 0.01，^*** P < 0.001，^**** P < 0.0001。

3 结果与讨论

3.1 XS纳米粒子的合成与表征

为筛选简单结构的有机分子，选择两种药物中间体——吩噻嗪和噻吨酮，比较两者在X射线照射下的发光特性[25‒27]。分子结构分析表明，即使细微的结构差异也会导致X射线照射下发光行为的显著不同（附录A图S1）。与吩噻嗪2-位卤化衍生物相比，TX卤化衍生物在约480 nm处辐射发光（荧光发射），并在527 nm和577 nm处产生超过20倍的强度辐射发光（RTP发射）（图S1）。为全面研究X射线照射下荧光和RTP发射的生物学效应，本文设计了一系列含2-位修饰烷氧基侧链取代基的TX分子，包括甲氧基（‒OCH₃，简称M-TX）、乙氧基（‒OCH₂CH₃，简称E-TX）、正丙氧基（‒OCH₂CH₂CH₃，简称np-TX）和异丙氧基[‒OCH(CH₃)₂，简称ip-TX]，如附录A图S2所示。TX的光致发光效率有限（Φ = 1.5%），而TX的2-位衍生物可有效提高光致发光效率[28]。本研究中，在X射线照射下，所有2-位TX衍生物粉末均表现出清晰的单重态发射（约465 nm，归于荧光）和三重态发射（585 nm，归于磷光），如图1（a）所示。值得注意的是，M-TX和ip-TX的三重态发射与其他2-位TX衍生物完全不同，二者的强度高于单重态发射，且ip-TX在所有2-位TX衍生物粉末中同时表现出最高的单重态和三重态发射[图1（a）]。尤其是ip-TX形成典型的J-聚集，可增强ISC以促进三重态发射[28]。此外，沿分子堆积于短轴的多重氢键相互作用和异丙氧基刚性环境有效限制了非辐射振动，并显著增强了三重态发射[28]，如图1（b）所示。随后，三重态激子的高效聚集通过磷光向溶液中的氧气传递能量[28]，如图1（b）所示。该过程与光化学领域的光动力机制极为相似。为区分和对比PS与放射增敏剂（亦称辐射增强剂）的定义，我们将直接被X射线激活以高效聚集三重态激子的有机分子定义为XS。

3.2 辐射发光的光物理特性和水溶液中¹O₂的生成

在相同条件下，ip-TX表现出最高荧光效率（Φ _F = 12.7%）和磷光效率（Φ _P = 32.3%）[16]。为进一步探索其生物医学应用，用ip-TX作为典型的XS分子。利用DSPE-PEG-NH₂，通过纳米沉淀法将XS转化为水溶性纳米粒子，获得包封率约为15 wt%、粒径均匀约为105 nm的单分散球形纳米粒子[图1（c）]。在365 nm紫外光照射下，单重态发射相对强度高于三重态发射[图1（d）黑色曲线]。值得注意的是，在X射线照射下，三重态发射强度急剧增加，相对强度高于单重态发射[图1（d）红色曲线]。更有趣的是，X射线照射下磷光相对强度显著增加[图1（e）]，表明X射线可直接产生大量三重态[17‒18]。换言之，2-位修饰的TX分子经X射线激活后可直接生成三重态。因此，我们推断在TX中，X射线照射下的激发以电离激发为主导。

来自XS的X射线激发三重态基于磷光向溶液中的氧气传递能量。为扩大能量传递以生成¹O₂，可通过PS与ip-TX偶联，充分利用单重态发射（荧光）激发PS，生成更多¹O₂。苯并卟啉衍生物——维替泊芬（商品名Visudyne）是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的第二代PS（2000），用于PDT，通过ROS积聚触发线粒体光化学损伤[29‒31]。2014年开展的一期和二期研究采用维替泊芬介导的PDT治疗局部进展期胰腺癌，证实了该疗法的安全性[32]。此外，维替泊芬在一项临床试验（NCT04590664）中被批准用于治疗复发性高级别表皮生长因子受体（EGFR）突变型胶质母细胞瘤（GBM），已发表数据显示其对EGFR扩增和突变型GBM具有良好的治疗预期[33]。最重要的是，维替泊芬的光谱吸收与单重态发射高度匹配[图1（f）]。偶联后，Vip-TX保持球形结构，核心粒径约为93 nm，流体力学直径约为161 nm [图1（g）]。维替泊芬在Vip-TX中的负载率约为8.6 wt%，表面偶联对zeta电位影响极小[图1（h）]。用傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）检测，进一步证实了偶联成功[图1（i）]。

3.3 直接辐射激活生成三重态激子的体外评估

从激发的ip-TX和Vip-TX可观察到¹O₂生成，由此验证三重态发射，该过程中三重态将能量传递至基态三重态O₂，形成单线态氧¹O₂。用SOSG检测X射线照射期间的¹O₂生成，以此定量¹O₂。经2 Gy Vip-TX辐射照射后，SOSG荧光强度增加1.8倍，而单2 Gy辐射照射后，荧光强度增加微弱[图2（a）]。Vip-TX和SOSG结果显示，剂量大小会影响荧光增强度[图2（b）]。用电子自旋共振谱仪（ESR）进一步研究ROS生成。与单辐射处理形成的微弱峰相比，Vip-TX引发的辐射致单重态和三重态发射产生清晰尖锐的¹O₂峰[图2（c）]。

确认Vip-TX在培养基中的稳定性后（附录A图S3），通过Vip-TX的维替泊芬荧光探究Vip-TX细胞摄取。Vip-TX与4T1细胞孵育4 h后，清晰耀眼的红色荧光信号均匀分布于细胞内[图2（d）]。时序流式细胞术分析进一步证实孵育4 h后的高细胞摄取率[图2（e）]。优异的细胞摄取有助于在胞内细胞器中生成更多¹O₂。在相同X射线剂量（2 Gy）下，ip-TX处理的4T1细胞显示出比对照组更强的绿色荧光信号[附录A图S4（a）]，超过4倍的增强结果明确表示，与单辐射组相比，三重态发射可高效生成¹O₂ [附录A图S4（b）]。单重态与三重态发射联用（即Vip-TX + X射线照射）产生了更强的绿色荧光信号[图2（f），附录A图S5]，与单辐射组相比，增强3.5倍以上。值得注意的是，单重态与三重态发射联用（Vip-TX + X射线照射）生成的¹O₂比仅三重态发射（ip-TX + X射线照射）多1.3倍（P = 0.024）（附录A图S6和图S7）。ip-TX + X射线照射组与Vip-TX + X射线照射组的三重态发射比值计算为0.79（3/3.8），与0.75（3/4）极为接近。这表明本设计中生成的大部分单重态和三重态发射均被有效利用[12‒14]。TX中生成的¹O₂及元素硫的重原子效应可诱导4T1细胞发生脂质过氧化、DNA损伤和线粒体功能障碍[图2（g）~（i），附录A图S8至图S10]。同时，Vip-TX + X射线照射也诱发明显的脂质过氧化、DNA损伤和线粒体功能障碍（附录A图S8至图S10），进而导致大量细胞死亡[附录A图S11（a）]。尽管Vip-TX具有较高的细胞摄取率，使用浓度为0~60 μg∙mL^-1的ip-TX时，无X射线照射的Vip-TX显示极低的肿瘤细胞毒性[图2（d），附录A图S11（a）]。值得注意的是，在X射线照射下，细胞活力急剧下降（附录A图S11）。用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒和Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒进行流式细胞术分析及荧光成像，进一步证实了治疗效果[附录A图S11（b）和（c）]。

3.4 直接辐射激活高效生成三线态激子的体内评估

使用维替泊芬荧光检测无瘤小鼠Vip-TX血药浓度，以评估静脉注射Vip-TX的药代动力学。Vip-TX的消除半衰期（t _1/2）为(163.8 ± 10.4) min，如图3（a）所示。荷瘤小鼠的体内外生物分布及器官中Vip-TX的量化显示，肿瘤内药物蓄积量高且滞留时间长，注射后2 h达蓄积峰值[图3（b）和（c）]。正常器官的荧光信号迅速衰减，而肿瘤区域的信号持续且强烈[图3（c）]。体外器官检测结果表明，肿瘤中药物滞留时间分别是肝脏和肾脏的2.9倍和4.3倍[图3（d）和（e）]。最重要的是，这种高蓄积和长滞留对健康小鼠的血液参数及肝肾功能无明显影响（附录A表S1）。

X射线照射下，所提取肿瘤明亮发光且高蓄积、长滞留（附录A图S12），证实TX在肿瘤中高度富集。在上述体内外试验结果激励下，我们在BALB/c小鼠皮下4T1肿瘤模型中开展实验，探究Vip-TX作为XS被高能辐射直接激活，并高效生成三重态激子以抑制肿瘤生长的能力。当肿瘤体积达60~80 mm³时，静脉注射VP、ip-TX和Vip-TX（1.5 mg ip-TX∙kg^-1），注射后2 h照射X射线（1 Gy, 160 kV）。各组肿瘤体积量化结果显示，所有对照组（PBS、1 Gy辐射组和Vip-TX组）均观察到肿瘤快速生长[图4（a）]。与之形成鲜明对比，Vip-TX + X射线照射组（1 Gy）的肿瘤体积明显缩小[图4（a），附录A图S13]。

肿瘤体积定量分析进一步证实，Vip-TX + X射线照射可完全抑制肿瘤生长[图4（b）]。由肿瘤体积计算得出，肿瘤抑制率为86.4% [图4（c）]。典型荷瘤小鼠的照片显示出相似趋势的疗效（附录A图S14和S15）。在实验终点切除肿瘤，X射线照射的Vip-TX治疗组中肿瘤体积明显更小[图4（d）]。肿瘤重量进一步证实了X射线激活Vip-TX组优秀的抗肿瘤效果[图4（e）]。由肿瘤重量计算所得，肿瘤抑制率为85.6% [图4（f）]，与体积计算结果相符。肿瘤的苏木精-伊红染色进一步表明，X射线激活Vip-TX治疗的小鼠肿瘤区域出现明显损伤[图4（g）]，表现为肿瘤结节减少、组织疏松。值得注意的是，X射线照射的Vip-TX治疗组和其他治疗组小鼠均未出现明显体重下降（附录A图S16），其他器官也未受影响（附录A图S17），说明该治疗对小鼠副作用很小。综上，这些结果表明，X射线激活的TX衍生物在低剂量X射线照射下可高效聚集三重态激子，作为体内X射线激活的XS可用于癌症治疗，且具有安全性和低毒性。

4 结论

本文筛选了TX衍生物类的药物中间体，并研究了TX衍生的有机分子。这些有机分子在低剂量X射线照射下，能高效发生X射线敏化，产生单线态氧，因而可作为癌症治疗药物。我们还评估了它们在X射线照射下的发光情况。与具有相同位置取代基的吩噻嗪相比，TX结构显示出更高的放射致发光特性。通过在2-位修饰烷氧基侧链取代基来调控分子堆积和分子间相互作用后，在低剂量X射线照射下对一系列TX衍生物的荧光和RTP进行了评估。单线态氧的产生以及在体外和体内治疗肿瘤的潜力，为开发另一类在低剂量X射线照射下可直接产生大量三重态的新型有机分子提供了新契机。

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原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

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