散寒化湿颗粒及其活性成分对新型冠状病毒肺炎的抗病毒和抗炎作用

田传玺 ,  刘航 ,  王倩 ,  赵金悦 ,  姚晨思 ,  姚艳丰 ,  张旭 ,  马钦海 ,  王维皓 ,  周严严 ,  王梦晓 ,  师晓萌 ,  李香艳 ,  王杉 ,  杨映映 ,  苟筱雯 ,  周丽娟 ,  赵旌屹 ,  万砺 ,  李佳芮 ,  Stefanie Tiefenbacher ,  高军涛 ,  Rudolf Bauer ,  李敏 ,  仝小林

Engineering ›› 2024, Vol. 43 ›› Issue (12) : 166 -179.

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Engineering ›› 2024, Vol. 43 ›› Issue (12) : 166 -179. DOI: 10.1016/j.eng.2024.07.007
研究论文

散寒化湿颗粒及其活性成分对新型冠状病毒肺炎的抗病毒和抗炎作用

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Sanhan Huashi Formula and Its Bioactive Compounds Exert Antiviral and Anti-Inflammatory Effects on COVID-19

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摘要

散寒化湿颗粒（SHHS）是一种中医方剂，在治疗新型冠状病毒肺炎（COVID-19）中表现出显著的临床效果，但其具体机制和有效部分仍需进一步阐明。感染严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的Vero-E6细胞的体外实验表明，散寒化湿颗粒有效抑制了SARS-CoV-2的侵袭和增殖。使用暴露于病毒样颗粒（VLP）的K18-人血管紧张素转换酶2（hACE2）小鼠开展的体内实验，进一步证实散寒化湿颗粒抑制了SARS-CoV-2的入侵。尽管散寒化湿颗粒在感染SARS-CoV-2的K18-hACE2小鼠中没有表现出直接的抗病毒作用，但其显著改善了病理损伤并降低了C-C基序配体（CCL）-2、CCL-3、C-X-C基序配体（CXCL）-1、CXCL-6、CXCL-9、CXCL-10和CXCL-11等趋化因子在小鼠肺组织中的表达，也表明散寒化湿颗粒通过CCL-2/CXCL轴发挥免疫调节和抗炎作用。使用脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤（ALI）和RAW264.7细胞模型进一步验证了散寒化湿颗粒降低炎症生物标志物水平的能力，包括白细胞介素（IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。使用超高效液相色谱-线性捕获四极杆Orbitrap质谱（UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS）和表面等离子体共振（SPR）等先进分析技术，紫花前胡苷被鉴定为散寒化湿颗粒的一种有效抗病毒成分，主要靶向作用3C样蛋白酶（3CLPro），这一发现得到了氢-氘交换质谱（HDX-MS）和分子对接的验证。此外，紫花前胡苷在体外表现出明显的抗病毒效果，可降低超过66%的病毒载量。本研究表明散寒化湿颗粒可以通过抑制病毒入侵和发挥显著抗炎作用治疗COVID-19。

Abstract

Sanhan Huashi formula (SHHS), a traditional Chinese medicine (TCM), has shown significant therapeutic effects on coronavirus disease 2019 (COVID-19) in clinical settings. However, its specific mechanism and components still require further clarification. In vitro experiments with Vero-E6 cells infected with severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) demonstrated that SHHS effectively inhibited viral invasion and proliferation. Complementary in vivo experiments using K18-human angiotensin converting enzyme 2 (hACE2) mice exposed to virus-like particles (VLPs) further confirmed that SHHS impeded SARS-CoV-2 entry. Although SHHS did not demonstrate direct antiviral effects in K18-hACE2 mice challenged with SARS-CoV-2, it significantly alleviated pathological damage and decreased the expression of chemokines such as C-C motif ligand (CCL)-2, CCL-3, C-X-C motif ligand (CXCL)-1, CXCL-6, CXCL-9, CXCL-10, and CXCL-11 in the lungs, suggesting that SHHS exerts immunomodulatory and anti-inflammatory effects via the CCL-2-CXCL axis. Additional research using a lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury (ALI) and RAW264.7 cell model validated the ability of SHHS to reduce the levels of inflammatory biomarkers, including interleukin (IL)-1β, IL-6, and tumor necrosis factor-α (TNF-α). Using advanced analytical techniques such as ultrahigh-performance liquid chromatography coupled with linear trap quadrupole Orbitrap mass spectrometry (UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS) and surface plasmon resonance (SPR), nodakenin was identified as a potent antiviral component of SHHS that targets the 3C-like protease (3CLpro), a finding supported by the hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) and molecular docking analyses. Furthermore, nodakenin demonstrated a significant antiviral effect, reducing the viral load by more than 66%. This investigation reveals that SHHS can combat COVID-19 by inhibiting viral invasion and promoting anti-inflammatory effects.

关键词

散寒化湿方 / 新型冠状病毒肺炎 / 抗炎特性 / 紫花前胡苷 / 3C样蛋白酶

Key words

Sanhan Huashi formula / Coronavirus disease 2019 / Anti-inflammatory properties / Nodakenin / 3C-like protease

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田传玺,刘航,王倩,赵金悦,姚晨思,姚艳丰,张旭,马钦海,王维皓,周严严,王梦晓,师晓萌,李香艳,王杉,杨映映,苟筱雯,周丽娟,赵旌屹,万砺,李佳芮,Stefanie Tiefenbacher,高军涛,Rudolf Bauer,李敏,仝小林. 散寒化湿颗粒及其活性成分对新型冠状病毒肺炎的抗病毒和抗炎作用[J]. 工程（英文）, 2024, 43(12): 166-179 DOI:10.1016/j.eng.2024.07.007

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1 引言

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起，在全球范围内构成了相当大的公共卫生挑战，导致了极高的发病率和数百万人死亡[1‒2]。目前用于治疗COVID-19的小分子抗病毒药物包括瑞德西韦、奈玛特韦/利托那韦和莫诺拉韦[3]。然而Omicron变体毒株已显示出更高的传染性和免疫逃避能力[4‒5]，并出现疫苗接种后突破性感染[6]。此外，某些小分子抗病毒药物，如拉米夫定多替拉韦和阿兹夫定，具有遗传毒性，并且接受这些药物治疗的患者可产生耐药性[7]。此外，如奈玛特韦/利托那韦出现的潜在的药物间相互作用，对疫情防控造成进一步的挑战。

散寒化湿颗粒（SHHS）和“三药三方”（包括金花清感颗粒、血必净注射液、连花清瘟胶囊、化湿败毒方、清肺排毒方和宣肺败毒方）为代表的中医药（CPM）在中国治疗COVID-19中发挥了重要作用[8‒9]。SHHS（也称为寒湿疫方）是由仝小林院士开发的一种中药制剂，用于预防和治疗轻中度COVID-19感染。SHHS被正式纳入COVID-19诊疗方案的第4版到第10版，并已成为中国武汉使用最广泛的中药复方。随后，已在河南、江苏、吉林等省份分发了超过220万剂，为当地疫情防控做出了重大贡献。该配方包括20种中药（TCM），如附录A中的数据集S1（a）所示。一项随机、开放、多中心的试验表明，SHHS在缩短轻度至中度COVID-19患者的住院时间和加速临床康复方面优于奈玛特韦/利托那韦，SHHS对发热、咳嗽、喉咙痛和疲劳等症状改善明显[10]。

SHHS可以防止COVID-19从轻度发展为重度，这表明具有潜在的抗病毒和抗炎作用[11]。网络药理学分析表明SHHS对COVID-19的治疗效果可能源于其涉及多种成分、靶点和通路的抗病毒、免疫调节和抗炎特性[12]。尽管已有上述研究进展，但SHHS治疗COVID-19的确切机制仍有待阐明，需要进一步研究。

先前的研究表明，用于治疗COVID-19的连花清瘟胶囊、双黄连口服液和清肺排毒汤具有抗SARS-CoV-2的特性。连花清瘟胶囊中的主要草药成分是连翘，其中来自连翘的“连翘苷A”被认为能够抑制SARS-CoV-2 3C样蛋白酶（3CLpro）活性，从而有效阻止病毒复制和翻译[13]。在双黄连口服液中，黄芩是一种关键药物，其主要活性成分黄芩素在减轻SARS-CoV-2诱导的损伤方面显示出潜力，是一种很有前景的治疗药物[14]。此外，清肺排毒汤中的亮肽素可能是抗SARS-CoV-2的活性成分[15]。这些发现强调了研究草药制剂作为潜在临床治疗剂和从TCM中发现可能有助于疾病预防和治疗的生物活性分子的重要性[16]。从中药复方发现主要活性化合物这样的研究方法可以促进中药制剂中有效化合物的发现，进而阐明TCM的作用机理，促进TCM的现代化。

本文首先通过体内和体外实验评估了SHHS的抗病毒和抗炎特性。随后的分析包括通过采用超高效液相色谱-线性捕获四极杆Orbitrap质谱（UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS）技术表征吸收到血浆、肺和粪便中的SHHS的成分。我们专注于五个关键的抗病毒靶点，即人血管紧张素转换酶2（hACE2）[17]、SARS-CoV-2刺突受体结合域（RBD）[17]、3CLpro [18]、木瓜蛋白酶样蛋白酶（PLpro）[19]和人跨膜蛋白酶丝氨酸2（TMPRSS2）[20]，以阐明SHHS化合物的抗病毒机制。此外，这些活性化合物的抗病毒和抗炎作用在Vero-E6细胞中得到了验证。

2 材料与方法

2.1 生物安全和伦理声明

涉及SARS-CoV-2病毒样颗粒（VLP）的实验在生物安全级别BSL-2设施中进行，所有涉及SARS-CoV-2感染的程序都在BSL-4设施中进行。动物实验经中国中医科学院广安门医院实验动物伦理委员会（IACUC-GAMH-2021-011）、中国中医科学院基础研究所（IBTCMCACMS21-2111-01）和中国医学科学院武汉病毒研究所生命科学研究伦理审查委员会（WIVA21202012）批准。活体新冠病毒毒株2019-nCoV WIV04由武汉病毒研究所提供。

2.2 细胞实验

Vero-E6细胞（武汉普诺赛生命科技公司）在补充了胎牛血清（FBS；美国，Gibco）和青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；美国，Gibco）中培养，并经检测支原体污染为阴性。RAW264.7细胞在补充了10% FBS的DMEM中培养。将Vero-E6细胞（2.5 × 105个∙孔-1）接种于24孔板中，然后以0.01的感染复数（MOI）暴露于SARS-CoV-2病毒1 h。移除上清液后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞，并在含有2% FBS的培养基中培养。在感染后24 h、48 h和72 h，收集细胞上清液和裂解物，并使用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）进行分析，以量化病毒RNA拷贝数和细胞因子的信使RNA（mRNA）水平。

RAW264.7细胞在补充了10% FBS的DMEM中培养。细胞用不同浓度的SHHS孵育12 h，然后用脂多糖（LPS；1 μg∙mL-1）处理9 h，收集细胞上清液，并通过酶联免疫吸附试验（ELISA）评估炎症因子水平。

2.3 细胞活力检测

使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测法（英国，Abcam）按照制造商的说明书评估Vero-E6细胞的活力。在450 nm波长处测量吸光度。将细胞与不同浓度的SHHS孵育24 h以评估潜在的细胞毒性。

2.4 动物实验

VLP动物实验：将6~8周龄的无特定病原体（SPF）级K18-hACE2转基因雄性小鼠（赛业生物科技公司）随机分为空白组、对照组、SHHS组和熊去氧胆酸（UDCA）组，每组6只小鼠。在预实验中，SHHS喷干粉以4.55 g∙kg-1∙d-1的剂量灌胃给药，在给药第2天和第3天各有一只动物死亡（排除药物毒性）。因此，在正式实验中剂量调整为2.275 g∙kg-1∙d-1，无小鼠死亡。造模前，小鼠禁食12 h，自由饮水。SHHS组连续4天灌胃SHHS，剂量为2.275 g∙kg-1∙d-1；UDCA组连续7天灌胃给予UDCA，剂量为693 mg∙kg-1∙d-1；对照组灌胃蒸馏水。除空白组外，其余各组hACE2小鼠均建立SARS-CoV-2 VLP肺部侵袭模型：在实验第5天给药后2 h，通过滴注VLP进行造模。小鼠经腹腔麻醉后，暴露气管软骨环，用胰岛素针穿刺环甲膜，缓慢注入50 µL包装有荧光素酶（Luc）的VLP（Luc-VLP；15 mg∙mL-1）。在VLP注射后6 h对小鼠实施安乐死。

活病毒动物实验：K18-hACE2小鼠（7~8周龄）购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。将12只K18-hACE2小鼠随机分为模型对照组和SHHS治疗组，每组6只小鼠。SHHS组小鼠在攻毒前7天开始每日给予SHHS喷粉，剂量为6.825 g∙kg-1（人临床等效剂量的1.5倍）；模型对照组小鼠每日灌胃给予等体积的PBS溶液。小鼠经鼻滴感染2019-nCoV WIV04毒株，剂量为每50 µL 1000 个50%组织培养感染剂量（TCID50）。感染后，每日测量小鼠体重，并在感染后第3天对小鼠实施安乐死。从肺组织匀浆中提取组织RNA用于病毒和细胞因子的定量检测。

LPS诱导的急性肺损伤（ALI）模型动物实验：将小鼠（n = 30）随机分为对照组（Control）、模型组（Model）、SHHS低剂量组（SHHS-L；2.275 g∙kg-1）、SHHS中剂量组（SHHS-M；4.55 g∙kg-1；人临床等效剂量）、SHHS高剂量组（SHHS-H；9.1 g∙kg-1）和地塞米松组（Dex，5 mg∙kg-1），每组五只小鼠。SHHS组灌胃给予SHHS喷干粉，模型组和Dex组灌胃给予生理盐水，各组均在第7天上午灌胃后2 h进行气管滴注（LPS, 5 mg∙kg-1）。此外，Dex组在LPS造模前2 h腹腔注射Dex（5 mg∙kg-1），造模后24 h对小鼠实施安乐死。

2.5 SARS-CoV-2 VLP的构建与纯化

将HEK-293T细胞（美国，ATCC）接种于细胞培养皿中，使用聚乙烯亚胺线性（PEI）转染试剂将带有Flag标签（美国，Genscript）的SARS-CoV-2刺突蛋白（S）、膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）和核衣壳蛋白（N）的基因质粒以及荧光素酶表达质粒同时转染入细胞。48 h后移除上清液，用PBS冲洗细胞，刮下后收集并转移至EP管中。通过反复冻融裂解细胞，然后离心获得细胞裂解液。移除上清后，向EP管中加入900~1000 μL的20%蔗糖溶液。将收集的上清液沿管壁缓慢加入，在4 ℃下以21 690g（g = 9.8 m∙s-2）离心7 h，将沉淀重悬于PBS中并过滤[21]。

2.6 组织学检查

取自SARS-CoV-2感染小鼠和LPS诱导的ALI模型小鼠的肺组织，在4%多聚甲醛（PFA）固定液（北京兰杰柯科技公司）中固定，石蜡（美国，赛默飞世尔科技公司）包埋，并按标准程序切片。将样品切成3 mm的薄片，然后按照制造商的说明进行苏木精-伊红（HE）染色。使用马松三色染色试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）进行胶原蛋白的马松三色染色，使用正置光学显微镜（日本，尼康）检测并关注胶原阳性区域，用尼康DS-U3获取和处理图像。通过评估肺出血、炎症浸润和肺间质水肿来计算肺损伤评分。评分范围从0（表示无明显病变）到4（表示危重程度）。中间等级分配如下：0.5~1为轻度，2为中度，3为重度，从而准确反映疾病严重程度。

2.7 免疫荧光

为了进行免疫荧光染色，将来自K18-hACE2小鼠的新鲜肺组织在4%多聚甲醛（BioDee）中固定48 h。组织在最佳切割温度（OCT）下用恒温冷冻切片机（美国，Sakura）切成10 μm的切片，并平衡至室温。用PBS洗涤后，用血清封闭液[3% 牛血清白蛋白（BSA）]封闭细胞1 h。兔抗ACE2抗体（1∶200, 1% BSA；美国，Proteintech）和小鼠抗FLAG抗体（1∶400, 1% BSA；美国，Proteintech）在湿盒中4 ℃孵育过夜。用PBS洗涤后，切片与抗兔Alexa Fluor 488荧光二抗（1∶1000, 1% BSA; Invitrogen）、抗小鼠Alexa Fluor 568荧光二抗（1∶1000, 1% BSA; Invitrogen）和Alexa Fluor 647鬼笔环肽抗体（1∶1000, 1% BSA；美国，Cell Signaling Technology）一起孵育2。样品在PBS中洗涤三次，每次5 min。细胞用Hoechst染液（1∶1000, PBS）孵育15 min，然后用PBS洗涤三次。用抗荧光淬灭封片剂滴加封片。使用奥林巴斯荧光显微镜（日本）扫描和拍摄图像进行定性分析。

切片稍干后，用组织笔在感兴趣区域（ROI）周围画圈，并用BSA封闭切片30 min。切片与抗SARS-CoV-2刺突蛋白RBD和核蛋白（NTD）抗体（Abmart）孵育过夜。载玻片用磺化花青素3（Cy3）标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG, 1∶300）处理，并在黑暗中孵育50 min。用PBS冲洗后，将载玻片暴露于DAPI溶液并在黑暗中孵育10 min。用PBS洗涤后，加入自发荧光淬灭剂溶液5 min，然后封上抗荧光淬灭的盖玻片。使用尼康Eclipse C1正置荧光显微镜进行扫描、拍摄和分析。

2.8 免疫组织化学

通过免疫组织化学染色检测石蜡包埋切片中CCL-2的表达。将切好的样品浸入3%过氧化氢溶液中，并在黑暗中孵育25 min。在培养皿中用3% BSA溶液均匀覆盖组织，并在室温下封闭30 min。加入CCL-2（MCP-1）一抗（Servicebio）后，组织在4 ℃孵育过夜。用PBS（pH = 7.4）冲洗后，切片再与辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG抗体（1∶200）孵育50 min。切片与二氨基联苯胺（DAB，作为显色底物）孵育，苏木精复染，最后通过尼康E100显微镜系统观察。

2.9 聚合酶链反应（PCR）

为量化 SARS-CoV-2 RNA拷贝数，使用QIAamp® Viral RNA Mini Kit（德国，Qiagen）从感染的细胞上清液或匀浆组织中提取病毒RNA，并用作RT-PCR的模板。使用我们先前研究中来自S基因的引物对RBD-qF1（5′-CAATGGTTTAACAGGCACAGG-3′）和RBD-qR1（5′-CTCAAGTGTCTGTGGATCACG-3′）进行比对。使用HiScript® II一步法qRT-PCR SYBR® green试剂盒（南京诺唯赞生物科技公司）和2 μL RNA，按照制造商的说明验证RNA量。在美国国家生物技术信息中心（NCBI）搜索相应的小鼠基因序列，选择编码序列（CDS）区域，并使用Primer Premier 6.0软件设计跨外显子区域的引物。按照制造商的说明使用定量聚合酶链反应（qPCR）预混试剂盒（天根生化科技公司）。引物序列见附录A中的表S1。

2.10 荧光素酶活性检测

将苯甲基磺酰氟（PMSF）（P0100；北京索莱宝科技公司）和蛋白酶抑制剂混合物（cocktail）以1∶100的比例添加到放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液（89901；美国，赛默飞世尔科技公司）中。向100 mg的组织中加入400 μL缓冲液进行细胞裂解，整个过程在冰上操作。使用组织匀浆器（每个EP管放一个4 mm珠子和两个3 mm珠子）以70 Hz匀浆120 s。匀浆组织在4 ℃下离心，重复研磨和离心步骤后获得上清液。分别吸取上清液样品并储存于4 ℃。将20 μL样品加入96孔板中，然后每孔加入100 μL荧光素酶底物并混匀。使用荧光素酶检测试剂盒（E1501；美国，Promega）检测荧光素酶活性。

2.11 酶联免疫吸附试验

用于检测小鼠肺组织、血清和细胞培养液中白细胞介素（IL）-1β（KE10003）、IL-6（KE10007）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α; KE10002）的ELISA试剂盒购自Proteintech Group。相关检测按照说明书进行。

2.12 SHHS喷雾干燥粉的化合物谱表征

由20味中药组成的SHHS喷干粉由江苏康缘药业股份有限公司（生产批号：Z210801）提供。采用快速、灵敏、可靠的UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS方法表征SHHS的化合物谱。将约1.0 g的SHHS喷干粉过0.45 μm微孔滤膜后收集滤液。为鉴定这些化合物，我们基于各单味药在《中国药典》中的组成及文献报道的药效成分，结合高分辨液相色谱提供的保留时间和精确质量数，建立了标准品库。分析在ACQUITY UHPLC HSS T39仪器（美国，Waters）上进行。使用Xcalibur、Metworks 和 Mass Frontier 7.0软件收集和分析数据。

2.13 3CLpro 和 PLpro的纯化

SARS-CoV-2 PLpro在pET-28载体中的基因序列由北京大学深圳研究生院李志刚教授惠赠。SARS-CoV-2 3CLpro在PET-28载体中的编码序列由金唯智生物科技有限公司合成。简言之，首先将质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中。重组细胞在37 ℃培养直至600 nm处的光密度值达到0.6~0.8。随后，诱导SARS-CoV-2 PLpro或 3CLpro的表达，并在16 ℃下继续培养20 h。通过离心收获细胞并进行超声破碎。然后通过离心分离不溶性组分，上清液依次通过HisTrap（美国，Cytiva）和Superdex 75（Cytiva）层析柱进行纯化。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）确认蛋白质纯度大于95%。

2.14 表面等离子共振（SPR）

使用Biacore 8K+仪器（Cytiva）检测SHHS成分与hACE2或SARS-CoV-2 RBD的结合亲和力。hACE2（北京义翘神州科技公司）或SARS-CoV-2 RBD（北京义翘神州科技公司）通过标准胺偶联法使用含P20的HEPES缓冲盐溶液（HBS-P；Cytiva）固定到CM5传感芯片上。在结合实验中，hACE2和SARS-CoV-2刺突蛋白RBD的固定水平均为约10 000响应单位（RU）。将不同浓度的化合物依次注入通道[含5%二甲基亚砜（DMSO）]以评估其结合亲和力。化合物的解离常数（K Ds）通过使用Biacore 8K+评估软件的稳态亲和力模型分析数据来确定。在竞争性抑制实验中，hACE2或刺突蛋白RBD的固定水平约为3000 RU。首先，将具有结合活性的化合物与hACE2或刺突蛋白RBD 进行预孵育。随后，注入5 nmol∙L-1的刺突蛋白RBD或30 nmol∙L-1的hACE2，以评估在活性化合物存在下，SHHS成分与hACE2或刺突蛋白RBD的结合情况。通过比较有和无活性化合物时获得的响应单位来确定阻断效果。

2.15 酶活性检测

使用底物Thr-Ser-Ala-Val-Leu-Gln-对硝基苯胺[22]、肽-7-氨基-4-甲基香豆素（Z-Arg-Leu-Arg-Gly-Gly-AMC；Bachem Bioscience）和Boc-Gln-Ala-Arg-AMC（CSB-YP023924HU；CUSABIO），分别在动力学模式下测量SARS-CoV-2 3CLpro、PLpro和TMPRSS2的活性。反应中3CLpro、PLpro和TMPRSS2的最终浓度分别为50 nmol∙L-1、100 nmol∙L-1和 30 nmol∙L-1。使用BioTek Synergy Neo2（美国）记录吸光度或荧光信号。

2.16 氢-氘交换质谱（HDX-MS）分析

使用D2O缓冲液（100 mmol∙L-1磷酸盐，pH = 7.0）对 3CLpro（1 mg∙mL-1）或含紫花前胡苷（nodakenin）（1 mmol∙L-1, 1% DMSO）的3CLpro（1 mg∙mL-1）进行氘标记。在0.1 min、0.5 min、1 min、10 min、30 min、60 min和240 min的时间点，通过加入淬灭缓冲液（100 mmol∙L-1磷酸盐，pH = 1.8, 4 mol∙L-1 GdHCl，0.5 mol∙L-1三氯乙基磷酸酯）终止标记反应。肽段被捕获、脱盐3 min，用15%乙腈以100 μL∙min-1流速洗脱，并使用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（1.0 mm × 100 mm, 1.7 μm）进行分离。使用Waters Xevo G2质谱仪进行质谱分析。

2.17 分子对接

使用Glide程序（Schrödinger Suite）及其默认参数进行分子对接研究。蛋白质SARS-CoV-2 3CLpro [蛋白质数据库（PDB）ID：6LU7]被用作紫花前胡苷的对接靶标。通过创建一个足以容纳整个3CL蛋白的网格盒，并使用额外精度（XP）结合模式来检查紫花前胡苷与SARS-CoV-2 3CLpro之间的关键相互作用。

2.18 统计分析

使用GraphPad Prism 9.5软件进行统计分析。两组间差异的显著性通过t检验评估，而多组比较则使用单因素方差分析（ANOVA）。p值小于0.05被认为具有统计学意义。显著性水平：*代表p < 0.05，**代表p < 0.01，***代表p < 0.001，“ns”表示结果无统计学意义。

3 结果

3.1 SHHS降低Vero-E6细胞中的病毒载量并减轻炎症反应

在进行细胞活性检测之前，我们检测了SHHS对Vero-E6细胞的细胞毒性。使用CCK-8法测定了经SHHS处理的细胞活力，如图1（a）所示。结果表明，SHHS的半数细胞毒性浓度（CC50）为11.044 mg∙mL-1，在浓度低于3.17 mg∙mL-1时表现出最小的细胞毒性，细胞活力保持在85%以上。

为研究SHHS在细胞水平上对活SARS-CoV-2毒株（2019-nCoV WIV04）的抗病毒作用，我们用浓度为1 mg∙mL-1的SHHS进行不同的药物-细胞-病毒预处理（附录A中的第S1.1节和图S1）。实验步骤包括将SHHS与病毒预孵育，然后用病毒与药物的混合物感染细胞，1 h后弃去上清液，更换细胞培养基继续培养。感染后24 h，1 mg∙mL-1浓度的SHHS显著降低了感染细胞上清液中的病毒载量[图1（b）]。

我们还研究了SHHS对感染SARS-CoV-2的Vero-E6细胞中TNF-α、IL-6、CCL-2、CCL-3和CXCL-10 mRNA表达的影响，发现SHHS以浓度依赖的方式显著抑制这五种细胞因子水平的升高[图1（c），附录A中的图S2]。这些结果表明，SHHS可在细胞水平上抑制SARS-CoV-2的感染和增殖。此外，SHHS可能通过调节趋化因子的表达来发挥抗病毒活性。

3.2 SHHS抑制小鼠体内SARS-CoV-2 VLP的侵袭

为了确定SHHS对SARS-CoV-2的侵袭的作用，我们在hACE2小鼠中建立了一个SARS-CoV-2 VLPs侵袭呼吸道的模型。荧光素酶活性检测结果表明，SHHS干预组肺组织中的VLP水平显著低于对照组[图1（d）]。SHHS干预组的抑制率为30%（p < 0.05），UDCA组的抑制率与已有报道[23]一致。免疫荧光结果显示，空白组肺组织中ACE2受体表达正常，且未检测到SARS-CoV-2 Luc-VLPs [图1（e）]。尽管VLP组中ACE2受体表达正常，但在细胞质内，尤其是细胞核周围，观察到SARS-CoV-2 Luc-VLPs的显著聚集。相反，在SHHS治疗组中，虽然ACE2表达保持正常，但细胞内SARS-CoV-2 Luc-VLPs的聚集明显减少。类似地，UDCA组也表现出ACE2受体表达降低以及细胞内SARS-CoV-2 Luc-VLPs聚集减少。这些发现表明，SHHS有效抑制了SARS-CoV-2 VLPs向小鼠肺组织的侵袭。

3.3 SHHS减轻感染SARS-CoV-2的K18-hACE2小鼠肺部炎症

为了研究SHHS对感染SARS-CoV-2小鼠的影响，我们使用2019-nCoV WIV04毒株对K18-hACE2小鼠进行滴鼻感染。所有小鼠组均未出现死亡。研究显示，模型组的平均体重下降率为11.68%，而SHHS组的平均体重下降率降至10.39%，表明SHHS具有减轻感染所致体重下降的趋势[图2（a）]。模型组小鼠肺组织的平均病毒载量为2.9 × 108 拷贝∙g-1，SHHS治疗组的降至2.6 × 108 拷贝∙g-1。然而，差异无统计学意义，提示SHHS降低病毒载量的能力较弱[图2（a）]。

模型组肺组织的HE染色显示存在间质充血水肿、炎性细胞浸润以及肺泡间隔显著增宽[图2（b），附录A中的图S3]，而SHHS治疗后肺部炎症得到减轻。肺组织的马松三色染色显示，SHHS治疗减轻了肺纤维化和出血[图2（c）]。此外，肺切片的免疫荧光分析表明，与模型组相比，SHHS治疗降低了抗SARS-CoV-2刺突蛋白RBD和NTD组中SARS-CoV-2刺突蛋白RBD和NTD的表达水平，提示存在有效的抗病毒反应[图2（d），附录A中的图S4]。

鉴于SARS-CoV-2感染相关的肺部并发症以促炎性趋化因子和细胞因子的过度表达为特征，并可能引发“细胞因子风暴”[24]，研究已发现COVID-19患者体内炎症因子[如干扰素-γ（IFN-γ）[25]]及多种趋化因子（CCL-2、CCL-3、CCL-4、CXCL-1、CXCL-6、CXCL-9、CXCL-10、CXCL-11等）表达上调[26‒27]。为此，我们采用PCR技术检测了相关细胞因子及趋化因子的mRNA表达水平。结果显示，SHHS能显著降低多种趋化因子的mRNA水平，尤其是CCL-2、CCL-3、CCL-4、CXCL-1、CXCL-6、CXCL-9、CXCL-10和CXCL-11 [图2（e）]。进一步的免疫组化分析证实，与模型组相比，SHHS治疗组肺组织中CCL-2蛋白水平降低，这提示SHHS或可缓解COVID-19患者的炎症反应[图2（f）]。

3.4 SHHS改善LPS诱导的ALI模型小鼠和RAW264.7细胞的炎症损伤

为评估SHHS的抗炎作用，通过气管内直接注射5 mg∙kg-1 LPS构建了小鼠ALI模型。给予LPS后6 h，在模型组肺组织中观察到显著的结构改变，包括肺泡结构破坏、肺泡壁增厚、肺泡扩张以及间质致密。还观察到组织细胞增生、血管充血和水肿。不同剂量的SHHS有效改善了肺组织的病理损伤，这反映在相应的肺损伤评分上[图3（a），附录A中的图S5]。SHHS治疗后，ELISA分析显示血清和肺组织样本中促炎因子（如IL-1β和TNF-α）的水平显著降低[图3（b）]。然而，该治疗未表现出明显的量效关系。

在平行的体外研究中，对RAW264.7细胞给予LPS以模拟炎症环境，并使用CCK-8法评估了SHHS对细胞活力的影响。当SHHS浓度低于1 mg∙mL-1时，基本无细胞毒性（细胞活力> 85%），如附录A中的图S6所示。此外，ELISA结果表明，SHHS降低了RAW264.7细胞上清液中IL-6和IL-1β的水平[图3（c）]。综合来看，这些发现证实了SHHS在体内外均具有显著的抗炎作用。

3.5 SHHS 的化合物谱表征

为阐明SHHS的物质组成，我们采用UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS技术对SHHS中的成分进行分析鉴定。初步筛选鉴定出308种化合物，其中224种在正离子模式下检测到，84种在负离子模式下检测到[附录A中数据集S1（a）]。

如图4（a）所示，在正离子和（或）负离子模式下检测吸收入血浆、肺和粪便的SHHS化合物。随后对SHHS中鉴定出的化合物结构进行了分类和比较。通过对SHHS复方中的每一味药材应用相同的方法和色谱条件进行提取，将每种化合物归属到相应的药材[图4（b）]。

为提高鉴定过程的准确性，我们使用了60种标准参比物来考察这些化合物的裂解模式。这种严格的方法显著提高了化合物鉴定的可靠性，确保了分析结果的稳健性。

SHHS化学成分鉴定的详细信息见附录A中第S1.2节。在正常大鼠灌胃SHHS七天后，也鉴定出了被吸收进入血浆、分布到肺以及转运至粪便的化合物（附录A中第S1.3节）。图4（c）系统分类了SHHS中鉴定出的（根据其在血浆、肺和粪便中的存在情况进行划分）化合物。这些化合物的详细信息，如保留时间、m/z值、质量误差、分子式、碎片离子、鉴定结果和结构分类，见附录A中第S1.3节，并列于数据集S1中。

3.6 SHHS治疗COVID-19的抗病毒机制

为了进一步研究SHHS的抗病毒机制，我们研究了SHHS中80种化合物（吸收入肺、血浆和粪便中），并成功从市场上获取了其中的28种化合物。这些化合物主要来源于复方中的君药和臣药，包括16种存在于血浆中的组分、11种存在于肺中的组分以及20种存在于粪便中的组分。从结构上看，这些化合物包括3种萜类、7种香豆素类、6种黄酮类、2种木脂素类、2种生物碱类以及8种其他类型的化合物[附录A数据集S1（e）]。这些化合物的结构类型基本上代表了SHHS中所含化合物的全部类型，可作为研究该复方作用机制的代表性单体化合物。为此，我们聚焦于五个关键的抗病毒靶点：hACE2、RBD、3CLpro、PLpro和TMPRSS2，以研究这些SHHS化合物的抗病毒机制。

对于hACE2和SARS-CoV-2的RBD（受体结合域），初步的结合筛选显示，没食子酸（gallic acid）、印度枳碱（aegeline）和芹菜素（apigenin）均在微摩尔浓度范围内对hACE2和RBD表现出合适的结合活性（附录A图S7）。此外，印度枸橘素（marmesin）对hACE2显示出适当的结合能力（图S7），而欧前胡素（imperatorin）、苍术内酯I（atractylenolide I）、苍术酮（atractylon）、汉黄芩素（wogonin）、滨蒿内酯（scoparone）、印度枳碱、异鼠李素（isorhamnetin）、没食子酸丙酯（propyl gallate）、香叶木素（diosmetin）、槲皮素（quercetin）和木犀草素（luteolin）则表现出适当的RBD结合能力（附录A图S8）。

考虑到SARS-CoV-2主要通过其自身的刺突蛋白与人体细胞表面的ACE2受体结合来实现病毒入侵[16]，我们随后测试了这些对hACE2或RBD有活性的化合物是否能阻断RBD与hACE2的结合。如图5（a）和附录A图S9所示，与单独注射5 nmol∙L-1的hACE2相比，加入没食子酸和芹菜素能显著降低hACE2与固定在传感器芯片上的SARS-CoV-2 RBD的结合率，且呈剂量依赖性。此外，与单独注射30 nmol∙L-1的SARS-CoV-2 RBD相比，存在没食子酸、芹菜素、苍术酮和槲皮素时，能有效削弱SARS-CoV-2 RBD与hACE2的结合，同样呈剂量依赖性。最大结合抑制率约为90% [图5（a），附录A图S9]。

接下来，在50 μmol∙L-1的浓度下，依次检测了这28种化合物对SARS-CoV-2 3CLpro、PLpro以及人源TMPRSS2活性的抑制效果。对于在50 μmol∙L-1浓度下抑制率大于50%的化合物，绘制了其剂量-响应曲线（dose-response curves）。如图5（b）和附录A图S10所示，没食子酸、紫花前胡苷、印度枸橘素、表儿茶素（epicatechin）和槲皮素能有效降低3CLpro的酶活性，其半数抑制浓度（IC50）值分别为(8.2 ± 1.3) μmol∙L-1、(10.2 ± 1.6) μmol∙L-1、(17.8 ± 1.8) μmol∙L-1、(30.2 ± 7.8) μmol∙L-1和大于100.0 μmol∙L-1。此外，印度枸橘素、滨蒿内酯和木犀草素抑制了PLpro的活性，其IC50值分别为(20.2 ± 5.8) μmol∙L-1、(29.3 ± 7.8) μmol∙L-1和(65.0 ± 30.0) μmol∙L-1（附录A图S11）。滨蒿内酯、紫花前胡苷和印度枸橘素对人源TMPRSS2的抑制IC50值分别为(29.0 ± 3.5) μmol∙L-1、(47.0 ± 10.0) μmol∙L-1和(40.0 ± 44.0) μmol∙L-1（附录A图S12）。尽管印度枸橘素对多个靶点具有抑制作用，但由于其广泛的活性谱，被归类为潜在的泛筛选干扰化合物（PAINS），因此被排除在后续的抗病毒实验之外。

3.7 SHHS化合物在体外对SARS-CoV-2的抗病毒和抗炎活性

我们首先获取了针对COVID-19的五个主要靶蛋白（ACE2、RBD、3CLpro、PLpro和TMPRSS2）的筛选和验证结果。随后，我们选取了五种化合物进行深入的抗病毒活性评估，分别是没食子酸、芹菜素、苍术酮、槲皮素和紫花前胡苷[图5（c）]。没食子酸、芹菜素、苍术酮和槲皮素与hACE2或SARS-CoV-2 RBD共享一个结合表位，可直接减少SARS-CoV-2 RBD与hACE2的结合，从而发挥抗病毒活性。紫花前胡苷对SARS-CoV-2 3CLpro具有合适的抑制活性，其IC50值接近10 μmol∙L-1，表明其具有降低病毒复制速率的潜力。

通过用WIV04毒株感染Vero-E6细胞，进一步验证了这五种化合物的抗病毒效果[图5（d），附录A中的图S13]。与对照组相比，芹菜素和紫花前胡苷显著降低了细胞上清液中的病毒载量，抑制率超过50%。值得注意的是，紫花前胡苷具有显著的抗病毒作用，抑制率超过66%，凸显了其在细胞水平上抑制SARS-CoV-2感染和复制的效力[图5（d）]。此外，紫花前胡苷降低了TNF-α、CCL-2、CCL-3和CXCL-10的表达，显示出与SHHS复方相似的抗病毒表型。这些化合物对SARS-CoV-2的抗炎活性见附录A中的第S1.4节和图S13。血浆中紫花前胡苷含量的测定方法见附录A中的第S1.5节及表S2和表S3。

3.8 紫花前胡苷抑制3CLpro酶活性的机制

我们利用HDX-MS和分子对接技术研究了抗病毒活性最佳的化合物（紫花前胡苷），及其抑制3CLpro酶活性和发挥抗病毒功能的能力。此外，考虑到紫花前胡苷对TMPRSS2的抑制作用较弱，未进行进一步的结合机制研究。

HDX-MS结果显示，添加紫花前胡苷导致肽段35‒44、37‒44、133‒148、139‒156、155‒172和192‒209的分子量发生显著变化，范围约为0.5~2.0 Da [图5（e），附录A中的图S14]。根据分子对接结果，紫花前胡苷与L141、N142、G143和Q192形成氢键，并与H41、M165、L167和P168发生疏水相互作用[图5（f）和（g）]。这些发现与HDX-MS结果高度吻合，从分子水平上全面阐释了紫花前胡苷的作用机制。

4 结论

我国应用TCM抗击疫情有上千年的历史，积累了很多有效的方剂和药物。在COVID-19疫情初期，面对这种新型传染病和抗病毒药物的匮乏，TCM被迅速应用，医疗人员通过整体观察法（望、闻、问、切）结合治疗分析，来推断患者的病因病机。TCM的一个显著优势是能够提供早期和对症治疗。在我国临床实践中，散寒化湿颗粒和“三药三方”[28]已被确定为预防和治疗COVID-19的有效治疗药物，研究发现这些方剂能够改善患者预后、降低死亡率并促进患者康复[29]。然而，中药复方成分复杂，其活性成分的鉴定和作用机制的阐明面临挑战，这反过来又阻碍了TCM在全球的推广和应用。

Vero-E6细胞模型和K18-hACE2小鼠模型通常被用来评估SARS-CoV-2等病毒的毒力，并探索潜在的治疗策略[30‒31]。CCL-2/C-C基序趋化因子受体2（CCR-2）轴在招募炎性单核细胞/巨噬细胞至肺部过程中起着关键作用，其失调的激活可能导致COVID-19患者的过度炎症[32]。我们的研究表明，SHHS能够降低Vero-E6细胞中的病毒载量，并下调CCL-2和CCL-3的表达。SHHS还被证明能抑制SARS-CoV-2 VLPs对肺组织的侵袭。在本研究中，SHHS治疗有降低感染2019-nCoV WIV04病毒的小鼠肺组织中的病毒载量的趋势，同时，SHHS减轻了肺部炎症，降低了趋化因子（如CCL-2、CXCL-1、CXCL-6和CXCL-10）的mRNA表达。由于病毒相关的实验限制，我们未能获取蛋白质样本进行分析。因此，我们仅限于使用免疫荧光和免疫组织化学技术检测石蜡包埋的肺组织样本。免疫荧光结果表明，SHHS治疗有效降低了SARS-CoV-2刺突蛋白RBD和NTD的表达水平。值得注意的是，SHHS组的肺组织中CCL-2蛋白的表达也有所降低。这些体内外实验证明，SHHS具有抑制病毒侵袭的潜力。此外，这些结果也提示SHHS可能通过CCL-2/CXCL轴调节免疫反应，发挥抗炎作用来治疗COVID-19。我们在SHHS对K18-hACE2小鼠感染SARS-CoV-2（Omicron）的影响实验中也得到了类似的结果（附录A图S15）。相关研究表明，在SARS-CoV-2感染和病毒性脓毒症的起始阶段，趋化因子是细胞释放的主要因子。在此初始阶段使用阻断趋化因子和炎性细胞因子的药物进行治疗，对于预防COVID-19患者死亡至关重要[33]。这一机制或许可以解释为何SHHS能有效预防COVID-19从轻症向重症进展。

SARS-CoV-2通过ACE2进入人体细胞，ACE2是表达在肺纤毛细胞和肺泡II型上皮细胞上的细胞受体，在肠道中也高表达[34]。ACE2在氨基酸转运中的作用与胃肠道微生物生态相关[35]。COVID-19表现为呼吸道、胃肠道[36]和全身症状，病毒RNA可在呼吸道[37]和粪便[38‒39]中持续存在。研究表明，SARS-CoV-2在粪便样本中的存留时间显著长于呼吸道和血清样本[40]。TCM通过多重药理途径、靶点和部位对COVID-19发挥治疗作用[41]。鉴于ACE2受体在呼吸道和肠道均有表达，且新型冠状病毒RNA在这些部位存留时间长，我们推测SHHS可能首先通过小肠发挥作用，随后进入血液并影响肺部。为探索这一假设，我们对SHHS的成分进行了表征，并通过UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS条件鉴定了血浆、肺和粪便中存在的成分。

对中药活性成分的研究促进了中药制剂中有效化合物的发现。在已鉴定的80种化合物中，有28种可在市场上买到。本文通过聚焦五个抗病毒靶点（hACE2、RBD、TMPRSS2、3CLpro和PLpro），根据表面等离子共振和酶活性检测的结果，最终确定了五种潜在的抗病毒化合物：没食子酸、芹菜素、苍术酮、槲皮素和紫花前胡苷。其中，没食子酸对ACE2、RBD和3CLpro有强效作用；芹菜素对ACE2和RBD有效；苍术酮对RBD有效；槲皮素对RBD和3CLpro有效；紫花前胡苷对3CLpro有效。SARS-CoV-2的刺突蛋白包含两个亚基：识别细胞受体的S1亚基和促进膜融合的S2亚基。我们利用SPR技术研究了五种潜在抗病毒化合物（没食子酸、芹菜素、苍术酮、槲皮素和紫花前胡苷）与S2蛋白的结合亲和力。值得注意的是，没食子酸、芹菜素、槲皮素和苍术酮与S2蛋白结合，其K D值分别为3.53 µmol∙L-1、2.81 µmol∙L-1、8.75 µmol∙L-1和7.46 µmol∙L-1（附录A图S16）。这些化合物的抗病毒活性可能源于它们干扰刺突蛋白与ACE2的结合，或通过与S2亚基结合阻止S2蛋白发生必要的构象变化。然而，这些相互作用的具体机制仍需进一步研究。通过用WIV04感染Vero-E6细胞，进一步验证了这些单体的抗病毒效果。紫花前胡苷对病毒载量的抑制作用最为明显，并能降低CCL-2、CCL-3和TNF-α的表达。因此，紫花前胡苷被认为是SHHS中治疗COVID-19的一种有效的抗病毒和抗炎化合物。

先前的研究表明，这种香豆素苷类化合物具有抗炎、抗氧化和抗凋亡作用[42‒43]。研究表明紫花前胡苷可能通过抑制3CLpro的表达发挥抗病毒作用，此前无其有关抗病毒作用的报道。紫花前胡苷是中药羌活（羌活的根茎和根，来源于Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang 或 Notopterygium Boiss）的化学成分，在中医理论中，羌活具有散寒化湿的作用，这一功效与SHHS的作用相吻合。值得注意的是，在大鼠的血浆、肺和粪便中均检测到了紫花前胡苷，表明其具有全身分布性。进一步的HDX-MS研究发现，紫花前胡苷通过非共价结合与3CLpro相互作用，这与之前报道的大多数通过与半胱氨酸进行共价结合发挥作用的3CLpro抑制剂不同，从而揭示了一条独特的抑制途径。

总之，我们通过体内外实验证明，SHHS具有抑制病毒侵袭和增殖的能力，并发挥显著的抗炎作用。SHHS中的化合物紫花前胡苷通过抑制3CLpro酶活性来发挥抗病毒作用。我们的发现为阐明SHHS对抗COVID-19的机制提供了有价值的见解，有助于更广泛地理解其治疗潜力。

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