黑磷/E7功能化磺化聚醚醚酮具有高效成骨和抗菌活性

王笑 ,  张舒凝 ,  朱爱 ,  曹玲燕 ,  徐龙 ,  王俊杰 ,  郑飞 ,  张翔凯 ,  陈红艳 ,  蒋欣泉

工程（英文） ›› 2025, Vol. 46 ›› Issue (3) : 147 -161.

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工程（英文） ›› 2025, Vol. 46 ›› Issue (3) : 147 -161. DOI: 10.1016/j.eng.2024.07.019
研究论文

黑磷/E7功能化磺化聚醚醚酮具有高效成骨和抗菌活性

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Black Phosphorus and E7-Functionalized Sulfonated Polyetheretherketone with Effective Osteogenicity and Antibacterial Activity

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摘要

医用聚醚醚酮（PEEK）因其优异的生物学性能以及与人体骨组织相匹配的弹性模量，被认为是理想的骨植入材料候选者。然而，PEEK材料在骨结合和抗菌性能方面的不足极大限制了其临床应用。为应对此挑战，迫切需要开发一种多功能的PEEK植入物。本研究通过黑磷纳米片（BP）、贻贝启发的聚多巴胺（PDA）以及生物活性短肽E7在磺化PEEK（sPEEK）上的自组装，成功构建了一种新型光响应的多功能PEEK 植入材料（sPEEK/BP/E7），该材料不仅展示了优异的成骨诱导性，还具有显著的抗菌能力。sPEEK/BP/E7表面微纳结构改性层在近红外（NIR）照射下展现出良好的亲水性、理想的成骨性及显著的光热效应。体外实验结果表明，sPEEK/BP/E7在骨髓间充质干细胞的黏附、增殖、碱性磷酸酶（ALP）活性、矿化以及成骨相关基因表达等方面，均优于sPEEK和sPEEK/BP组，显示出更强的细胞相容性和成骨诱导性。除促进成骨外 ，该多功能改性层还对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大肠杆菌（Escherichia coli）表现出强大的抗菌活性。在大鼠股骨感染模型中也证实，sPEEK/BP/E7在NIR照射下有效抵抗了由金黄色葡萄球菌引发的感染，并促进体内骨结合。因此，本研究提出了一种简单有效的策略，为实现骨植入材料PEEK“功能集成”的改进提供了新的思路，并为其临床应用奠定了基础。

Abstract

Given its excellent biological properties and the matching of its elastic modulus with that of human bone tissue, medical polyetheretherketone (PEEK) is considered a desirable candidate for bone-implant materials. However, its poor osseointegrative and antibacterial properties greatly limit its clinical application. To address these concerns, a functional PEEK implant is needed. Herein, a novel photo-responsive multifunctional PEEK-based implant material (sPEEK/BP/E7) with both effective osteogenesis and good disinfection properties was constructed via the self-assembly of black phosphorus (BP) nanosheets, mussel-inspired polydopamine (PDA), and bioactive short peptide E7 on sulfonated PEEK (sPEEK). The versatile micro-/nano-structured PEEK surface provides superior hydrophilicity, a favorable osteogenic microenvironment, and excellent photothermal effects under near-infrared (NIR) irradiation. The in vitro results showed that sPEEK/BP/E7 displays enhanced cytocompatibility and osteogenicity in terms of cell adhesion, proliferation, alkaline phosphatase (ALP) activity, matrix mineralization, and osteogenesis-related gene expression, superior to those of the sPEEK and sPEEK/BP samples. In addition to osteogenesis, the multifunctional coating exhibited strong antibacterial activity against both Staphylococcus aureus (S. aureus) and Escherichia coli (E. coli). Furthermore, it was confirmed in a rat femoral infection model that sPEEK/BP/E7 effectively resisted infection caused by S. aureus under NIR light irradiation and promoted osseointegration in vivo. Thus, this work presents a facile strategy to realize improvement of the “functional integration” of new polymer bone–implant materials and provide new ideas for their clinical application.

关键词

聚醚醚酮 / 黑磷纳米片 / E7 多肽 / 干细胞募集 / 成骨 / 抗菌

Key words

Polyetheretherketone / Black phosphorus nanosheets / E7 peptides / Stem cell recruitment / Osteogenesis / Antibacterial

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王笑,张舒凝,朱爱,曹玲燕,徐龙,王俊杰,郑飞,张翔凯,陈红艳,蒋欣泉. 黑磷/E7功能化磺化聚醚醚酮具有高效成骨和抗菌活性[J]. 工程（英文）, 2025, 46(3): 147-161 DOI:10.1016/j.eng.2024.07.019

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1 引言

聚醚醚酮（PEEK）作为一种高性能的半结晶聚合物，因其优异的生物相容性、化学稳定性、固有的射线透过性以及与人体皮质骨高度匹配的弹性模量，被认为是理想的骨植入材料[1‒2]。然而，PEEK的生物惰性阻碍了其与天然骨组织的整合，而使植入物界面成骨不佳[3‒4]。此外，由于其惰性，细菌容易在植入物与骨界面上定植，引发植入部位的感染[5‒6]。这些问题可能导致植入物松动甚至完全失效，进而需要额外的医疗干预或进行二次手术[7]。因此，亟须对PEEK进行功能的改造，使其具备优异的抗菌和成骨特性，从而在植入后主动形成良好的骨结合界面，显著延长PEEK植入物的使用寿命，并扩大其临床应用范围。

为了赋予植入物抗菌性能，已有多种基于表面整合抗生素、抗菌纳米颗粒、抗菌肽以及表面拓扑结构改性的方法被报道。然而，这些抗菌方法高度依赖于所载药物的内在抗菌活性[8‒9]，且通常需要较长时间才能发挥作用，难以实现按需、循环的抗菌效果。相比之下，光热疗法（PTT）通过将光能转化为热能，在原位实现细菌的热消融，而成为一种远程可控、无创、具有深度组织穿透性且组织相容性良好的新兴方法，在治疗细菌感染方面展现出巨大的应用潜力[10‒12]。值得注意的是，研究表明局部高温可以上调细胞热休克蛋白和骨形态发生蛋白的表达，促进矿化晶体生成，从而加速骨修复过程[13]。光热转化剂（PTAs）在光热疗效中起着关键作用，目前用于抗菌植入物的PTAs包括碳基纳米材料、窄带隙半导体、等离子体纳米材料和MXenes等[14]。其中，黑磷（BP）纳米片作为一种新型二维（2D）窄带隙半导体，可通过光热效应破坏细菌细胞壁并引发蛋白质变性，从而有效杀灭细菌[15‒16]。此外，黑磷纳米片由于其独特的褶皱结构，具有极高的比表面积，成为药物分子或生物分子的理想载体[17‒18]。BP的降解产物为无毒的磷酸盐，可以通过捕获钙离子并加速细胞分化和信号转导，在骨缺损部位加速矿化过程[19]。尽管BP纳米片展现出出色的抗菌和成骨潜力，但其在复杂的生理环境中生物降解性较高[20]，因此，在生物应用中通常需要对其进行改性。据报道，聚多巴胺（PDA）可以增强裸露BP纳米片的稳定性和光热性能[21‒22]。具有“生物胶”作用的PDA能够稳定BP纳米片，且可自组装形成兼具高比表面积和黏性的复合纳米粒子，为后续功能分子的负载提供了理想的平台[19,23]。

在感染的微环境中，局部成骨环境被严重破坏，骨再生和修复极具挑战性。因此，骨植入材料不仅需要具备抗感染特性，还应具备重塑植入物周围成骨微环境的能力。近年来，为同时实现PEEK植入物的抗感染与有效骨结合，多种多功能涂层的研发不断被推进[24‒27]。研究表明，募集内源性骨髓间充质干细胞（BMSCs）至植入物-骨界面是实现骨结合的有效策略[28‒29]。BMSCs早期有针对性地募集到缺损区域是其随后成骨的关键[30‒31]。更高的BMSCs黏附率还可以通过“表面竞争”减少植体表面细菌的定植[32]。E7是一种由7个氨基酸组成的短肽，通过噬菌体展示技术发现其对BMSCs具有特异性亲和力[33]。它可以通过上调趋化因子的分泌，促进BMSCs的黏附和迁移，从而实现原位骨再生[29,34]。此外，与功能蛋白相比，短肽对局部环境变化（如pH值和温度变化）具有更强的抵抗力，同时制备简单且成本低廉，更适用于材料的表面改性[35]。

在之前的研究中，我们成功在丝蛋白支架表面修饰了E7多肽。体内外实验结果表明，E7修饰的支架在缺损区域募集了更多的BMSCs，并促进支架表面细胞的增殖和成骨向分化，从而加速早期骨修复[36]。因此，E7在增强BMSCs募集和成骨方面具有巨大潜力。我们希望通过在惰性PEEK表面引入E7，改善植入物表面早期原位成骨过程，从而促进植入物的骨结合。

基于这些考虑，我们设计并制造了新型多功能PEEK植入材料（sPEEK/BP/E7）。首先对PEEK进行了表面磺化处理，然后依次组装了BP/PDA和E7。在这些组分中，磺化PEEK（sPEEK）在植入物表面形成了三维（3D）网络结构，有助于促进细胞增殖和成骨相关基因的表达[37]。在近红外（NIR）照射下，BP/PDA作为PTA，实现了植入物周围高效、非侵入性且可控的光热抗菌治疗。E7通过募集干细胞，在植入物的骨结合和成骨过程中发挥关键作用。同时，随着多功能涂层的降解，BP的降解产物吸引游离钙离子形成磷酸钙，促进局部矿化。总体而言，我们设想该sPEEK/BP/E7植入物能够提供可控的光热抗菌效果，并在原位募集BMSCs，促进成骨以实现植体表面骨结合。我们进行了体内外成骨和抗菌评价，以验证此改性PEEK植入物的生物安全性和有效性。

2 材料和方法

2.1 sPEEK/BP/E7的制备

本文使用了不同尺寸的医用级PEEK（450 G; Victrex, 英国），包括圆盘（ϕ10 mm  × 1 mm或ϕ20 mm × 1 mm）和棒状（ϕ2 mm × 8 mm）。首先，将PEEK材料置于97 wt%~99 wt%的硫酸（Sigma，美国）中，在25 ℃条件下进行磁力搅拌5 min，从而形成具有均匀3D多孔纳米结构表面的sPEEK。为去除残留酸性物质，样品在100 mL聚四氟乙烯衬里的反应釜中在120 ℃下进行6 h的水热处理，随后冷却至25 ℃。然后，将BP纳米片（0.5 mg∙mL-1；华威锐科）与PDA（2 mg∙mL-1；阿拉丁）在Tris-HCl缓冲液（pH = 8.5）中混合，再将sPEEK浸入BP/PDA溶液中12 h，之后用蒸馏水进行三次超声清洗。随后，将经BP/PDA修饰的sPEEK样品（sPEEK/BP）浸泡在200 μg∙mL-1的E7（纯度：95.64%；中科亚光）溶液中，在4 ℃条件下反应24 h以接枝E7肽，并进行真空干燥。最后样品在去离子水中清洗去除未结合的E7，经过空气干燥后获得最终的sPEEK/BP/E7样品。

2.2 材料表征

使用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM；Zeiss，德国）和能量散射光谱仪（EDS；Phenom ProX，荷兰）对样品的表面形貌和元素分布进行了观察和分析。使用接触角测量仪（Dataphysics，德国）测量样品的水接触角（WCA）以评估其亲水性。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM；Leica，德国）观察样品上标记有罗丹明的E7肽分布情况。此外，为了评估E7的释放情况，将样品浸泡于37 ℃的磷酸盐缓冲液（PBS）中，使用二辛可宁酸（BCA）蛋白质测定试剂盒（Abcam，英国）分别在1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d和28 d测定PBS中E7的浓度。

2.3 改性样品的光热效应

使用红外热成像系统（FLIR，美国）对改性样品（sPEEK、sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7）的光热性能进行了表征。简而言之，将不同样品（ϕ10 mm × 1 mm）放置在24孔板中，滴入1 mL PBS，并用808 nm NIR激光（0.5 W∙cm-2）照射500 s，每20 s记录样品的温度和热成像。我们还研究了在不同功率（0.3 W∙cm-2、0.4 W∙cm-2和0.5 W∙cm-2）808 nm NIR激光照射下，sPEEK/BP/E7的光热转换情况。此外，还检测了样品在干燥条件受808 nm NIR照射的光热效应。我们进一步评估了植入大鼠股骨的sPEEK/BP/E7棒状样品的光热性能，以模拟体内光热转换情况。具体的植入细节见第2.7节。

2.4 细胞活性

2.4.1 细胞的培养

本研究中所用的BMSCs来源于4周龄Sprague-Dawley（SD）大鼠的股骨骨髓。所有实验操作均经上海交通大学医学院附属第九人民医院动物伦理委员会批准。细胞培养采用高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM; Gibco，美国），其中添加了10%的胎牛血清（FBS; Gibco）和1%的青霉素/链霉素双抗溶液（Gibco），在37 ℃、5% CO2的环境中进行培养。细胞培养基每三天更换一次，取第2~3代的BMSCs用于后续实验。

2.4.2 BMSC的增殖

使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU；赛默飞世尔科技公司，美国）染色和细胞计数试剂盒（CCK-8；Dojindo，日本）对不同PEEK样品上的细胞增殖进行了检测，所有操作均严格按照制造商的说明进行。在EdU染色实验中，将细胞接种于24孔板中的样品表面（每孔3 × 104个细胞），共同孵育3 d。随后，所有样品在暗室中与EdU培养基共同孵育2 h，并使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；碧云天科技公司）对细胞核进行染色。染色完成后，使用荧光显微镜（Zeiss）对细胞进行观察。在CCK-8实验中，细胞在样品表面分别培养1 d、3 d、5 d和7 d后，将培养基与10%的CCK-8试剂混合，孵育1 h后，取100 μL上清液转移至96孔板中，并使用酶标仪（TECAN Spark，瑞士）在450 nm波长处测量溶液的光密度（OD）。

2.4.3 BMSC 的黏附

通过细胞黏附相关蛋白的表达，我们研究了BMSCs在不同样品表面的黏附情况。具体而言，我们通过免疫荧光染色对细胞的黏着斑蛋白和整合素β1的表达水平进行了评估。将BMSCs接种于24孔板中不同样品表面（每孔5 × 104个细胞），培养12 h并用4%的多聚甲醛固定后，使用小鼠单克隆抗黏着斑蛋白或抗整合素β1一抗（赛维尔公司）进行处理，然后加入Alexa Fluor 488标记的二抗（Abclonal，美国）孵育。随后，用TRITC-鬼笔环肽（Abclonal）和DAPI进行染色并通过CLSM观察上述细胞。

2.5 体外成骨性

2.5.1 BMSC的募集

通过Transwell实验，我们评估了不同样品对BMSCs的募集效果。简而言之，将各样品放置在24孔板中的Transwell下室，将BMSCs接种于上室（每孔5 × 104个细胞）。经过无血清培养基孵育24 h后，去除上室中未迁移的细胞。使用4%多聚甲醛固定迁移至Transwell膜底部的细胞，并用0.5%结晶紫溶液染色10 min。随后，在光学显微镜（Zeiss）下观察细胞的形态和数量，并通过ImageJ软件（Rawak Software，德国）进行分析，以评估样品对BMSCs迁徙的影响。

2.5.2 碱性磷酸酶（ALP）检测

将BMSCs接种于24孔板中不同样品的表面（每孔5 × 104个细胞），培养7 d后进行ALP染色。首先，用4%多聚甲醛固定BMSCs，随后用PBS进行清洗。根据说明，使用氯化硝基四氮唑蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸对甲苯胺盐（NBT/BCIP，碧云天科技公司）进行染色，染色结果通过倒置显微镜（Nikon，日本）观察。ALP蛋白的半定量测量通过ALP检测试剂盒（碧云天科技公司）完成，并记录405 nm波长处的OD值，使用BCA蛋白检测试剂盒（赛默飞世尔科技公司，美国）测定总蛋白浓度以进行归一化分析。

2.5.3 茜素红S（ARS）检测

在24孔板中的样品表面培养BMSCs（每孔5 × 104个细胞）14 d后，对钙沉积情况进行研究。细胞固定后，用1%茜素红S（Sigma）染色10 min，然后在倒置显微镜下观察钙沉积。随后，将染色后的样品浸泡在10%氯化十六烷基吡啶（Sigma）溶液中，在590 nm波长下检测溶液的OD值，并通过总蛋白浓度进行归一化分析。

2.5.4 免疫荧光染色

通过免疫荧光染色（一抗购自赛维尔公司），对细胞的成骨相关蛋白进行分析，包括成骨相关转录因子（osterix）、Runt相关转录因子2（Runx-2）和骨钙素（OCN），相关处理参见第2.4.3节。为了检测osterix和Runx-2，将BMSCs（每孔5 × 104个细胞）在样品表面培养3 d；而检测OCN，细胞的培养时间为7 d。Osterix通过Alexa Fluor 594标记的二抗（Abclonal）进行染色，Runx-2和OCN通过Alexa Fluor 488标记的二抗（Abclonal）进行染色，最后，通过CLSM观察细胞的染色情况。

2.5.5 实时聚合酶链反应（RT-PCR）

为进一步检测成骨基因的表达水平，在6孔板中将BMSCs（每孔2 × 105个细胞）接种于直径为20 mm的sPEEK、sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7样品表面，分别培养3 d和7 d后，通过总RNA提取试剂（TRIzol, Invitrogen，美国）从不同样品上的BMSCs中提取总信使RNA（mRNA）。严格按照制造商的说明，使用反转录试剂盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，赛默飞世尔科技公司）将mRNA反转录为互补DNA（cDNA）。接着，使用ABI 7500型实时荧光定量PCR仪（赛默飞世尔科技公司）和SYBR Green染料（罗氏，瑞士）对Runx-2和ALP（3 d）、OCN和I型胶原蛋白（Col I, 7 d）进行了实时聚合酶链反应分析。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因进行归一化处理。定量分析通过2-ΔΔCt方法进行。

2.6 体外抗菌活性

2.6.1 细菌的培养和处理

用金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus; ATCC 25923）和大肠杆菌（Escherichia coli; ATCC 25922）进行实验。两种细菌均在Mueller-Hinton肉汤（MHB；赛默飞世尔科技公司）中培养。为了评估样品在NIR照射后的抗菌效果，将500 μL的细菌悬液[1 × 106 菌落形成单位（CFU）·mL-1]与直径为10 mm的sPEEK、sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7样品共同孵育于24孔板中，并接受808 nm NIR照射（0.5 W∙cm-2）8 min，随后，将孔板置于37 ℃下培养12 h，以便存活的细菌在样品表面生长和定植。

2.6.2 细菌平板涂布实验

通过细菌平板涂布实验评估各样品在NIR照射后的体外抗菌率。样品在细菌培养箱中放置12 h后，用无菌PBS轻轻冲洗以去除未附着的细菌。随后，将样品在PBS中超声处理5 min，分离附着的细菌。最后，将稀释后的细菌悬液涂布在琼脂平板上，在37 ℃下培养18 h后，对CFU的数量进行成像和计数。

2.6.3 活/死细菌染色

通过活/死细菌染色剂（Invitrogen）检测样品表面细菌的活性和膜完整性。细菌与样品共培养12 h后，使用SYTO9和碘化丙啶（PI）对细菌进行染色。在CLSM下，活细菌呈现绿色荧光，而死细菌则由于细胞膜受损呈现红色。

2.6.4 生物透射电镜（TEM）分析

通过生物TEM（Philips EM 201，美国）观察培养在样品表面的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。共培养后，附着在样品上的细菌通过超声分离，并通过离心收集。随后，这些细菌在4 ℃下用2.5%戊二醛固定1 h，然后依次使用不同浓度的乙醇进行脱水处理。最后，将细菌包埋在树脂中，并切割成约100 nm厚的超薄切片，以便通过生物TEM进行观察。

2.7 体内研究

2.7.1 植入手术及术后处理

在获得动物伦理委员会批准（SH9H-2024-A617-SB）后，我们开展了体内实验。手术前，将不同的棒状PEEK样品均匀涂覆上金黄色葡萄球菌培养液（2 × 103 CFU），然后将这些植入物置于37 ℃的细菌培养箱中孵育4 h，以促进细菌的附着。

为了进行体内实验，我们构建了大鼠股骨髁缺损模型。本研究使用8周龄、体重约为200 g的SD大鼠。对于体内光热抗菌的研究，我们选择了六只大鼠，分别在其左和右股骨植入sPEEK植入物和sPEEK/BP/E7植入物。对于成骨作用的研究，将大鼠分为三组（每组六只）：sPEEK组、sPEEK/BP组和sPEEK/BP/E7组。所有手术均在无菌条件下进行。腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg∙kg-1）进行麻醉后，通过手术切口暴露大鼠膝关节附近的股骨。使用直径为2 mm的手术钻头沿股骨长轴方向在股骨髁部钻出一个约8 mm长的通道，直至骨髓。手术过程中间歇使用冷无菌生理盐水冲洗手术部位，以防出现热损伤。随后，使用无菌镊子小心地将不同的植入物插入制备的缺损中。接着，缝合软组织和皮肤。每只大鼠的左右股骨均进行植入。术后，所有动物均接受镇痛和安抚措施。

术后一天，对植入部位进行808 nm NIR照射，功率为0.5 W∙cm-2，持续10 min，并使用红外热成像系统记录图像和温度。此外，对于用于成骨研究的大鼠，在术后2周和4周，分别腹腔注射30 mg∙kg-1的ARS（Sigma）和20 mg∙kg-1的钙黄绿素（Sigma），以标记新骨的形成。

2.7.2 体内抗菌评价

术后一周，通过过量注射戊巴比妥钠，将用于抗菌研究的六只大鼠安乐死，并取出其股骨。为确定不同植入物上的细菌附着情况，每组中选择三根植入物，在1 mL PBS中超声处理10 min，以分离附着的细菌。随后，将细菌稀释液涂布在琼脂平板上，并在37 ℃下孵育18 h，然后进行菌落计数。此外，将剩余的植入物浸入5 mL MHB中（每管一根，n = 3），并在37 ℃下孵育过夜。随后，使用数码相机记录细菌培养液的浊度。

植入物所在的股骨被轻柔地取出，并在甲醛溶液中固定2天。随后，这些样品依次在不同浓度的乙醇溶液（50%、70%、90%、100%和100%）中逐步脱水，接着进行二甲苯渗透、石蜡包埋和切片。最后，石蜡包埋的切片使用苏木精和伊红（H&E）染色，并通过观察这些切片中的炎症情况，评估植入物周围组织的感染状态。

2.7.3 微型计算机断层扫描（micro-CT）分析

术后八周，对用于成骨研究的大鼠进行安乐死。为了研究骨-植入物界面的骨整合情况，使用micro-CT（Bruker，美国）获取植入物周围新生骨的高分辨率图像。随后，利用配套的分析软件进行三维重建，以将植入物周围的骨组织从背景中分离出来。此外，选择距植入物表面半径为1 mm的髓腔区域，分析骨体积/总体积（BV/TV）、骨矿物质密度（BMD）、骨小梁数目（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）。

2.7.4 组织病理学评价

在micro-CT分析后，我们对样品进行了苦味酸-品红（VG）染色。首先，将含有不同PEEK植入物的股骨固定在4%多聚甲醛中；随后，依次在乙醇溶液中脱水和在二甲苯中浸润；最后，将样品包埋在聚甲基丙烯酸甲酯中。使用硬组织切片机（Leica）垂直或沿植入物的长轴切割，制备未脱矿的切片。然后将这些切片磨至40 µm厚度，并进行抛光。使用CLSM在543/617 nm和488/517 nm的激发/发射波长下分别观察ARS（红色）和钙黄绿素（绿色），以示新骨形成情况。最后，使用光学显微镜获取VG染色图像，并评估新生骨面积和骨-植入物接触情况。

此外，为评估sPEEK/BP/E7在NIR照射下的生物安全性，术后8周对大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行了组织学评估。按照上述方法对这些器官进行包埋和切片后，进行H&E染色和显微观察。

2.8 统计学分析

半定量和定量实验的数据均以平均值±标准差的形式表示，所有实验（每个实验至少重复三次）的结果均使用GraphPad Prism（9.0）进行统计分析。对于sPEEK组与sPEEK/BP/E7组之间的体内抗菌评价的结果，采用Student t检验进行分析。对于sPEEK、sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7组之间的其他结果，则采用单因素方差分析（ANOVA）进行分析。统计显著性水平设定为p值小于0.05。

3 结果与讨论

3.1 sPEEK/BP/E7的表征

如图1所示，新型多功能PEEK植入材料（sPEEK/BP/E7）通过在惰性PEEK表面构建多功能药物和功能分子系统制备而成，预期具有成骨和抗菌性能。

通过FE-SEM观察不同样品的表面形貌[图2（a）]，发现sPEEK表面形成了微/纳米级3D多孔网络结构，有利于细胞锚定和组织生长[3,38]；经过BP/PDA和E7的逐层修饰后，这种多孔结构变得更加复杂，孔的数量增加，孔径减小至约为500 nm。使用EDS检测sPEEK/BP/E7表面的元素组成和分布。如图2（b）和（c）所示，碳（C）、氧（O）、硫（S）、氮（N）和磷（P）等元素在sPEEK/BP/E7表面均匀分布，其中磷和氮含量的相对增加表明BP纳米片和肽的均匀负载。这种材料构建的情况主要归因于BP纳米片的活性位点以及PDA的键合特性，使聚合物之间能够通过π-π堆叠和静电相互作用形成连接[13,26,39]。此外，E7标记后的荧光图像[图2（d）]显示，E7肽（红色荧光）成功且均匀地修饰于sPEEK/BP表面，这一过程依赖于BP/PDA衍生的Michael加成反应或Schiff碱反应[40]。

接着，我们评估了不同样品的表面亲水性。sPEEK表现出疏水性，其WCA超过90°（99.85° ± 9.57°），如图2（e）所示。在经过BP/PDA修饰后，由于BP/PDA的亲水性[13,41]，使sPEEK/BP的亲水性增强（WCA为53.7°）。与E7肽结合后，样品表面亲水性进一步增强，WCA为40.3°。因此，相较于sPEEK，sPEEK/BP/E7显示出更好的润湿性，可以增加细胞与生物材料之间的亲和力，这有助于BMSCs的黏附和成骨反应[42]。

在植入物表面负载功能性因子可以增强其生物活性。因此，我们进一步研究了改性样品表面的E7肽的释放情况[图2（f）]。E7的初期释放非常明显，这与成骨过程中细胞迁移在早期水平最高的事实一致[43‒44]。sPEEK/BP/E7中，E7肽实现了长期缓慢释放，这得益于表面三维网络结构、BP纳米片的高比表面积以及PDA强黏附的综合作用。

随后，我们评估了不同样品的光热性能。在808 nm NIR（0.5 W∙cm-2）照射下，sPEEK、sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7在PBS中的温度变化如图1（g）所示。经过500 s的照射后，sPEEK表面温度从26.8 ℃升至39.5 ℃，而sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7的表面温度则迅速升至51.4 ℃和51.2 ℃，表明这两种表面改性具有显著的光热效应。此外，当NIR的功率从0.3 W∙cm-2调至0.4 W∙cm-2或0.5 W∙cm-2时，sPEEK/BP/E7的表面温度分别升至44.8 ℃、48.6 ℃和51.3 ℃ [图2（h）]。这种功率依赖性的光热转换能力与此前关于BP纳米片光热效应的研究结果[45]一致。温度变化的时间依赖性和功率依赖性表明，这种新型涂层的光热效应是可控的。在干燥环境下的红外热成像显示，sPEEK/BP/E7在照射1 min、3 min和5 min后，温度分别升至45.5 ℃、62.7 ℃和70.1 ℃ [图2（i）]。在湿润的PBS环境中，sPEEK/BP/E7的温度在相同时间下分别升至38.4 ℃、46.4 ℃和50.7 ℃ [图2（j）]。sPEEK/BP/E7表面温度的均匀分布间接表明，其表面涂层分布均匀。这些结果表明，BP/PDA的存在及其均匀分布在赋予sPEEK/BP/E7的光热效应方面应起到了关键作用。

3.2 体外细胞活性

为了展示骨植入材料的应用潜能，我们探讨了这种新型多功能PEEK材料的细胞相容性。图3（a）显示了在sPEEK、sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7样品上培养BMSCs 3 d后的EdU染色结果。EdU（红色）掺入到正在复制的细胞DNA中，从而显示出增殖中的细胞，细胞核则通过DAPI染色呈现蓝色。sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7（特别是经过E7修饰的sPEEK/BP/E7）不仅其表面上有更多的细胞数量，而且有更多的细胞处于增殖状态。随后，使用CCK-8法量化了不同样品表面的BMSCs随时间变化的增殖情况[图3（b）]。结果显示，细胞数量随时间逐渐增加。在3 d、5 d和7 d，sPEEK/BP表面上的细胞数量均高于sPEEK，这与先前文献[19]中BP/PDA促进BMSCs增殖的报道一致。sPEEK/BP/E7组表现出最高的细胞活力，已有研究表明E7肽有助于维持BMSCs的活力[34]。

为了评估不同样品表面上BMSCs的黏附能力，我们对整合素β1和黏着斑蛋白进行了免疫荧光染色。如图3（c）所示，黏着斑蛋白（绿色）定位于黏着斑处。附着在sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7上的BMSCs具有更为延展的细胞骨架，并表达更多的黏着斑蛋白。此外，与sPEEK相比，sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7上的BMSCs整合素β1 [图3（d），绿色]与肌动蛋白细胞骨架[图3（d），红色]的分布更加广泛。微观结构对BMSCs黏附的促进可能通过增强血清蛋白的吸附来实现。良好的细胞黏附活性（特别是整合素β1的上调）在激活整合素/FAK信号通路中起着重要作用；这可以进一步激活许多下游通路，如MAPK/Erk和PI3K/Akt，这些通路与血管生成和成骨分化密切相关[46]。

3.3 体外成骨性

吸引内源性BMSCs以进行原位骨再生是一种有效的骨修复策略。我们之前的研究表明，原位使用趋化因子有助于将更多的干细胞募集到受损区域，并促进细胞增殖[36]。本研究通过Transwell迁移实验评估了不同样品对BMSCs迁移的诱导作用。结果显示，sPEEK/BP/E7组跨越孔隙的细胞数量显著高于sPEEK和sPEEK/BP组[图4（a）和（b）]，证实了E7对BMSCs具有高亲和力和募集能力。据报道，E7可以促进间充质干细胞中内源性趋化因子SDF-1α的自分泌，从而诱导细胞迁移[29,47]。此外，这种原位募集干细胞的方式避免了烦琐的体外种子细胞培养和免疫性疾病的发生[48]，因此E7在募集BMSCs促进原位骨再生方面非常重要。

随后，我们进一步验证了改性表面的成骨作用。首先，我们检测了成骨分化的早期标志物ALP [49]，如图4（c）和（d）所示。在样品表面培养细胞7 d后，所有样品上均出现了明显的ALP染色。值得注意的是，在sPEEK/BP/E7组，大多数细胞表现出ALP的强阳性表达。相比之下，其他两组中强阳性表达的细胞数量较少。这一观察结果与半定量的ALP数据一致，表明BP/PDA和E7的改性有利于早期成骨分化。

共培养14 d后，通过ARS染色进一步评估了不同样品上细胞外基质（ECM）的矿化情况。图4（e）和（f）显示，sPEEK/BP/E7样品上的ECM矿化水平最高，其次是sPEEK/BP组。这些发现表明，E7在增强细胞基质矿化中起着重要作用，且与BP/PDA具有协同效应。sPEEK/BP/E7的成骨作用可能归因于BP纳米片的降解产物和E7的成骨诱导特性。BP纳米片降解成的磷酸根离子可以捕获钙离子，从而促进骨组织矿化。此外，据报道，E7具有一定的成骨特性，且sPEEK/BP/E7良好的细胞黏附性也有助于细胞成骨分化[35,50‒51]。

免疫荧光染色结果显示了细胞中成骨相关蛋白的表达。Runx2能够提高osterix、OCN和Col I的表达水平[52]。Osterix是一种含锌指的转录因子，是细胞成骨分化所必需的早期标志物[53]。共培养3 d后，sPEEK/BP组的Runx2和osterix表达略有增加，而E7的引入显著提高了这些蛋白的表达水平[图5（a）]，表明sPEEK/BP/E7具有出色的成骨诱导能力。在成骨分化的后期，OCN的活性标志着矿物沉积，sPEEK/BP/E7表面的BMSCs在7 d表现出显著的OCN上调[图5（b）]。定量荧光强度显示各组间存在显著差异[图5（c）和（d）]。

RT-PCR用于评估细胞内成骨相关基因的水平，结果如图5（e）~（h）所示。Runx2和ALP与早期成骨分化相关，在3 d时，三组之间的差异具有统计学意义，且sPEEK/BP/E7组最高。7 d后，sPEEK/BP/E7组的成骨标志物（Col I和OCN）表达水平显著上调，且明显高于sPEEK/BP和sPEEK组，这表明BP/PDA和E7协同创造了更好的成骨条件。E7与sPEEK/BP/E7优异的细胞黏附性和磷酸环境相结合，是导致sPEEK/BP/E7组成骨标志基因表达水平显著提高的原因。这些发现与成骨相关蛋白的表达结果一致，揭示了sPEEK/BP/E7具有诱导BMSCs成骨分化的能力。这种干细胞招募和细胞成骨分化的协同策略，赋予了PEEK植入物卓越的成骨能力[54]。

3.4 体外光热抗菌活性

术区细菌感染是骨植入手术后的常见并发症。在NIR照射下，我们评估了不同样品的抗菌活性。首先，通过平板涂布法研究了不同样品对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的影响。如图6（a）和（b）所示，由于缺乏光热作用，大量的金黄色葡萄球菌可以从sPEEK表面洗脱。相反，在NIR照射后，金黄色葡萄球菌未能附着在sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7表面。与sPEEK相比，BP/PDA的负载对金黄色葡萄球菌表现出100%的抗菌率。对于大肠杆菌[图6（c）和（d）]，与sPEEK相比，sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7在NIR照射5 min后分别显示出92.7%和93.1%的抗菌率。这些结果表明，sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7具有优异的光热抗菌活性。

为了进一步探讨sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7的潜在抗菌机制，通过活/死（绿/红）细菌染色法[图6（e）和（f）]检查了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的膜完整性。在NIR照射后，sPEEK组几乎所有细菌均呈现绿色，且生长良好，而在sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7组中观察到了大量的红色染色。红色荧光染料PI仅能渗透到受损细菌的膜中[55]，这表明NIR照射导致sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7组中细菌胞膜破裂，从而使样品表面大量细菌死亡。为了进一步研究sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7样品的抗菌性，我们使用生物TEM观察金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的形态变化。如图6（g）所示，sPEEK表面的细菌具有完整且清晰的细胞壁和膜，包裹着密集的细胞质。相反，与sPEEK/BP/E7接触并经过NIR照射后，细菌的细胞壁和膜发生了显著破坏，并且细胞质变得稀疏且明亮，提示细胞质泄漏。这些观察结果表明，BP/PDA修饰的表面在破坏细菌细胞壁和膜中起到了积极作用。该结果与平板涂布实验和活/死染色的结果一致，表明了sPEEK/BP/E7在NIR下优异的可控抗菌性能。

3.5 体内抗菌活性

我们进一步评估了sPEEK/BP/E7在体内的抗菌性能。由于金黄色葡萄球菌是植入物相关感染中最常见病原体之一[48]，我们将被金黄色葡萄球菌附着的不同植入物植入大鼠股骨髁，构建了植入物相关感染的动物模型。首先，我们评估了sPEEK/BP/E7植入体内后的光热转换能力，即通过红外热成像系统记录在808 nm NIR照射下植入部位的实时温度变化，照射持续8 min。如图7（a）和（b）所示，sPEEK组的温度从32 ℃上升到39.3 ℃，而sPEEK/BP/E7组的周围温度上升更多，最终稳定在51.3 ℃左右。尽管sPEEK/BP/E7在体内的光热转换速度略低于体外，但仍能达到有效灭菌的温度[56]。

体内植入物接受NIR照射后，将其取出并在37 ℃的MHB中孵育12 h，以评估植入物表面剩余活细菌的数量。如图7（c）所示，sPEEK组的培养基变得浑浊，表明其上有大量细菌残留。相比之下，sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7组的培养基清澈透明，表明经过BP纳米片修饰和光热作用后，植入物表面的细菌数量显著减少。对不同植入物的体内细菌黏附量的定量评估结果显示，sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7的抗菌率几乎达到100% [图7（d）]，与体外水平相当。这些结果表明，通过远程NIR照射，可以在体内实现植入物表面金黄色葡萄球菌的可控清除。

此外，H&E染色图像[图7（e）]显示，与sPEEK植入物附近观察到的大量炎症细胞相比，sPEEK/BP/E7周围的炎症细胞浸润显著减少，这表明sPEEK/BP/E7的光热抗菌作用，导致了较弱的炎症反应。

3.6 体内成骨和安全性评估

股骨髁感染植入模型还被用于评价植入物的体内骨整合能力。植入8周后，取出大鼠的股骨，所有植入物均存在于股骨髁内。Micro-CT扫描显示，植入物从骨皮质延伸至松质骨[图8（a）]。三维重建图像显示，与sPEEK组相比，sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7组的植入物周围有明显的新骨形成，尤其是在sPEEK/BP/E7组，新骨完全包绕了植入物。图8（b）~（e）显示了micro-CT的定量分析结果。与sPEEK组相比，sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7组的BV/TV、Tb.N、BMD和Tb.Th显著增加，且sPEEK/BP/E7组的这些参数均显著高于sPEEK/BP组。

我们随后制备了VG染色组织切片，以便显微观察和分析植入物表面的新骨形成和骨-植入物接触情况[图8（f）~（h）]。在sPEEK组周围，仅有少量不连续的新骨形成（21.67% ± 1.21%），且骨与植入物之间存在明显的间隙。相比之下，sPEEK/BP组中BP/PDA的修饰促进了新骨形成，新骨面积（45.48% ± 2.68%）显著高于sPEEK组；而sPEEK/BP/E7组的新骨形成面积（77.33% ± 1.89%）更大。此外，骨-植入物接触百分比显示了类似的趋势，sPEEK/BP/E7与骨接触的比例为89.55% ± 2.73%，显著高于sPEEK/BP（40.53% ± 1.89%）和sPEEK（12.07% ± 1.62%）。这些结果与sPEEK/BP/E7在体外实验中对BMCSs的募集和成骨作用一致，表明sPEEK/BP/E7具有优异的骨整合能力。

我们通过在2周和4周时注射红色和绿色荧光染料，记录了不同时间点的新骨形成情况，结果如图8（i）所示。即使在4周时，sPEEK组仍没有显著的新骨形成。在2周或4周时，sPEEK/BP/E7组的荧光面积显著大于sPEEK/BP和sPEEK组[图8（j）]。总体而言，我们开发的sPEEK/BP/E7在骨-植入物界面的早期（2周）、中期（4周）和晚期（8周）阶段，均有效促进了新骨的形成。

最后，我们通过对大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺的评估，检验了sPEEK/BP/E7植入物的体内安全性。H&E染色结果（图9）显示，sPEEK、sPEEK/BP和sPEEK/BP/E7组的这些器官在显微镜下未见显著差异，也未在任何组中发现纳米颗粒的聚集。这些结果表明，sPEEK/BP/E7植入物没有代谢毒性。为了进一步确保其安全性，未来仍需在人体内进行体内评估。

4 结论

本研究通过将BP/PDA和E7逐层组装于sPEEK表面，成功构建了多功能sPEEK/BP/E7植入物。关于这个新型“功能集成”的植入物的主要研究发现如下：

（1）光热效应和光热抗菌活性。BP结合PDA展现出可通过NIR控制的光热特性。这一能力赋予了植入物远程、非侵入性和按需的光热抗菌活性，对于预防或治疗植入物相关感染至关重要。

（2）BMSC募集和成骨作用。得益于E7对BMSCs的亲和性和BP中的磷元素，sPEEK/BP/E7植入物显著增强了BMSCs的募集、黏附、增殖和成骨向分化。因此，该新型植入物展现出优异的骨整合和骨再生能力。

因此，sPEEK/BP/E7植入物有望为临床带来显著的益处，并改善患者的治疗效果。通过结合生化和光热信号，这种创新的植入物不仅增强了骨整合，还大大降低了术后感染的风险。其双功能可以提高植入物的成功率，减少并发症的发生率，从而改善患者的预后，进而显著节省医疗成本和缩短治疗时间。尽管该多功能植入物在感染性骨修复中的作用机制及其长期疗效仍需进一步研究，但sPEEK/BP/E7植入物所代表的集成“全功能”的方法是一种前瞻性的植入物设计方案，为PEEK基材料在骨修复领域的应用提供了新的思路。

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