用于生物分子和单细胞高通量实时筛选的微流控条形码生物芯片

邱教艳 ,  梁延博 ,  王超 ,  于洋 ,  张宇 ,  刘宏 ,  韩琳

工程（英文） ›› 2025, Vol. 46 ›› Issue (3) : 140 -157.

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工程（英文） ›› 2025, Vol. 46 ›› Issue (3) : 140 -157. DOI: 10.1016/j.eng.2024.06.016
研究论文

用于生物分子和单细胞高通量实时筛选的微流控条形码生物芯片

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Microfluidic Barcode Biochips for High-Throughput Real-Time Biomolecule and Single-Cell Screening

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摘要

生物芯片中生物分子和单细胞的实时筛选在疾病预测与诊断、细胞分析及生命科学研究中具有至关重要的作用。微流控集成的条形码生物芯片通常包括条形码阵列、样品加载层和反应单元阵列芯片。本文回顾了用于生物分子和单细胞高通量筛选的微流控条形码生物芯片的分析方法，分析对象涵盖了蛋白质生物标志物、微小RNA（miRNA）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、单细胞分泌蛋白、单细胞外泌体以及细胞相互作用等。首先，我们概述了当前的高通量检测和分析方法的研究进展。随后，详细讨论了用于生物分子和单细胞检测的微流控设备的最新进展，并强调了这些设备的优势与局限性。本文重点介绍了微流控条形码生物芯片的研究与开发，涵盖其自组装基底材料及其在生物分子和单细胞检测中的具体应用。最后，我们展望了微流控条形码生物芯片技术的未来前景与挑战，旨在为其在医疗诊断、治疗及其大规模商业化应用中的进一步发展提供参考与支持。

Abstract

The real-time screening of biomolecules and single cells in biochips is extremely important for disease prediction and diagnosis, cellular analysis, and life science research. Barcode biochip technology, which is integrated with microfluidics, typically comprises barcode array, sample loading, and reaction unit array chips. Here, we present a review of microfluidics barcode biochip analytical approaches for the high-throughput screening of biomolecules and single cells, including protein biomarkers, microRNA (miRNA), circulating tumor DNA (ctDNA), single-cell secreted proteins, single-cell exosomes, and cell interactions. We begin with an overview of current high-throughput detection and analysis approaches. Following this, we outline recent improvements in microfluidic devices for biomolecule and single-cell detection, highlighting the benefits and limitations of these devices. This paper focuses on the research and development of microfluidic barcode biochips, covering their self-assembly substrate materials and their specific applications with biomolecules and single cells. Looking forward, we explore the prospects and challenges of this technology, with the aim of contributing toward the use of microfluidic barcode detection biochips in medical diagnostics and therapies, and their large-scale commercialization.

关键词

高通量 / 微流控条形码生物芯片 / 单细胞分析 / 生物分子

Key words

High-throughput / Microfluidic barcode biochip / Single-cell analysis / Biomolecules

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邱教艳,梁延博,王超,于洋,张宇,刘宏,韩琳. 用于生物分子和单细胞高通量实时筛选的微流控条形码生物芯片[J]. 工程（英文）, 2025, 46(3): 140-157 DOI:10.1016/j.eng.2024.06.016

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1 引言

“生物分子”通常指生物体中天然存在的分子，是生命的基本单位。它们能反映生物体的信息及生理状态，主要包括小分子（甾醇、维生素、激素、碳水化合物）、单体（氨基酸、核苷酸、磷酸）和聚合物（蛋白质、核酸、多糖）。目前，表型作为基因功能的物理表现形式，已引起广泛关注并成为医学研究的焦点。与此同时，细胞内蛋白和膜蛋白也备受关注，它们不仅参与转录、翻译、代谢、生长、黏附、信号传导等多种生物学过程，还构成单细胞的结构基础。单细胞分泌蛋白主要包括细胞因子、生长因子、激素，这些分子能够介导细胞通信，并调控细胞、组织和器官活动。此外，一些分泌蛋白在肿瘤发生发展中具有双重作用，既能抑制肿瘤进展，也能促进肿瘤扩散。因此，对生物分子和单细胞的监测在临床诊断、分子生物学研究及疾病的早期治疗和诊断中至关重要[1]。

此前的研究已开发多种基于大分子和单细胞的检测方法。传统检测方法具有重要价值，如酶联免疫吸附法（ELISA）[2]、聚合酶链反应（PCR）[3]、质谱法[4]、蛋白质印迹[5]等。这些方法虽然准确，但操作复杂且需专业人员执行[6‒7]，从而限制了其应用范围。为解决这些局限，满足快速、高灵敏度、低检测限的检测需求，电化学[8]、荧光[9]、拉曼光谱[10]、微流控[11]等技术应运而生并得到广泛应用。然而，这些方法多数仍局限于单一生物分子的研究，难以满足疾病综合诊断、检测和治疗的需求。尤其是同时检测多样品中的多个潜在靶点时，不仅会增加实验成本，还提高了样品的需求量，同时降低了检测效率。相比之下，高通量分析技术可在单次检测中同时检测多个样品中的多个靶点。与传统方法相比，高通量技术具有小型化、低消耗、处理快、高通量及无需昂贵分析设备等独特优势。

近年来，微流控技术凭借高通量、快速、低成本、低试剂消耗等优势[12]，能够精确控制液体体积并在短时间内完成大量检测，因而适用于复杂生物样本的高通量分析。这些技术包括液滴微流控[13]、点阵微流控[14]和微流控条形码技术[15‒16]。其中，液滴微流控技术可精确控制皮升至纳升级的离散液滴[17]，目前广泛应用于DNA鉴定与测序、免疫测定、临床诊断、药物筛选等领域[18]。Xiao等[19]提出一种创新的液滴DNA步行器平台技术，利用二维（2D）条形码对液滴进行编码，从而实现快速、高通量、一步同步的细菌鉴定[图1（a）]。尽管液滴微流控技术已取得显著进展，但其在实际应用中仍面临着稳定性有限、成本高等挑战，并且通常局限于特定的微流控实验室环境。

微流控点阵技术通过在功能化载玻片上沉积DNA或蛋白质微点实现[20]。该方法具有优异的灵敏度和特异性，已广泛应用于药物筛选、蛋白质相互作用及蛋白质组学研究[21]。Chi等[22]提出了一种基于微阵列的定量检测平台，并报道了该平台的高灵敏度和高稳定性存储性能[图1（b）]。然而，微流控点阵技术仍存在一些局限性，如检测重复性低、制备过程复杂、检测灵敏度低、动态检测范围有限、存在信号拖尾效应及点阵不均匀等问题，这些可能导致分析物交叉污染和信号读取不准确[20,23]。相比之下，微流控条形码检测技术的原理是将抗体或探针条形码固定在功能性玻璃基底上构成检测平台，因而在操作简便性和多重检测能力方面更具优势。迄今为止，微流控条形码检测技术已被广泛应用于生物标志物筛选，如图1（c）[24]所示，以及单细胞分析（单细胞分泌蛋白异质性、单细胞外泌体异质性等）[15‒16,25‒28]。

随着纳米技术的不断发展，复杂的分析功能得以微型化并整合到单一检测平台上。这一进展促进了微流控系统与多种技术结合，使其在生物分子研究和单细胞分析中得到广泛应用[16,25‒26]。微流控条形码技术与纳米材料和聚合物材料的整合，显著解决了其他技术常遇到的局限性，如通量低、再现性差、制备困难、灵敏度低、动态检测范围有限、存在拖尾效应及点阵列不均匀等，这些问题往往导致分析物交叉污染和信号读取不准确。多通道结构的设计能够将测试样品分为多个独立的反应单元，确保样品互不干扰，从而实现高通量、高灵敏度和快速检测。微流控条形码技术的优势主要体现在两方面：第一，纳米材料或聚合物材料能以单一形式在微流控条形码基底上均匀自组装，保证检测的一致性和稳定性；第二，纳米材料具有催化性能、光学特性、高比表面积、Förster共振能量转移（FRET）效应及功能简单等优势，这些特性可提高捕获率、增强信噪比、降低检测限并提高灵敏度[29‒30]。总体而言，微流控条形码检测技术能够实现多种生物标志物的同步检测，具有快速、高效、准确、灵敏的显著优势。这一创新不仅为未来医学研究提供了坚实的技术支撑，也为未来临床诊断和精准医疗开辟了新的发展道路。

随着微流控技术的不断发展，近年来已有多篇综述型论文系统总结并评估该技术的潜在应用。Chen等[31]全面概述了基于纳米材料的微流控技术进展，重点关注光学、电学、磁学和声学方面的应用；Li等[32]对于微流控芯片在分子诊断中核酸检测的最新进展进行了全面综述；Zhang等[33]综述了液滴微流控技术在生物分子中的应用；而Qin等[34]专注于纸基微流控芯片在快速分子检测中的应用。然而，专门针对微流控条形码技术在生物分子和单细胞中应用的综合性论述尚未见报道。

随着微流控条形码技术的广泛应用及其在高通量检测能力方面的突破性进展，其在生物分子和单细胞分析领域展现出广阔前景[26‒27]。本文在线检索了过去20年间发表的与微流控高通量和微流控条形码相关的文章，结果如图2（a）和（b）所示。研究发现，微流控条形码技术正受到越来越多的关注，但其应用与发展仍有较大空间。本文综述了微流控条形码生物芯片在生物分子和单细胞高通量检测中的主要优势和最新进展，主要包括以下内容：①讨论基于微流控的常见高通量分析技术（如液滴微流控、纸基微流控和微流控阵列）及其各自的优缺点；②分析微流控点阵技术和微流控条形码技术的优缺点；③总结用于自组装微流控条形码生物芯片基底的材料并比较其优缺点；④总结基于微流控条形码技术的高通量检测在生物分子和单细胞分析领域的应用进展[图2（c）]；⑤阐述这些领域的最新挑战和未来展望。总体而言，本文综述了微流控条形码生物芯片在生物分子和单细胞高通量检测中的应用并进行系统性总结，为未来生物诊断和研究工作提供了重要参考与启示。

2 微流控条形码生物芯片自组装基底材料

微流控条形码生物芯片由三部分组成：微流控芯片自组装基底、聚二甲基硅氧烷（PDMS）抗体加载层芯片和样品加载层芯片[16,35]。其中，微流控自组装基底具有支持图案化抗体条形码以识别靶分子的能力，这在微流控条形码生物芯片检测的整个过程中至关重要。本文重点讨论了几类常用的微流控条形码生物芯片自组装基底材料，包括聚-L-赖氨酸（PLL）、纳米材料和纳米复合材料。这些材料具有优异的理化特性，如良好的生物相容性、稳定性、光学性能和易于功能化[36‒38]，为微流控条形码生物芯片的构建和应用提供了坚实基础。本文讨论了微流控条形码生物芯片中的代表性材料，并重点阐述其在芯片应用中的显著优势。

2.1 聚-L-赖氨酸

PLL是一种可食用、具有水溶性、可生物降解且无毒的阳离子聚合物，广泛应用于药物递送、生物降解、凝胶吸附、食品保鲜以及药物和基因递送载体等生物医学及其他相关领域[39‒42]。由于其带正电荷，PLL能够与带负电荷的DNA探针结合，从而识别靶标[43]。此外，PLL还可作为蛋白质负载的理想支架，凭借其优异的理化特性支持多种生物检测应用[44]。基于这些优势，Fan团队[25‒26,45]和Lu团队[46‒47]使用PLL自组装芯片固定抗体条形码，实现了单细胞分泌蛋白和单细胞外泌体的识别[图3（a）和（b）]。我们团队[48]开发了一种新型的PLL集成石墨烯场效应晶体管（PGFET）生物传感器，用于RNA检测，为癌症诊断和疾病筛查提供了新的技术支持[图3（c）]。此外，我们[49‒50]还提出了一种氧化石墨烯（GO）和PLL自组装的微流控双层芯片，实现对微小RNA（miRNA）的高通量检测[图3（d）]。

2.2 纳米材料

纳米材料因其比表面积大、导电性高、化学稳定性好、易于功能化、良好的生物相容性、具有FRET效应及可生物降解等特性[51‒52]，广泛应用于疾病监测、环境污染和食品安全等领域。在微流控条形码传感平台中，纳米材料在微流控基底上的局部自组装，显著提高了微流控条形码生物芯片在生物分子和单细胞的高通量检测性能[15,28,35]，其主要贡献体现在三个方面：①纳米材料表面积大且具有活性官能团，有助于更高效地富集靶标；②纳米材料具有独特的光学、电学和等离子体特性，有助于提高检测灵敏度并降低检测限；③FRET效应可减少非特异性吸附，从而提高信噪比和灵敏度。

研究表明，目前仅有有限种类的材料被整合到微流控条形码生物芯片系统的抗体条形码图案中。本文重点关注GO、氧化石墨烯量子点（GOQDs）、量子点（QDs）、金属纳米颗粒和氧化锌（ZnO），并探讨它们在微流控条形码生物芯片中的应用。GO具有优异的荧光猝灭能力、良好的生物相容性、大接触面积、优异的水分散性和易于表面改性等特性，被认为是一种极具前景的2D纳米材料[53‒54]。GO的2D表面通过π-π相互作用、静电吸附或氢键作用，与特定的生物分子发生强非共价相互作用，从而为生物分子检测提供有价值的信息[54‒55]。在微流控条形码生物芯片中，GO通过静电引力自组装到功能化玻璃基底上，随后通过PDMS通道层加载抗体或DNA探针，从而构建微流控条形码阵列，用于抗体分析或DNA分析。我们团队[49,56‒57]基于GO开发了自组装微流控条形码生物芯片，实现了核酸和其他标志物的检测。尽管已有大量研究证明GO可在微流控传感平台中自组装，但目前在微流控条形码生物芯片平台中的应用仍相对有限，如图4（a）[49]所示。

GOQDs与GO都具有无毒、可溶、良好的生物相容性和环境友好性等优势。特别是，GOQDs的尺寸通常小于10 nm，其微小尺寸不仅降低了空间位阻，还增强了稳定性，从而有利于穿透细胞膜。基于这些特性，GOQDs被认为是药物递送及体内外生物成像的候选材料[9,58]。依托其独特优势（FRET、大比表面积、小粒径、生物相容性），我们团队[24,27,35,59]开发了一种基于GOQD自组装的微流控条形码芯片，实现了对生物分子、单细胞分泌蛋白异质性以及单细胞外泌体的高通量检测与分析[图4（b）和（c）]。该平台能够同时检测20种不同生物标志物和60个样品，显著提高了检测效率和应用潜力。

与其他荧光标记传感器相比，QDs具有明显优势。其核心特征在于，不同尺寸的QDs在单一波长激发下会发射不同波长的光，当其附着在生物基团或生物分子上时，易于通过多色荧光反应实现高效识别。基于此，Hu等[60]开发了一种微流控条形码蛋白芯片，整合了微流控的高通量检测能力和QDs的高灵敏度、多色成像能力，成功应用于血清中的生物标志物检测[图5（a）]，为蛋白芯片的实际临床应用和蛋白质组学研究开辟了新途径。

此外，ZnO与微流控技术的结合还为分析检测提供了一种有前景的新方法[61]。Liu等[62]开发了一种基于ZnO微流控阵列的蛋白质检测平台，具备高灵敏度、低成本和高通量等优势。在先前工作的基础上，Hu等[63]首次报道了一种ZnO纳米棒增强荧光微阵列芯片，利用ZnO表面的一层有机物增强捕获蛋白的负载能力，并抑制非特异性蛋白的吸附，如图5（b）[63]所示。此外，Guo等[64]通过水热法在微流控通道中直接生长ZnO纳米线，并实现癌胚抗原（CEA）和甲胎蛋白（AFP）的检测，如图5（c）所示。

2.3 纳米复合材料

纳米复合材料具有多种结构形式，如纳米花、纳米星和纳米棱柱，这些形态均是由不同尺寸的纳米材料组装而成的三维（3D）结构[65]。在微流控平台中，纳米复合材料已被广泛应用于生物标志物检测、生物成像及环境保护等领域[16,29,66]，但在微流控条形码生物芯片中应用仍相对有限。

Hogan等[67]首次实现了基于2D流体复合材料和互补金属氧化物半导体（CMOS）光子平台的三维光子超结构原位精确对准监测[图6（a）]。为通过解决实验通量低与反应时间长的局限性来提高实验效率，我们团队[16]开发了一种基于L-半胱氨酸（Lys）-金纳米颗粒（NPs）@MoS2的自组装微流控条形码生物芯片。该芯片包含10个平行通道，能够高通量且灵敏地同时检测10种蛋白质。在该微流控平台中，Lys-AuNPs@MoS2接触面积大、稳定性优异、结合位点多，可提高抗体负载密度，为临床诊断应用提供了一种很有前景的方法，如图6（b）[16]所示。Wang等[68]制备了一种表面增强拉曼散射（SERS）集成微流控芯片，用于牛奶中三聚氰胺的高通量检测[图6（c）]。为解决微流控SERS芯片在临床检测应用中的局限性，研究人员进一步设计并制备了集成银金纳米复合材料（Ag/AuNCs）SERS基底和自动采样功能的微流控SERS芯片，该芯片设计结构合理、制造简便，能够有效降低检测干扰，如图6（d）[69]所示。

目前，微流控技术可用的基底材料种类仍然有限，且成本相对较高。在现有产品中，美国赛默飞世尔科技公司生产的PLL基底（型号：P4981-001）是具有代表性的基底材料。然而，PLL等有机基底材料易受环境因素影响，不利于长期保存，从而在一定程度上影响了基底的均匀性与稳定性。相比之下，具有纳米级尺寸、自组装更均匀、保质期更长的无机材料，被认为是未来基底材料发展的重要方向。因此，如何开发出稳定、均匀、经济且适合大面积应用的基底材料仍是一个亟待解决的关键问题，这对于高性能传感芯片的持续发展至关重要。

3 用于生物标志物高通量检测的微流控条形码生物芯片

生物标志物通常是指蛋白质、基因组和代谢物等生化分子[70‒72]。它们在医学研究中常被用作生化指标，可用于表征人体系统、器官、组织、细胞和亚细胞结构。目前，测量生物标志物可研究生物体的生物过程，还可用于疾病的早期检测与诊断、预防和预后[73‒74]。因此，本节将分子生物标志物分为三类重要组别，即蛋白质、核酸和小分子，并对其特性、研究意义、优势和检测方法进行简要概述，重点探讨基于微流控条形码生物芯片技术对生物标志物的高通量检测策略。

3.1 蛋白质

蛋白质是构成生物物质基础的有机大分子，作为关键生物标志物，参与信息传递、病毒防御、细胞结构支撑和催化等一系列生物功能。已有充分证据表明，蛋白质表达异常与心血管疾病、肿瘤和癌症等病症密切相关[22,75]。因此，蛋白质生物标志物在疾病的早期诊断、治疗和预后中至关重要。临床实践中常用的蛋白质标志物检测的方法包括电化学法、荧光法、拉曼光谱法、比色法和ELISA [76‒78]。然而，这些方法往往存在耗时长、检测限高且成本昂贵等局限性[79]。为进一步降低疾病风险并提高临床应用价值，亟须开发快速、便捷地新型蛋白质标志物的筛查技术[80]。随着检测技术的不断发展，复杂的分析功能逐渐实现小型化与集成化。微流控技术已发展成为一种潜在的高通量分析技术，可在短时间内进行高通量分析，尤其适用于复杂的多生物样品，具有高通量、低样品消耗、高集成度、便于运输和低成本等优势[12]。下文将重点讨论集成微流控平台在蛋白质标志物检测中的应用进展。

纸基微流控分析装置因具有体积小、便携、可生物降解及成本低等优势，已被广泛应用于蛋白质标志物的检测[81]。Sanjayan等[82]开发了一种基于钙钛矿QD的集成纸基微流控装置，可同时检测CEA和神经元特异性烯醇化酶（NSE），具有高通量、高灵敏度和多色成像能力。Chang等[83]报道了一种低成本的3D微流控芯片，能够通过识别光子晶体珠（PCBs）的颜色实现三种蛋白质的同时检测。Zhao等[78]提出了一种基于ZnO纳米棒阵列结构的新型荧光增强策略，实现了高灵敏度的CEA检测。这些研究表明，纸基与纳米材料的结合为开发低成本、便携式的蛋白质标志物检测平台提供了新思路。

凭借高灵敏度和低检测限（LOD）等优势，微流控技术已在蛋白质分析领域得到广泛应用。其中，微流控条形码生物芯片的快速发展主要得益于其多通道设计、低样品消耗以及与纳米材料结合等优势[16,35,60]。

将具有小尺寸、高能量共振传输效率和高捕获效率的纳米材料集成到微流控芯片中，可实现对蛋白质标志物的高通量、高灵敏度和高特异性检测。Hu等[60]将微流控芯片的高通量特性与QDs的荧光特性相结合，开发出微流控蛋白芯片，为大规模临床应用提供了有价值的工具。最近，Qiu等[16]提出了一种具有数字信号输出的Lys-AuNPs@MoS2自组装微流控生物芯片，能够在短时间内同时检测10种生物标志物，如图7（a）[16]所示。在此基础上，我们团队[24,35]进一步开发了一种基于GOQDs的微流控条形码平台，可实现对60个样品和20种生物标志物的同时检测[图7（b）]。此外，我们还利用该平台研究了机械应力对人神经干细胞分化早期星形胶质细胞细胞因子释放的调控作用[59]，拓展了其在细胞生物学研究中的应用。

3.2 微小RNA

核酸包括DNA和RNA，是一类重要的生物大分子[84]。其序列携带大量遗传信息，在细胞活动中至关重要，并常被用作癌症及其他疾病的生物标志物[85‒86]。快速、高效、低成本和无创的核酸检测技术在疾病检测、评估和治疗等临床应用中具有至关重要的意义[87‒89]。核酸检测过程通常包括样品预处理、核酸提取与扩增以及信号检测[90‒91]。其中，样品预处理技术不仅用于提取核酸，同时还能避免样品中化学物质的干扰。由于样品中核酸浓度太低，无法满足检测要求，因此扩增是提高检测限和灵敏度的必要条件。医学诊断研究中常用的扩增技术包括滚环扩增（RCA）[92]、PCR [93]、链置换扩增[94]、环介导等温扩增（LAMP）[95]和基于核酸序列的扩增（NASBA）[36,96]。在信号检测环节，传统方法多依赖于电化学发光和化学发光，而PCR扩增则被公认为核酸检测的“金标准”。尽管这些方法准确性高，但仍存在设备昂贵、反应时间长、灵敏度有限、背景噪声大且操作复杂等缺点。因此，迫切需要更快速、准确且简单的核酸检测技术。近年来，研究人员已开发出许多新的核酸检测技术，包括电化学[97]、荧光[98]、拉曼光谱[99]、等温扩增[95]和微流控[91]等。其中，微流控技术凭借通量高、反应快速、成本低、灵敏度高以及可直接检测等优势已在临床诊断和食品安全等领域展现出广阔的应用前景。

基于液滴的微流控技术通过将化学物质封装并分隔在小液滴中，实现快速反应与检测[13,100]。Azizi等[101]将液滴微流控与LAMP相结合用于病原体检测。这种检测方法简单、灵敏、针对性强、快速，适用于多种生物检测场景。离心微流控芯片作为一种新型的核酸检测技术，利用离心力驱动液体流动与样品混合，避免了对开关和阀门的依赖。在临床研究中，该技术可用于血液中的标志物提取和DNA纯化[102]。Xiong等[102]开发了一种便携式离心微流控技术，能够快速、准确且同时检测七种冠状病毒。该系统无需人工参与样品收集、纯化、分离、扩增和检测过程，降低了外部干扰，并具备高灵敏度和特异性。Tian等[103]进一步报道了一种全自动离心微流控装置，该装置集成21个反应单元，能够在保持良好的灵敏度和特异性的同时实现多样品快速检测，显著提高了诊断效率。Li等[104]开发了一种拉伸驱动的微流控芯片，可通过检测反应腔内液体的颜色来判断核酸检测结果，开辟了一种简便、低成本的检测途径。

尽管传统微流控检测技术应用广泛，但仍存在制备和分析时间长、操作相对复杂等问题，这限制了其在临床与研究中的应用。相比之下，微流控条形码生物芯片因其高通量、耗时短、节省试剂和成本低等优势，在分子诊断、生物传感、生物成像、环境监测等领域得到广泛应用[49,56,105]。Yang等[105]提出了一种简单、快速、经济、稳定且可与移动设备兼容的多重条形码检测平台，其具有良好的便携性[图8（a）]。Du等[106]开发了一种集成化的微流控样品制备与检测系统，能够在单个芯片上同时处理80个样品，为即时检测奠定了良好基础。Gao等[56]基于PLL局部自组装技术构建了微流控条形码芯片平台，可同时加载60个样品，且设有50个独立通道固定探针，可实现高通量miRNA检测，其数据分析通过跨通道荧光值进行比对，大幅缩短了检测时间，如图8（b）[56]所示。在此基础上，我们团队进一步开发了一种基于纳米材料GO局部自组装的双层微流控条形码生物芯片，具有超高灵敏度、快速、廉价、可靠、低成本和高通量等特点。该生物芯片利用GO吸附单链探针、解析双链探针并结合PLL实现信号收集，从而成功应用于乳腺癌样品中miRNA的检测[49,57]，如图8（c）和（d）所示。

3.3 循环肿瘤DNA

循环肿瘤DNA（ctDNA）是指存在于癌症患者血液中、源自肿瘤的游离DNA片段。当癌细胞和肿瘤组织被新细胞取代时，这些片段就会释放出来进入血液循环。由于ctDNA来自于多个肿瘤区域（包括原发灶和克隆灶），其可提供关于肿瘤异质性和克隆进化的关键信息，从而在癌症的早期检测与诊断中具有重要价值[107]。与传统的物理和化学方法相比，基于血清的ctDNA分析提供了一种无创方法，能够为癌症诊断、预后和精准治疗提供有力支持[108]。然而，现有ctDNA分析受实验室环境限制，存在通量低且需依赖大型设备和专业人员等问题。因此，亟须开发高灵敏度和高选择性的检测平台来充分发挥ctDNA的潜力。微流控平台具有高通量、高效、检测快速和样品需求量小等优势，为ctDNA动态监测与分析提供了新的可能[109]。

为克服传统ctDNA检测方法的局限性，最新研究提出了一种基于PCR测序的高通量血浆ctDNA分析方法，显著提升了ctDNA检测的准确性、灵敏度与特异性[109]。研究引入超顺磁性微珠（SPMs）在微流控平台中实现ctDNA分离，可用于癌症早期检测与分型，并已通过计算机模拟技术验证。其分离过程包括首先根据片段大小从混合样品中分离ctDNA；随后将这些ctDNA片段附着到SPMs上，如图9（a）[109]所示；最终通过施加磁场在微流控通道出口收集附着的ctDNA片段。尽管这种方法在提供高特异性和灵敏度方面非常有效，但操作相对复杂。因此，研究者又提出了一种便携式生物芯片平台，将磁阻传感器阵列集成于其中，实现无细胞DNA（cfDNA）片段的磁标记和检测。这种方法不仅简化了操作流程，还有效降低了非特异性效应，使检测限提高到皮摩尔（pM）水平，如图9（b）[110]所示。ctDNA检测技术的进步推动了微流控表面SERS芯片的应用，特别是无泵多通道SERS微流控芯片，通过信号放大策略实现实际样品中的多种生物标志物检测，并为检测其他类型的肿瘤标志物提供了一种新策略，如图9（c）[111]所示。

尽管ctDNA在临床诊断应用中面临诸多挑战，但与蛋白质生物标志物相比，其具有更高的准确性、特异性和信息量[112]。更重要的是，这项技术推动了全基因组测序的发展，从而促进了将序列数据转换为临床可用的ctDNA信息，从而服务于癌症检测与研究[113]。基于血清中ctDNA的检测不仅为癌症患者提供了个性化治疗选择，还在诊断、预后和治疗决策中发挥着至关重要的作用[114]。然而，该技术的临床转化仍有较大的改进空间。

总之，虽然现有的ctDNA检测方法在准确性和灵敏度方面表现出色，但仍无法同时满足多种性能指标的要求。相比之下，微流控条形码生物芯片能够在高通量、高灵敏度、高特异性和高准确性之间实现平衡，为生物标志物的有效筛选提供了有力工具。例如，即使样品量少，微流控条形码生物芯片也能实现多个样品的高通量检测，从而有效降低检测成本并显著提升工作效率和成本效益。尽管如此，为确保检测结果的准确性，仍然需要通过大规模样品进行验证。此外，如何扩大生物芯片的生产规模并保持其性能一致性，也是未来亟待解决的重要挑战。

4 用于单细胞分析的微流控条形码生物芯片

细胞增殖、免疫反应和肿瘤转移等生物学功能在调节生理过程中发挥着至关重要的作用，而细胞之间的相互作用与通信则可引发集体反应[115‒116]。近年来的研究发现，这些细胞间相互作用为疾病诊断和治疗靶点的探索提供了新的方向[117‒118]。然而，基于细胞群体的研究往往掩盖了单个细胞的独特特征，因此单细胞及其亚群水平的研究受到广泛关注。具体而言，细胞内或与细胞膜相关的蛋白质不仅构成了细胞的结构基础，还参与细胞的转录、翻译、代谢、生长、黏附及信号转导等[119‒120]。此外，免疫细胞或基质细胞分泌的蛋白质（细胞因子、生长因子和激素）在细胞通信、肿瘤的发生发展，以及细胞、组织或器官群功能调控中起着至关重要的作用[121‒122]。细胞外囊泡（EVs）同样在介导细胞间通信及传递胞质蛋白、脂质和核酸等生物信息分子方面至关重要[123‒124]。然而，基于群体测量的传统EV表面标记图谱法掩盖了EV分泌和表型的细胞间异质性。因此，为了深入评估细胞间连接与生物功能，研究人员必须在单细胞水平上同步且直接地解析多种信号行为。

显微镜、流式细胞术及质谱法是单细胞研究的传统仪器和方法[125]。然而，这些方法存在通量较低、背景信号强、无法测量细胞代谢物以及依赖大型昂贵仪器等局限[26]。因此，单细胞组学领域亟需创新型技术。近年来，基于微流控芯片的新兴单细胞组学分析方法受到广泛关注，因其在高通量、高灵敏度及成本较低方面均表现出显著优势[26,59]。该类方法已逐步应用于单细胞基因组、表观基因组、转录组、蛋白质组和代谢组分析及其相互作用的解析[126‒128]。

4.1 单细胞实时分泌蛋白检测

蛋白质组学在评估生物学机制、疾病相关生物标志物、治疗靶点和其他蛋白质复合物方面具有至关重要的作用[119]。其中，微流控条形码生物芯片技术，已广泛应用于单细胞蛋白质组学的研究。当前技术在通量和灵敏度等方面存在局限，限制了某些蛋白质的检测[129‒130]。而微流控条形码生物芯片平台能够克服这些缺点，实现高灵敏度和高通量单细胞蛋白质检测，因此受到广泛关注[46,59]。

根据不同实验目标，可以设计具有多种抗体条带的微流控条形码生物芯片，用于单细胞蛋白的免疫定量研究[15,27‒28,59,131‒132]。例如，Ma等[132]提出了一种单细胞条形码生物芯片，用于测量淋巴细胞分泌的多种蛋白因子，从而揭示蛋白质的异质性和功能多样性[图10（a）]。如图10（b）所示，Elitas等[131]设计了一款能够同时检测单个细胞16种分泌蛋白的生物芯片。该单细胞芯片包含5000多个可随机装载单个细胞的微腔，并通过对16种蛋白质的测定，揭示了肿瘤细胞功能表型的变化。此外，Lu等[25]提出了一种用于单细胞分析的微流控条形码生物芯片，该芯片结合了光谱编码与各种荧光颜色的空间编码，实现了42种蛋白质的检测，这是目前单细胞蛋白质分析中的最高检测通量，如图10（c）[25]所示，该平台已经应用于细胞信号传导、免疫反应、细胞治疗等领域[25‒26,131]。然而，鉴于现有技术存在单细胞利用率低和试剂浪费等问题，Khajvand等[133]引入了一种集成液滴微流控装置[图10（d）]，该装置结合抗体条形码，可以对单个细胞分泌的蛋白质进行高效的多重分析，从而在单细胞水平上验证蛋白质分泌的异质性。

上述工作大多基于PLL功能化玻璃板进行抗体图谱分析，形式相对单一。基于此，如图10（e）所示，我们团队[27]开发了一种基于自组装GOQDs的空间编码抗体条形码芯片，用于单细胞分泌蛋白分析。这种材料不仅为细胞生长提供了适宜的环境，还能够在芯片上灵活组装，进而可精确测量单个细胞分泌的蛋白质。

与机器学习技术的整合进一步促进了单细胞的分类和亚群识别，从而提高了实验的精确性和深度。基于单细胞细胞因子测量的研究基础，我们团队深入探究了机械应力对人类神经干细胞分化为星形胶质细胞的早期阶段释放细胞因子的影响，如图10（f）[59]所示。单细胞分析表明，机械应力会导致某些细胞因子表达下调，这为中枢神经系统的免疫调节机制提供了新方法和独特见解[59]。这一发现为未来相关的神经生物学研究和免疫调节机制的探索提供了宝贵的数据和理论支持。

4.2 单细胞外泌体检测

图11（a）[134]展示了一种新型微流控条形码生物芯片平台，该平台具有多个平行微通道，可用于单细胞EVs的高通量可视化分析。该平台有效解决了EVs介导的肿瘤细胞通信研究中的重要挑战。研究结果表明，EV表型（如CD63+ EVs）的减少与细胞系及原代细胞的侵袭潜力密切相关。此外，如图11（b）[135]所示，研究人员报道了一种使用家用扫描仪进行高通量单细胞EV分泌分析的方法，且无需进行细胞计数。上述方法均基于PLL基底条形码平台，而我们团队则基于GOQD自组装基底，开展了卵巢癌肿瘤细胞和上皮细胞的单细胞外泌体研究，揭示了细胞间功能异质性，如图11（c）[28]所示。基于GOQD的分析平台能够同时检测20种不同类型的生物标志物，并可根据需求定制单细胞捕获平台内微通道的数量和尺寸，从而提高单细胞分析的通量。这种策略不仅在癌症研究中具有广泛的应用前景，还可用于深入分析复杂的肿瘤微环境，并有望以更高的分辨率揭示肿瘤内异质性和多维谱系。这一创新方法为癌症研究及肿瘤微环境的精细化分析提供了新的技术平台和思路。

4.3 细胞相互作用分析

单细胞应答和细胞异质性是内在因素和环境因素共同调控的结果。单细胞分析主要包括单细胞特征检测、遗传信息评估和细胞表型相关性分析等。当前，借助微流控技术可实现单细胞的快速高通量筛选，这为单细胞遗传学、蛋白质组学、基因组学、转录组学、细胞异质性和代谢谱等领域的深入研究提供有力支持[136‒137]。研究表明，胶质母细胞瘤细胞和巨噬细胞之间的旁分泌信号转导可导致肿瘤细胞功能表型改变。此外，蛋白质之间的相关性揭示了肿瘤-巨噬细胞通信改变中的关键信号转导节点，如图12（a）[131]所示。此外，如图12（b）[138]所示，单细胞条形码芯片在研究旁分泌信号转导中也发挥了重要作用，特别是在toll样受体4（TLR4）对脂多糖（LPS）刺激反应中的应用。研究结果表明，在群体水平上，旁分泌信号在LPS刺激下会促进细胞因子亚群（如IL-6和IL-8）的分泌，同时抑制巨噬细胞中TNF-α等细胞因子的分泌[138]。这些发现为肿瘤微环境中细胞间的相互作用和免疫反应的调控提供了新的视角和理论依据。

尽管单细胞分析技术不断发展，但用于单细胞分析的微环境平台在工程设计和整合方面仍存在一定的局限性。为解决这些问题，研究人员开发了一种新的单细胞细胞因子分泌分析平台。该平台旨在探索肿瘤微环境中TLR配体刺激下巨噬细胞的免疫反应，并揭示了细胞因子分泌的差异性调节，包括抗肿瘤细胞因子TNF-α的减少和IL-6的增加，如图12（c）[139]所示。为表征大量单细胞动态和分泌信息，Chen等[140]提出了一种能够同时测量5000个单细胞中的10种分泌蛋白的方法，如图12（d）所示。研究结果表明，巨噬细胞对TLR4刺激的反应主要呈现两种不同状态，这与单细胞的基线功能状态密切相关。这种方法不仅用于翻译和验证程序，还揭示了表型均一的细胞群体中细胞间的异质性。双细胞分泌实验在理解细胞间通信如何调控细胞运动行为方面具有重要意义，特别是在识别维持驱动细胞间运动的自由能梯度关键蛋白质方面[141]。这些研究为深入理解肿瘤免疫反应和细胞间的复杂通信机制提供了新的理论依据。

对传统流式细胞术分析方法而言，在保持细胞活力的同时进行多参数测试存在较大挑战。然而，在细胞维持良好状态的情况下，微流控条形码芯片与单细胞芯片联用可实现单个细胞分泌蛋白质/外泌体的多参数检测，这为我们深入了解细胞间异质性以及生理和病理过程中潜在机制提供了重要依据。在研究过程中，微流控条形码生物芯片在灵敏度、细胞通量、多功能性和重现性等方面仍面临重大挑战。尽管如此，将微流控条形码生物芯片与蛋白质组学、基因组学和代谢组学领域的单细胞分析相结合，不仅有助于全面理解单细胞特征，还对推进生物学研究和精准医学的发展具有深远意义。

5 结论与未来展望

微流控条形码生物芯片技术已经成为医学和生物分析科学研究中广泛应用于生物分子高通量检测和单细胞分析的重要工具。本文全面综述了微流控条形码技术的发展与应用。首先，简要介绍了微流控技术的分类；其次，详细阐述了微流控条形码技术的优势与局限，并总结了其他相关微流控方法；再次，综述了适用于微流控条形码芯片的基底材料；最后，重点探讨了微流控条形码生物芯片在生物分子（如蛋白质和核酸）及单细胞（如分泌蛋白和外泌体）分析中的应用，为生物分析领域的实际应用奠定了坚实基础。与微流控点阵技术相比，微流控条形码技术有效解决了通量低、检测重现性差、制备难度大、检测灵敏度低、动态检测范围有限、存在拖尾效应及点阵列不均匀等问题，这些问题可能会导致分析物交叉污染和信号读取错误。此外，微流控条形码技术还具备多通道并行、高通量、样品消耗少、快速响应和成本低等显著优势。纳米材料或聚合物材料的引入，推动了微流控技术的快速发展和应用，这些材料具有较大的表面积、优异的FRET效应、较小的尺寸和易于功能化等特点，有助于减少非特异性吸附、提高信噪比并降低检测限。借助这些优势，微流控条形码生物芯片技术能够使用最少的样品实现生物标志物的高通量检测，并表现出更高的灵敏度、特异性、LOD、短检测时间等特点。尽管微流控条形码技术在生物医学研究等领域已取得广泛应用，但仍存在若干待解决的问题，且某些研究方向还需深入探索。

微流控条形码技术的创新虽然已经取得初步进展，但要实现商业化并在临床诊断中广泛应用，仍面临诸多挑战。首先，本研究指出目前可用材料相对有限，每种材料在特定条件下才能发挥最佳捕获效率。因此，迫切需要开发新型具有良好性能、稳定性和临床应用价值的可重现材料，这仍是一项亟待解决的重大问题。其次，微流控条形码技术可与其他技术结合，形成多种联合分析方法，从而实现高通量检测。不同技术方法相互支撑，显著提高了分析的效率、灵敏度和特异性。通过这些多模态分析，可以深入了解疾病发展中的生物分子和单细胞作用机制，并筛选出潜在的生物标志物信息。最后，微流控条形码生物芯片技术已得到改进，使其能够在更复杂的环境中进行全自动检测，进而分析生物样品。当前，研究人员正全力推动该技术从实验室走向市场，以实现大规模应用。

总之，尽管微流控条形码生物芯片技术在材料自组装、芯片制造、自动化、便携性和多功能性等方面的发展仍不够完善，但该技术的快速高质量发展无疑正在加速其产业化进程。与其他技术的深度整合，不仅显著推动了实时检测和高效检测技术的发展，还为其在疾病临床诊断中的大规模应用提供了强大的助力。

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