多形核髓源性抑制细胞——免疫衰老并导致艰难梭菌易感性增加的原因之一

吴建民 ,  张明 ,  张浩 ,  盛明轩 ,  孙佳增 ,  吴芳 ,  高海娜 ,  陈丽水 ,  李志立 ,  田启宇 ,  朱龙佼 ,  方冰

工程（英文） ›› 2024, Vol. 42 ›› Issue (11) : 63 -78.

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工程（英文） ›› 2024, Vol. 42 ›› Issue (11) : 63 -78. DOI: 10.1016/j.eng.2024.06.014
研究论文

多形核髓源性抑制细胞——免疫衰老并导致艰难梭菌易感性增加的原因之一

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PMN-MDSC: A Culprit Behind Immunosenescence and Increased Susceptibility to Clostridioides difficile Infection During Aging

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摘要

随着年龄的增长，老年群体对病原体的易感性增加，这主要是免疫衰老的缘故。作为机体重要的免疫调节器官，骨髓产生免疫细胞并通过血液转运到其他器官和组织。尽管骨髓对于机体健康意义重大，但骨髓中免疫细胞生成变化及其对免疫衰老影响的相关研究仍十分有限。在本研究中，我们通过质谱流式技术分析了年轻（3月龄）小鼠与老年（24+月龄）小鼠骨髓免疫细胞的组成。同时，我们进一步分析了公共数据库中年轻和老年小鼠骨髓单细胞转录组数据，并通过流式细胞术进行验证。对于存在差异的免疫细胞对老年小鼠免疫衰老的影响，我们通过艰难梭菌感染小鼠模型进行了评估。结果表明，老年小鼠呈现出骨小梁结构数量的下降，同时伴随多形核（PMN）髓源性抑制细胞（MDSC）丰度的显著升高。通过骨髓高通量测序和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析，我们发现一些与免疫反应相关的基因发生变化，特别是Th17细胞分化通路基因显著富集。此外，输出到大肠组织的多形核髓源性抑制细胞丰度的增加使得结肠在艰难梭菌感染后出现通透性升高和炎症反应显著增强的现象。然而，使用抗Gr-1抗体清除老年小鼠的多形核髓源性抑制细胞后，艰难梭菌感染的小鼠结肠组织中IL-17通路被抑制，肠道通透性降低，表明了感染症状的明显缓解。总的来看，衰老增加了骨髓生成和输出到肠道的多形核髓源性抑制细胞数量，这增加了艰难梭菌的易感性。本研究提供了一个新的抗免疫衰老策略的调控靶点，有利于改善老年群体的免疫功能。

Abstract

Susceptibility to pathogens in the elderly is heightened with age, largely because of immunosenescence. As an immune regulatory organ, bone marrow creates immune cells that move to other organs and tissues through the blood. Despite the significance of this process of this organ, there is limited research on changes in immune cell generation in the bone marrow and their effects on immunosenescence. In this study, the compositions of immune cells in bone marrow from young (three months) and old (24+ months) mice were compared by means of mass cytometry, with further validation obtained through the reanalysis of single-cell RNA sequencing data and cell sorting via flow cytometry. The effects of differential immune cells on immunosenescence in old mice were evaluated using the Clostridium difficile (C. difficile) infection model. Our results showed that aged mice presented with a reduction in bone trabeculae structure, which was accompanied by a notable increase in polymorphonuclear (PMN)-myeloid-derived suppressor cell (MDSC) abundance. Through bulk-seq and reverse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis, we identified differential genes associated with the immune response—specifically, the Th17 cell differentiation pathway. Furthermore, the increase in exported PMN-MDSCs to the large intestine resulted in increased gut permeability and inflammatory damage to the colon following C. difficile infection. After clearing the PMN-MDSCs in old mice using the anti-Gr-1 antibody, the symptoms induced by C. difficile were significantly relieved, as evidenced by an inhibited IL-17 pathway in the colon and reduced gut permeability. In conclusion, aging increases the number of PMN-MDSCs in both the generated bone marrow and the outputted intestine, which contributes to susceptibility to C. difficile infection. This study provides a novel target for anti-aging therapy for immunosenescence, which is beneficial for improving immune function in elders.

关键词

多形核髓源性抑制细胞 / 免疫衰老 / 衰老 / 质谱流式 / 艰难梭菌

Key words

PMN-MDSC / Immunosenescence / Aging / Mass cytometry / Clostridioides difficile

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吴建民,张明,张浩,盛明轩,孙佳增,吴芳,高海娜,陈丽水,李志立,田启宇,朱龙佼,方冰. 多形核髓源性抑制细胞——免疫衰老并导致艰难梭菌易感性增加的原因之一[J]. 工程（英文）, 2024, 42(11): 63-78 DOI:10.1016/j.eng.2024.06.014

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衰老是一种普遍和保守的生物现象，贯穿于整个发育过程，其中免疫衰老可以影响免疫调节网络，导致免疫功能受损和对疾病的抵抗力下降[1‒3]。在哺乳动物中，免疫衰老表现出慢性炎症、对内部和外部抗原的免疫反应减弱、对新抗原的反应受损，以及免疫记忆的缓慢激活等特征，最终导致对抗传染病、阻碍肿瘤生长和清除衰老细胞能力的下降[2,4‒5]。在衰老个体中，免疫功能的下降与病原敏感性增加以及重症疾病的发展密切相关。显然，老年群体呈现更高的呼吸道、胃肠道和皮肤感染的发生率，这突出了衰老过程中发生的黏膜和皮肤免疫损伤[6]。
随着衰老过程的推进，骨髓会发生一系列的转变，如支持结构的改变、脂肪细胞的积累以及生物分子微环境的改变[7‒11]。在骨髓中，衰老细胞不断积累并呈现出衰老分泌表型，导致影响微环境的活性物质的分泌[9,12]。在这种情况下，处于造血系统顶端的造血干细胞（HSC）自我更新能力显著下降，谱系分化方向有所改变[13]。已有研究表明，衰老的造血干细胞呈现出向髓系细胞分化方向增强和向淋巴系细胞分化方向减弱的情况[8]。向髓系细胞分化的偏倚降低了B淋巴细胞和T淋巴细胞丰度，增加了髓系细胞的丰度，特别是髓系细胞中具有免疫抑制特性的细胞组分。随之，老年人群可能出现免疫系统紊乱和对感染性疾病防御能力的减弱。因此，探索骨髓微环境和免疫细胞补偿的变化可能有助于理解衰老的免疫系统对病原体反应的低效性。
艰难梭菌是65岁以上人群急性细菌性腹泻的常见病原体，也是一种常见的医院感染细菌[14‒15]。与艰难梭菌感染相关的死亡率随着年龄的增长而上升，从61~70岁年龄段到80岁以上年龄段，老年人群死亡率从5%增加到10%以上[16]。在美国，2012年艰难梭菌感染引起的病例估计有5万例左右，死亡的病例有2.9万例[17]。非侵入性艰难梭菌菌株导致了不同程度的腹泻和结肠炎，使老年群体的死亡率恶化，其分泌的肠毒素A（TcdA）、细胞毒素B（TcdB）和二元毒素介导了上皮的破坏和促炎反应[18]。在宿主的环境中，先天免疫在决定衰老个体对艰难梭菌的抵御能力上发挥了重要的作用。已有研究表明，衰老阻碍了多种先天细胞因子的激活，导致了髓系细胞向大肠的募集不足[19]。这导致了肠外组织中细菌载量和毒素产生增加，最终可引起死亡。然而，特定的骨髓细胞分化改变导致老年人肠黏膜免疫缺陷的机制仍不明确。
在本研究中，我们通过质谱流式（CyTOF）技术探究了年轻和老年小鼠骨髓中免疫细胞谱系。公共数据库中的单细胞转录组数据重分析进一步确认了质谱流式的结果。同时，测定年轻和老年小鼠骨髓转录组和免疫基因表达来确认衰老对免疫通路波动的影响。本研究为今后免疫干预防治老年人艰难梭菌感染奠定了理论基础。

2 材料与方法

2.1 实验动物和处理

动物实验步骤经过中国农业大学动物伦理和动物福利委员会批准（AW12902202-5-7）。3月龄、8月龄、18月龄、24月龄、28月龄雄性SPF鼠购自北京维通利华实验动物有限公司（北京），并饲养在维持(24 ± 2) ℃和12 h暗/光循环的鼠房中，鼠房的相对湿度为50%~60%。小鼠采食和饮水自由。以此方式，小鼠被饲养至自然衰老。

在感染实验中，经过3天的复合抗生素饮水和1天的恢复后，通过灌胃给予24月龄雄鼠空白处理或者200 μL浓度约为1.0 × 109 CFU∙mL-1（CFU为菌落形成单位）的艰难梭菌VPI 10463 [20]。产毒素艰难梭菌VPI 10463菌株由上海交通大学瑞金医院彭奕冰教授惠赠。艰难梭菌使用脑心浸粉（BHI）培养基培养，菌液浓度通过梯度稀释和培养皿计数进行检测。饮水中的复合抗生素包括0.4 g∙L-1卡那霉素、0.215 g∙L-1甲硝唑、0.057 g∙L-1黏菌素、0.045 g∙L-1万古霉素和0.035 g∙L-1庆大霉素。7天之后，分析小鼠对艰难梭菌易感性的差异。多形核（PMW）髓源性抑制细胞（MDSC）通过腹腔注射抗Gr-1（BE0075, BioXcell，美国）抗体进行清除。采样后，通过摘取眼球采集的血液被收集到抗凝管，然后在4 ℃ 下以300g离心15 min获得血浆。小鼠肝脏和脾脏指数通过器官重/体重× 100%计算得到。所有的肠道组织样品和食糜等储存在-80 ℃待测。

2.2 质谱流式检测骨髓细胞

质谱流式检测免疫细胞和干细胞谱系的方法参考已有研究[21‒22]。在将胫骨和股骨骺端剪开后，使用改造的离心套管通过离心收集骨髓细胞。用磷酸盐缓冲液（PBS）重悬样品，然后使用70 μm滤膜进行过滤以获得单细胞悬液。骨髓细胞使用终浓度为0.25 μmol∙L-1的194Pt在冰上孵育5 min以识别活细胞。然后，使用50 µL Fc受体封闭剂在冰上孵育20 min以封闭细胞位点。随后，用包含41种金属标记的表面抗体混合液对细胞染色30 min。固定并用破膜缓冲液室温孵育1 h后，使用191/193Ir在4 ℃条件下过夜染色DNA，在荧光激活细胞分选（FACS，BD Bioscience，美国）缓冲液清洗后使用胞内金属标记抗体的混合液于室温下孵育30 min。再次清洗后，细胞使用PLT-MC601仪器（浙江普罗亭健康科技有限公司）进行分析。数据使用FlowJo软件（BD Bioscience）进行校正和手动设门，去除微球、载体细胞、死细胞后圈出单个活细胞。然后，CD45+免疫细胞通过x‐shift算法继续进行亚群聚类、注释、t分布随机邻域嵌入（t‐SNE）降维和数据分析。

2.3 流式细胞术

分离的骨髓细胞使用红细胞裂解缓冲液进行裂解以清除成熟的红细胞。在清洗和使用染色缓冲液进行重悬后，每个样品抽取100 μL悬液加到新的避光离心管中。异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗鼠CD11b抗体（127608, Biolegend，美国）、Alexa Fluor® 647标记的抗鼠Ly6C抗体（127612, Biolegend）和藻红蛋白（PE）标记的抗鼠Ly6G抗体（127608, Biolegend）分别加入管中，根据生产商提供的说明书在4 ℃条件下染色1 h。在染色缓冲液清洗和重悬后，CD11b+细胞和多形核髓源性抑制细胞（CD11b+、Ly6Clow/neg、Ly6G+）的丰度使用FACSAriaTM III系统（BD，美国）进行检测。经过相似的处理步骤后，结肠黏膜中的细胞被染色和检测。然而，存在差异的是，结肠组织需要先在含有5 mmol∙L-1乙二胺四乙酸（EDTA）和10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中，于37 ℃摇动以消化移除上皮细胞，然后在含有300 IU∙mL-1胶原酶和10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中剧烈摇动以获得黏膜中的细胞。相对而言，血液细胞的染色步骤更简单。简而言之，对100 μL含有EDTA抗凝剂的血液预先使用三只抗体染色1 h，然后裂解血液中红细胞。在获得初步的结果后，校正所有的数据并使用FlowJo 10手动设门。

2.4 骨髓单细胞转录组分析

骨髓单细胞转录组数据从基因表达综合数据库（GEO）（ID：GSE169608）中获取，项目包括1月龄（GSM5210632, 1M）、6月龄（GSM5210633, 6M）和20月龄（GSM5210634, 20M）小鼠的数据。单细胞聚类和注释使用R包中的“Seurat”（version 4.0）。在三个以上的细胞中至少保留一个特征计数的基因以供进一步分析。为了去除数据质量低的细胞，超过5000或者少于500个基因的细胞，以及线粒体比例大于0.15的细胞被滤除。数据使用“NormalizeData”函数在scale.factor = 10000条件下进行校正，然后10个最高度可变的基因使用“FindVariableFeatures”功能以nfeatures = 2000进行识别。在数据整合和缩放后，进行主成分分析，然后使用“FindNeighbors”和“FindClusters”函数进行前25个维度的细胞聚类，分辨率为0.5。每个细胞分类的标志基因通过“FindAllMarkers”函数以min.pct = 0.25和logfc.threshold = 0.25进行识别。根据每个类群的传统标志基因与CellMarker 2.0数据的比对结果对细胞类型进行识别。降维操作通过“RunUMAP”函数完成，结果的可视化通过“DimPlot”函数完成。目标基因的统一流形和近似投影（UMAP）图，如Cd11b(Itgam)、Ly6C2、Ly6g，使用R包的“ggplot”和“dplyr”完成。计算目标细胞的比例，比如髓源一致性细胞、多形核髓源一致性细胞、多形核髓源一致性细胞（C05）、多形核髓源性抑制细胞（C07）。然后，在融合三个样本的数据后，我们重新聚类了三个阶段的中性粒细胞，并对6月龄组和20月龄组进行基因集富集分析（GSEA）。

2.5 PMN-MDSC分选和CD8+ T细胞共培养

对于共培养实验，用0.75 μg∙孔-1抗鼠CD3e IgG1抗体（60015, STEMCELL，加拿大）预包被24孔板。脾脏中的CD8+ T细胞使用商业化小鼠CD8a正选试剂盒（18753，STEMCELL）根据说明书的步骤进行分选。分选的CD8+ T细胞被接种到24孔板中并使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，培养基中补充10 mmol∙L-1羟乙基缓冲液、2 mmol∙L-1 L-谷氨酰胺、1 mmol∙L-1丙酮酸钠、100 μmol∙L-1非必须氨基酸MEM和50 μmol∙L-1 β巯基乙醇。30~100 IU∙mL-1鼠IL-2（78081.1, STEMCELL）和0.5 μg∙mL-1抗鼠CD28抗体（102102, Biolegend，美国）加入培养基中以活化细胞。CD8+ T细胞被接种到转运孔（transwell）细胞板下室（3470, 0.4 μm, Corning）以备与上室中的多形核髓源性抑制细胞共培养。我们进一步使用流式分选的方法分选出多形核髓源性抑制细胞。在CD8+ T细胞培养24 h后，从24月龄小鼠骨髓或者血液分选出的多形核髓源性抑制细胞被接种到上室进行共培养，上室内的培养基与CD8+ T细胞培养基相似，仅不含IL-2和CD28抗体。共培养48 h后，收集CD8+ T细胞培养基上清液用于检测。

2.6 细胞活力检测

3月龄和28月龄小鼠骨髓原代细胞的活力使用0.4%（质量∶体积，g∙mL-1）台盼蓝溶液进行检测。在4 ℃条件下放置过夜后，0.4%台盼蓝溶液被加入到细胞悬液中染色2 min。在显微镜下，死细胞呈现蓝色、增大和暗淡特征，而活细胞保持球形、透明和光亮。细胞活力通过活细胞数目除以活细胞与死细胞的总数计算得到。在共培养系统中，CCK-8细胞活力试剂盒（G021-1，南京建成生物工程研究所）用于检测CD8+ T细胞活力，检测方法参考制造商的说明书并做适当改善。随后，细胞吸光度（OD）通过酶标仪（BioTek，美国）读数。

2.7 转录组分析

骨髓和结肠组织的RNA使用TRIzol（mf034-01，聚合美生物科技有限公司）提取。在Nanodrop 2000（Thermo Fisher Scientific）、Agilent Analyzer 5300（Agilent，美国）和1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量和浓度后，通过Oligo（dT）磁珠孵育来富集信使RNA（mRNA），以进行转录组分析。RNA质量的结果展示在附录A图S1中。

使用裂解缓冲液处理样品，将mRNA随机打断成300 bp左右的小片段，然后通过磁珠分离mRNA。富集的短mRNA使用随机引物反转录成双链互补DNA（cDNA）。cDNA使用末端修复混合液修复成平末端，产物通过聚合酶链反应（PCR）扩增15个循环。目标PCR产物通过2%的琼脂糖凝胶电泳进行回收，使用TBS380（Promega，美国）进行定量，并基于统一的标准进行混匀。混合物使用桥式PCR扩增生成簇，然后通过Illumina平台进行序列读取。产生的原始数据在美吉云平台（https://cloud.majorbio.com/）进行处理和分析。差异基因的表达通过内置的RSEM软件进行计算。差异基因的富集分析通过基因本体（GO）注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库完成。

2.8 实时荧光定量PCR检测基因表达

逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测基因表达的方法参考已有文献[23]。简而言之，组织RNA使用TRIzol提取。使用氯仿分离和异丙醇沉淀RNA后，获得RNA并使用75%乙醇清洗。干燥后，使用焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解RNA。根据统一的20 μL、1000 ng RNA的标准，所有样本使用商业SuperFast qPCR RT试剂盒（MF012，聚合美生物科技有限公司）反转录生成cDNA。样品中靶基因的mRNA表达水平通过商业化的实时荧光定量试剂盒（MF797-01，聚合美生物科技有限公司）和相应的引物进行检测，检测过程使用ABI QuantStudio5系统（Thermo Fisher Scientific）。引物使用DNAman5.0软件（Lynnon Biosoft，美国）设计，引物序列已在附录A表S1中列明。引物在生工生物技术有限公司（上海）合成。以GAPDH作为参照，相对基因表达水平使用2-ΔΔCT法进行计算，其中CT是周期阈值。

2.9 结肠食糜中艰难梭菌绝对丰度

检测结肠食糜中产毒素艰难梭菌的丰度。使用商业粪便DNA试剂盒（D4015-01*, OMEGA，美国）提取定量食糜。然后，使用RT-qPCR法获取TcdB的特异性引物对应食糜的CT值，引物已在附录A表S1中列明。为了计算艰难梭菌的数量，建立了用RT-qPCR方法检测CT值和细菌数量的标准曲线。简单来说，PCR产物被克隆到携带氨苄抗性的pESI-T质粒中并转化到感受态大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株中。携带氨苄抗性的大肠杆菌使用含氨苄的Luria‒Bertani（LB）琼脂固体培养基进行选择，并在含氨苄的液体LB培养基中培养。提取固定体积的大肠杆菌溶液的DNA并通过前文概述的方法进行RT-qPCR检测。同时，大肠杆菌的浓度通过梯度稀释和LB固体培养基培养计数确定。食糜中艰难梭菌的总量通过上述标准曲线进行计算得到。

2.10 脂多糖（LPS）和白介素（IL）-17A水平的检测

血浆中LPS的水平通过商业的鼠LPS酶联免疫试剂盒（CSB-E13066m，武汉华美生物）检测。血浆和结肠组织中的IL-17A含量使用鼠IL-17A酶联免疫试剂盒（CSB-E04608m，武汉华美生物）进行检测。在检测结肠组织前，依照制造商的说明书，将组织在PBS中按照1∶1000（g∶μL）比例进行匀浆。匀浆样品中蛋白浓度使用二辛可宁酸（BCA）蛋白检测试剂盒（P0012，碧云天）进行检测，并用于IL-17A浓度定量。

2.11 苏木精-伊红（HE）和免疫组织化学染色

用于制作切片的样品组织使用4%多聚甲醛固定。对于骨髓切片，骨组织需使用EDTA脱钙液（GP1013，赛维尔）进行软化。随后的切片制备和苏木精-伊红染色方法参考已有文献[24‒25]。对于免疫组织化学（IHC）染色，复水化处理的组织在山羊血清封闭组织30 min后，使用抗IL-17A兔抗（26163-1-AP, Proteinteck，美国）或抗髓过氧化物酶（MPO）兔抗（GB11224-100，赛维尔）在4 ℃孵育过夜。然后，组织使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG（SE134，赛维尔）在室温孵育2 h，随后使用3,3′-二氨基联苯胺（DAB）工作液（DA1010，赛维尔）染色2 min。PBS再次清洗后，对切片封片。苏木精-伊红和免疫组织化学染色的切片使用奥林巴斯BX53显微镜（Olympus Corporation，日本）进行观察和拍照。

2.12 统计分析

所有的数据被呈现为平均值±标准误（SEM）。数据的统计分析使用GraphPad（version 9.0.1）软件完成。Student T检验用于两组的对比检验。单因素方差分析（ANOVA）和事后Tukey多重比较分析用于检验三组或更多组之间的区别。P < 0.05代表有显著差异。

3 结果

3.1 衰老骨髓呈现出增加的多形核髓源性抑制细胞和减少的骨小梁数量

为了探究骨髓衰老中的变化，我们首先通过苏木精-伊红染色分析了3月龄、12月龄、18月龄、24月龄和28月龄小鼠股骨近端骨骺组织病理学特征[图1（a）]。最明显的结构改变是，年轻小鼠（3月龄）和中年小鼠（12月龄）拥有数量丰富的骨小梁。但与年轻小鼠相比，老年鼠和极老小鼠中骨小梁数量显著下降[P < 0.01，图1（a）]。除了结构的改变，极老小鼠（28月龄）中分离的原代骨髓细胞呈现出与年轻小鼠相同的细胞数量[P > 0.05，附录A中图S1（a）]，但与年轻小鼠相比细胞活力呈下降趋势[0.05 < P < 0.1，附录A中图S1（b）]。

为了进一步分析衰老过程中骨髓免疫细胞亚群的变化，我们设计了一组包含41种免疫细胞和造血干细胞标志性蛋白的抗体组合，通过质谱流式技术聚类和注释到34个细胞亚群[图1（b）]。34个亚群被注释为髓源性抑制细胞、单核细胞/巨噬细胞、B细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、自然杀伤（NK）细胞、树突细胞（DC）和造血干细胞[图1（c）]，每个亚群的标志性蛋白的信号强度以热图呈现[图S1（b）]。很明显，髓源抑制性细胞能够被进一步分为13个多形核髓源性抑制细胞亚群和2个单核细胞样（M）髓源性抑制细胞亚群[图1（c）；附录A中图S1（c）]，其中多形核髓源性抑制细胞中的C05、C07、C08亚群的相对丰度在衰老过程中明显增加[P < 0.05，图1（d）~（f）]，而C12和C15亚群的相对丰度显著降低[P < 0.05，图1（g）~（h）]。相比而言，除了循环单核细胞亚群C29丰度在28月龄小鼠出现显著增加[P < 0.05，图1（j）]外，其他多形核髓源性抑制细胞亚群C06、C09、C10、C11、C13、C14、C16、C17和单核细胞样髓源性抑制细胞亚群C21和C22，以及造血干细胞亚群C25和其他细胞类型均未呈现出明显的丰度差异[P > 0.05，图1（i）和附录A中图S2（a）]。

为了确认骨髓中多形核髓源性抑制细胞的增加，我们评估了骨髓组织中多形核髓源性抑制细胞的标志蛋白CD11b [图1（k）]和Wfdc17 [图1（k）~（l）]的基因表达水平，发现Wfdc17在极老小鼠（28月龄）骨髓中表达增加[P < 0.05，图1（l）]。总的来看，这些结果表明，多形核髓源性抑制细胞群体显著增加是骨髓衰老的一个特征。

3.2 多形核髓源性抑制细胞的增加与骨髓衰老密切相关

为了评估增加的多形核髓源性抑制细胞群体对骨髓免疫功能的影响，我们使用高通量测序对比了年轻小鼠（3月龄）和极老小鼠（28月龄）的骨髓转录谱[图2（a）]。骨髓RNA的完整性证实了转录组数据的可靠性[附录A中图S2（c）]。正如火山图[图2（b）]所示，衰老骨髓中564个基因上调，268个基因出现下调。

为了确认转录组结果，我们使用实时荧光定量PCR确认了一些差异基因的表达水平[附录A中图S3（a）]，其中Ugt1a5、Reg3g、Cdh20、Exosc6结果与转录组分析一致。根据对差异基因的KEGG通路富集[图2（c）]和GO富集[图2（d）]分析，与年轻鼠（3月龄）相比，一些免疫反应相关的通路在极老小鼠（28月龄）骨髓中明显富集，包括KEGG分析中的原发性免疫缺陷、病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体互作、细胞因子-细胞因子受体互作、T细胞受体信号通路、Th17细胞分化通路、细胞黏附分子、趋化因子信号通路、补体和凝血级联反应[图2（c）]，以及GO分析中的免疫球蛋白产生、免疫反应分子介质的产生、免疫球蛋白复合物及循环[图2（d）]。

为了确认免疫功能的紊乱，我们测定了年轻（3月龄）、老年（24月龄）和极老小鼠（24月龄）骨髓中的一些差异基因的表达，包括Il21、CD33、CD3g、Bcl2a1b和HDAC5 [‍图2（e）‍]。Il21、Bcl2a1b、CD33在老年鼠和极老小鼠骨髓中显著升高[P < 0.05，图2（e）]，而CD3g的增加没有达到显著差异的水平[P > 0.05，图2（e）]。同时，相比于老年鼠和极老小鼠，HDAC5在年轻小鼠骨髓中表达较低[P < 0.05，图2（e）]。

此外，骨髓多形核髓源性抑制细胞对骨髓免疫功能的影响通过与CD8+ T细胞共培养实验进行评价。结果发现，无论与来自骨髓还是血液中的多形核髓源性抑制细胞共培养，CD8+ T细胞的活力都表出现显著的降低[P < 0.05，图2（f）]。同时，CD8+ T细胞分泌穿孔素的能力被多形核髓源性抑制细胞抑制[P < 0.05，图2（g）]，这在与骨髓来源的多形核髓源性抑制细胞共培养时表现更为明显。这些发现进一步确认了多形核髓源性抑制细胞的身份，证明在衰老过程中骨髓的多形核髓源性抑制细胞增加导致了免疫抑制。

3.3 衰老骨髓的单细胞转录组测序呈现增加的多形核髓源性抑制细胞丰度和相关免疫功能的改变

为了解释多形核髓源性抑制细胞的变化，我们使用拟时序分析推断了造血干细胞的分化轨迹。如图S2（b）所示，与年轻小鼠（3月龄）骨髓造血干细胞相比，极老小鼠（28月龄）骨髓造血干细胞（C25）倾向于经由C21和C05亚群分化为C07、C08和C29亚群。如图2（c）所示，高通量测序结果也展示了调节造血和细胞发育过程的差异基因，KEGG富集分析表明这些差异基因参与造血干细胞谱系和MAPK信号通路。为了确认髓源性抑制细胞和多形核髓源性抑制细胞群体的变化，我们使用一组已在公共数据库中发布的单细胞转录组数据以重新分析这些亚群丰度。如图3（a）所示，1月龄、6月龄、20月龄小鼠骨髓的UMAP图分别呈现出19个、21个和17个细胞亚群。我们基于与质谱流式相同的标志性蛋白进行了进一步分析，这些蛋白的基因表达水平展示在UMAP图中[附录A中图S3（c）~（e）]。结果表明，髓源性抑制细胞和多形核髓源性抑制细胞亚群被分别识别出来，且它们的丰度在老年鼠（20月龄）中增加[图3（b）]。在多形核髓源性抑制细胞亚群中，C07亚群呈现最高的丰度，其次是C05亚群[图3（b）]。与质谱流式的结果一致，循环单核细胞C29的丰度也在20月龄小鼠中增加[图3（b）]。当我们将总的髓源性抑制细胞和多形核髓源性抑制细胞在UMAP上可视化时，发现大多数髓源性抑制细胞和多形核髓源性抑制细胞分布在先天免疫性细胞中，包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、粒细胞、巨噬细胞和单核细胞[图3（c）]；其中，中性粒细胞在这三个阶段当中均是主要的分布群体。在1月龄、6月龄和20月龄UMAP图中，总的髓源性抑制细胞和C05、C07、C08、C12、C15多形核髓源性抑制细胞亚群，以及C29循环单核细胞亚群的分布均呈现在附录A图S3（b）和（f）~（k）中。

对于中性粒细胞，我们将20月龄小鼠骨髓基因对比6月龄小鼠进行了基因集富集分析。根据结果，参与补体[图3（d）]、炎症反应[图3（e）]、IL6-JAK-STAT3信号通路[图3（f）]、IL2-STAT5信号通路[图3（g）]、干扰素α信号通路[图3（h）]、干扰素γ反应[图3（i）]、TGF-β信号通路[图3（j）]、介导NF-κB的TNFα通路[图3（k）]被富集，并且这些可能参与调控免疫反应的通路均被上调。

3.4 增加的多形核髓源性抑制细胞增强老年鼠对艰难梭菌的易感性

基于多形核髓源性抑制细胞的免疫抑制能力，我们使用艰难梭菌VPI 10463感染实验进一步探究衰老过程中骨髓增加的多形核髓源性抑制细胞是否改变了髓外组织的免疫反应[图4（a）]。艰难梭菌感染后，3月龄组小鼠的体重没有受到明显的影响（P > 0.05），然而24月龄组小鼠呈现体重降低的趋势[0.05 < P < 0.1，图4（b）]。同时，24月龄+艰难梭菌组小鼠体重也显著低于3月龄+艰难梭菌组小鼠[P < 0.05，图4（b）]。图4（c）中结肠组织的形态特征也表明了24月龄老年小鼠对艰难梭菌的易感性，呈现出明显的炎性区域。此外，血浆LPS水平在艰难梭菌感染后也显著增加[P < 0.01，图4（d）]，然而这种增加在3月龄年轻小鼠中没有出现[P > 0.05，图4（d）]。

为了确认多形核髓源性抑制细胞在艰难梭菌感染中扮演的角色，我们使用流式细胞仪检测了骨髓、血液和大肠组织中CD11b+细胞和多形核髓源性抑制细胞的比例。在骨髓中[附录A中图S4（e）~（f）]，艰难梭菌感染后CD11b+细胞在3月龄组小鼠增加，但是24月龄小鼠没有呈现类似的变化，血液中也没有出现此类变化[图S4（e）~（f）]。此外，相比于3月龄小鼠，多形核髓源性抑制细胞在骨髓[图S4（e）和（g）]和血液[图S4（f）和（h）]中占总CD11b+细胞的比例随着衰老显著增加（P < 0.05），在感染后也是如此，特别是在骨髓组织中[P < 0.05，图4（g）]。

关于这两类细胞在大肠中的情况，有意思的是，CD11b+细胞占比在艰难梭菌感染后降低，特别是在3月龄小鼠中[图4（i）和图S4（h）]。类似于在骨髓和血液中的结果，多形核髓源性抑制细胞在24月龄小鼠大肠中显著增加，在感染后呈现出下降的趋势[0.05 < P < 0.1，图4（j）和图S4（h）]。为明确多形核髓源性抑制细胞在艰难梭菌感染中的角色，我们也对骨髓和结肠中髓源性抑制细胞和多形核髓源性抑制细胞的标志性蛋白的基因表达水平进行了检测[图5（a）和（b）]。如图5（b）所示，相比于3月龄+艰难梭菌组小鼠，24月龄+艰难梭菌组小鼠Wfdc17的表达显著升高（P < 0.01）。综上所述，这些结果表明，年轻小鼠骨髓来源的多形核髓源性抑制细胞可能经由血液转运到结肠，以缓解艰难梭菌感染引起的炎症。而衰老导致的病原易感性增加，可能要归咎于增加的多形核髓源性抑制细胞输出到结肠所带来的免疫抑制效应，这种细胞在感染后减少输送并积累在骨髓中。

为了进一步证明以上假设，我们进一步检验了结肠[图5（a）]和骨髓[图5（b）]中参与免疫反应的一些基因的表达情况。在骨髓中，相比于3月龄小鼠，24月龄小鼠表现出不显著的CCL5基因表达的增加[P > 0.05，图5（b）]。相比于3月龄+艰难梭菌感染组小鼠，24月龄+艰难梭菌感染组小鼠CXCL5和CCL8基因的表达水平显著增加[P < 0.05，图5（b）]。在结肠组织也发现类似结果[图5（a）]，衰老引发的参与免疫调控基因的表达，在艰难梭菌感染后也出现显著变化。24月龄+艰难梭菌感染组小鼠结肠组织中TNF-α、IL-10、IL-12a、IL-22和IFN-γ的基因表达水平均显著高于3月龄+艰难梭菌感染组小鼠[P < 0.05，图5（a）]。尽管IL-17A的基因表达不够显著，但酶联免疫法检测到的IL-17A含量和免疫组织化学方法检测到Th17细胞的数量，无论有没有艰难梭菌感染，均随年龄增加而显著增加[P < 0.05，图5（c）~（e）]。同时，24月龄+艰难梭菌感染组小鼠结肠组织中性粒细胞的数量也显著高于3月龄+艰难梭菌感染组小鼠[P < 0.05，图5（f）和（g）]。结合年轻和老年小鼠在艰难梭菌感染后相同的载菌量[P < 0.05，图5（h）]，结果表明被抑制的黏膜防御功能、降低的从骨髓输送到结肠的多形核髓源性抑制细胞数目和由此导致的结肠炎症可能是老年群体对艰难梭菌易感的原因。

3.5 清除衰老骨髓中多形核髓源性抑制细胞显著降低粪便中艰难梭菌载量和老年鼠的易感性

为进一步确认骨髓增加的多形核髓源性抑制细胞在老年小鼠易感艰难梭菌中的功能，我们通过腹腔注射抗Gr-1抗体清除了多形核髓源性抑制细胞[图6（a）]。24月龄老年鼠骨髓[P < 0.05，附录A中图S5（d）和（e）]和血液[P < 0.05，附录A中图S5（f）和（g）]中CD11b+细胞比例显著增加，但大肠中没有受到明显的影响[附录A中图S5（h）和（i）]。同时，骨髓[图6（b）和（c）]和大肠[图6（e）；图S5（h）]中多形核髓源性抑制细胞占CD11b+细胞的丰度在抗Gr-1组小鼠中显著下降（P < 0.05），而血液中的保持不变[P > 0.05，图6（d）和图S5（f）]。使用艰难梭菌感染小鼠后，多形核髓源性抑制细胞占CD11b+细胞的丰度在骨髓和大肠中持续降低[P < 0.05，附录A中图S5（c）~（h）]，然而老年鼠粪便中艰难梭菌载量在抗Gr-1抗体注射后也显著降低[P < 0.05，图6（f）]。此外，使用抗Gr-1抗体清除多形核髓源性抑制细胞的小鼠在艰难梭菌感染后，血浆LPS水平显著降低[P < 0.05，图6（g）]。

为全面评估在老年鼠中预先清除多形核髓源性抑制细胞对结肠功能的影响，我们在感染后进行了结肠组织的高通量测序。RNA的完整性证实了转录组数据的可靠性[图S6（i）]。如图6（h）所示，与24月龄+艰难梭菌组小鼠相比，抗Gr-1 +艰难梭菌组小鼠结肠有351个基因表达上调，732个基因表达下调。GO [图6（i）]和KEGG [图6（j）]富集分析表明，差异表达的基因主要调控免疫球蛋白、吞噬作用、补体激活、细胞识别和免疫反应（包括抗原处理、递呈和IL-17信号通路）。检测IL-17信号通路中的基因表达，发现促炎细胞因子IL-17A、IL-17D、IL-1β、IL-6和IL-17re的基因表达水平在抗Gr-1+艰难梭菌组均显著降低[P < 0.05，图6（k）]。结肠组织中IL-17A含量在抗Gr-1 +艰难梭菌组中也显著降低[P < 0.01，图6（l）]。这些结果表明，使用抗Gr-1抗体预处理老年小鼠以清除多形核髓源性抑制细胞，能够缓解艰难梭菌感染以及由其引发的结肠炎症。

4 讨论

衰老伴随免疫防御功能的下降，这意味着老年人感染时常表现出危及生命的病理反应。这在新冠流行期间表现较为明显[26‒27]。为了实现健康衰老，有必要通过干预免疫衰老增强对病原的抵抗能力，降低异常的炎症反应。作为中枢免疫器官，骨髓通过输出免疫细胞和相关因子调控机体的免疫稳态[28‒29]。然而，仅有少量研究关注了衰老过程中骨髓免疫细胞生成的改变和它们对外周器官免疫功能的影响。

4.1 衰老促进骨髓多形核髓源性抑制细胞的生成

作为一种重要的研究工具，质谱流式技术实现了免疫细胞谱系的准确识别和各亚群之间功能联系的分析 [30‒31]。使用这一工具，我们发现衰老骨髓中多形核髓源性抑制细胞群体的主要亚群的丰度陡然升高[图1（d）~（f）]。同时，年轻和老年小鼠骨髓单核细胞转录组数据的重分析也与这一结果相一致[图3（b）]。流式细胞术结果进一步确认了老年小鼠骨髓中更高丰度的多形核髓源性抑制细胞[图4（e）~（g）]。综合来看，这些发现证明，在衰老过程中多形核髓源性抑制细胞的产生是增加的。

髓源性抑制细胞包括单核细胞样髓源性抑制细胞和多形核髓源性抑制细胞，它们均发挥免疫抑制功能[32]。以前的研究已经注意到了它们的免疫抑制功能，并观察到它们在病理情况下促进癌症的发生[33]，然而仅有少数几个研究报道了健康老年个体中髓源抑制性细胞丰度的变化[34]。在本研究中，我们首次使用多种方法证明，衰老过程中多形核髓源性抑制细胞输出加剧。在无肿瘤小鼠中，因为TRAIL-Rs介导的凋亡信号通路的活化，多形核髓源性抑制细胞比相应的中性粒细胞拥有更短的寿命[35‒36]。虽然样本量小且没有达到显著水平，但本研究中骨髓细胞存活率的降低[图S1（b）]也确认了多形核髓源性抑制细胞增加的特征。拟时序分析表明，骨髓中造血干细胞倾向于向多形核髓源性抑制细胞分化[图S2（c）]。

导致造血干细胞分化方向出现这一变化的驱动力可能与骨小梁的改变有关，其可以为造血干细胞提供关键的微环境，但在衰老过程中逐渐减少[37‒38]，如图1（a）所示。阻断骨髓中的IL-1通路能够修复造血干细胞的功能，也能够重建骨小梁结构[39]。因此，骨小梁结构数量的减少可能损害造血干细胞微环境，进而改变其随后的命运，使得造血干细胞向多形核髓源性抑制细胞方向分化。此外，伴随衰老的慢性炎症可能也会影响骨髓微环境并改变多形核髓源性抑制细胞的分化命运。年龄相关的炎症能够损害髓系祖细胞的分化并改变对内、外源威胁的反应[40]。在自然衰老的结肠中，增加的IL-17A含量和Th17细胞也证明了该组织的炎症状态。因此，骨髓中多形核髓源性抑制细胞的增加可能是对外周炎性信号响应和抑制潜在的过度炎症的结果[41]。

血液循环是骨髓产生细胞后转运至外周器官组织的主要途径。尽管血液中只有较少的多形核髓源性抑制细胞，它们的丰度在老年小鼠中增加[图4（j）；图S4（h）]。相似的结果在结肠中也能观察到[图4（h）；图S4（f）]。因此，可以推断从骨髓输出到大肠的多形核髓源性抑制细胞在衰老过程中增加。在人类中，多形核髓源性抑制细胞和总的髓源性抑制细胞的丰度在60~100岁的老年群体中也是增加的[42‒43]。在特发性肺纤维化病例中，血液中升高的髓源性抑制细胞被发现与肺功能呈负相关，与败血症严重程度呈正相关[44‒45]，这证明髓源性抑制细胞水平可能是疾病发展的潜在生物标志。因此，增加的髓源性抑制细胞输出可能是老年群体呈现免疫功能缺陷的原因之一。

此外，科学家普遍认为髓源性抑制细胞是未成熟的、病理活化的中性粒细胞[46]。根据单细胞转录组数据，年轻小鼠中带有髓源性抑制细胞表面标志蛋白的免疫细胞仅在中性粒细胞中存在[图3（c）]。但在中年和老年小鼠中，表达这些标志蛋白的细胞并不仅仅存在于中性粒细胞，也存在于其他免疫细胞，包括嗜酸性粒细胞、粒细胞、巨噬细胞和单核细胞群体[图3（c）]。这提示，髓源性抑制细胞是一组在抗感染和防御过程中发挥不同生理功能的异质性先天免疫细胞[47‒49]。

4.2 积聚的多形核髓源性抑制细胞扰乱骨髓免疫稳态并增加大肠对艰难梭菌的易感性

多形核髓源性抑制细胞在免疫系统中发挥刹车作用[50‒52]。在共培养过程中，来自于老年鼠骨髓和血液的多形核髓源性抑制细胞抑制了CD8+ T细胞增殖和穿孔素分泌。多形核髓源性抑制细胞和单核细胞样髓源性抑制细胞的相关研究已发现，髓源抑制性细胞能够通过局部免疫抑制促进肿瘤细胞发展和转移[36]。因此，我们推断，衰老过程中积累的多形核髓源性抑制细胞可能抑制了骨髓和外周组织中正常的免疫反应。高通量测序结果表明，多个免疫相关的通路，包括Th17细胞分化、原发性免疫缺陷和多个炎症通路，在衰老的骨髓中富集[图2（c）]，并且IL21和CD33等免疫相关的基因表达也出现明显变化[图2（e）]。同时，骨髓中HDAC5表达下降，这限制了组蛋白乙酰化，然后通过表观遗传机制调节基因表达而影响细胞分裂保真度和细胞功能[53‒54]。此外，在单细胞转录组分析中，衰老骨髓中包含多形核髓源性抑制细胞的中性粒细胞群体表现出炎症和感染相关通路的异常激活[图3（d）~（i）]。作为衰老和长寿的一个关键调节器，mTORC1信号通路也被激活。mTOR通路的过度活化导致细胞功能紊乱和免疫抑制，而mTOR抑制剂在小鼠和人中均缓解了免疫衰老[55]。因此，伴随着多形核髓源性抑制细胞增加，骨髓免疫功能也出现紊乱。综上所述，伴随多形核髓源性抑制细胞的增加，衰老扰乱了骨髓的免疫调控功能，这可能促使老年群体对病原的易感性增加。

艰难梭菌的感染在老年人中较为常见且危害严重，特别是对住院的老年人可能是致命的[56]。在本研究中，随着大肠中多形核髓源性抑制细胞的增加[图4（j）]，我们发现老年鼠也表现出对艰难梭菌的易感性的增加[图4（b）~（d）]。同时，老年鼠结肠中的促炎细胞因子表达和Th17细胞、中性粒细胞的丰度增加[图5（a）~（g）]。

Abernathy-Close等[57]也发现，衰老抑制了防御艰难梭菌感染时的先天免疫反应，并增加了IL-17A的表达。然而，与本研究一致，有研究发现老年鼠易感性的增加与艰难梭菌绝对丰度无关[58]，如图5（h）所示。这表明骨髓免疫反应和大肠黏膜免疫的抑制可能是易感性增加的关键原因。部分研究强调，年轻动物的骨髓和组织中多形核髓源性抑制细胞，可能发挥缓解过度炎症以保护组织的作用[58]。增加的多形核髓源性抑制细胞可能是响应外周炎症的结果。据报道，由内皮素α受体拮抗剂BQ123诱发的多形核髓源性抑制细胞有抗炎作用[59]。多形核髓源性抑制细胞释放的外泌体也能够缓解DSS诱发的结肠炎，并促进年轻小鼠的创伤修复[60‒61]。

因此，为了阐明多形核髓源性抑制细胞在艰难梭菌感染中的角色，我们使用了抗Gr-1抗体清除了多形核髓源性抑制细胞，这与前人研究[62‒63]中的应用方式一致。结果如图6（f）所示，多形核髓源性抑制细胞的清除降低了艰难梭菌的丰度和肠道的通透性，并抑制了IL-17信号通路的活化[图6（k）和（l）]，衰老结肠的易感性和防御功能明显改善。因此，多形核髓源性抑制细胞在老年群体对艰难梭菌易感性增加方面发挥了负面作用，其清除改善了衰老结肠黏膜的免疫反应。至于为何多形核髓源性抑制细胞在艰难梭菌感染后，不再从骨髓输出经血液到达大肠以控制结肠炎，我们推测骨髓中异常升高的趋化因子CCL8和CXCL5可能是原因之一。然而，需要特别指出的是，在本研究中清除多形核髓源性抑制细胞使用的抗Gr-1抗体也能够同时清除单核细胞样髓源性抑制细胞[64]，这是本研究的一个不足之处。在未来的研究中，应当分离多形核髓源性抑制细胞的不同亚群以评估它们对免疫衰老的作用，而非使用总的多形核髓源性抑制细胞开展研究，特别要关注抑制结肠黏膜免疫防御功能进而导致对病原微生物易感性增加的亚群。

5 结论和意义

简而言之，老年小鼠骨髓中的细胞倾向于向多形核髓源性抑制细胞分化，增加的多形核髓源性抑制细胞从骨髓输出后使得小鼠对艰难梭菌易感性升高。应当开展延缓免疫衰老的基础研究，进一步探讨骨髓结构降解和微环境变化对造血干细胞命运和功能的影响，明确其分子机制，进而寻找潜在的干预途径。多形核髓源性抑制细胞可能是一个潜在的干预免疫衰老的临床靶点，这对于衰老性疾病的治疗（如抗体治疗和干细胞治疗）具有重要的研究价值。本研究不仅为衰老引起的病原易感性增加提供了理论基础，还为未来靶向性营养干预和预防措施的发展指明了方向。

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