强化人工湿地低C/N比反硝化——基于电子利用的碳代谢分配重塑分析

石弘弢; 冯骁驰; 肖子杰; 姜辰仪; 王文倩; 曾溱瑶; 杨博文; 司麒石; 吴清莲; 任南琪

doi:10.1016/j.eng.2024.07.020

Engineering ›› 2025, Vol. 45 ›› Issue (2) : 222 -233. DOI: 10.1016/j.eng.2024.07.020

研究论文

强化人工湿地低C/N比反硝化——基于电子利用的碳代谢分配重塑分析

石弘弢 ^a ,
冯骁驰 ^a^,^* ,
肖子杰 ^a ,
姜辰仪 ^a ,
王文倩 ^a ,
曾溱瑶 ^a ,
杨博文 ^a ,
司麒石 ^a ,
吴清莲 ^b ,
任南琪 ^a^,^*

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Enhanced Denitrification in Constructed Wetlands with Low Carbon/Nitrogen Ratios: Insights into Reallocation of Carbon Metabolism Based on Electron Utilization

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摘要

人工湿地（CWs）是一种颇具前景的用于深度净化污水处理厂（WWTPs）二级出水的设施。然而，进水碳氮（C/N）比过低会抑制人工湿地中的反硝化作用，导致湿地系统脱氮效率不佳。本研究通过对比传统人工湿地（对照组）、生物炭强化湿地（BC组）及β-环糊精功能化生物炭改良湿地（BC@β-CD组）的运行效能，系统解析低C/N比条件下人工湿地氮素转化强化机制。研究中发现，BC@β-CD组人工湿地脱氮效率最佳。当进水C/N比分别为4和2时，该组人工湿地的脱氮率相较于对照组和BC组湿地分别提升45.89%和42.48%，同时温室气体一氧化二氮排放量分别显著降低70.57%和85.45%。宏基因组和酶学分析结果表明，BC@β-CD作为基质填料通过协同促进功能微生物碳代谢和提高反硝化酶活性来增强脱氮效果，且不会影响人工湿地中的微生物物种多样性。结构方程模型结果证实，BC@β-CD主要通过提升烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脱氢酶活性和电子传递系统（ETS）运行效率，实现反硝化微生物胞内电子高效合成及传输，从而使得碳代谢产生的电子流更多用于支持反硝化脱氮作用。本研究结果表明，在人工湿地中应用BC@β-CD作为基质填料能够优化脱氮过程中碳代谢产生电子的利用效率，是在低C/N比条件下增强人工湿地深度脱氮的可行策略。

Abstract

Constructed wetlands (CWs) are a promising method to treat effluent from wastewater treatment plants (WWTPs). However, low carbon/nitrogen (C/N) ratios of the influent inhibit denitrification in CWs, resulting in poor nitrogen removal efficiency. Herein, we compared traditional (control), biochar (BC), and β-cyclodextrin-functionalized biochar (BC@β-CD) CW systems to investigate nitrogen removal from influent with low C/N ratios, and the mechanisms that enhance this process. The highest nitrogen removal rates were observed in the BC@β-CD group, with rates 45.89% and 42.48% higher than those of the control, accompanied by a 70.57% and 85.45% decrease in nitrous oxide release, when the C/N ratio decreased from 4 to 2, respectively. Metagenomic and enzymatic analyses indicated that BC@β-CD enhances nitrogen removal by coordinately promoting carbon metabolism and increasing denitrification enzyme activities, without affecting microbial species diversity in CWs. Structural equation modeling confirmed that the foremost advantages of BC@β-CD were effective electron generation and transportation resulting from increased activities of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) dehydrogenase and the electron transfer system (ETS), thereby strategically reallocating more carbon metabolic flow to support denitrification. Our results show that the application of BC@β-CD in CWs to optimize the reallocation of electrons from carbon metabolism is a feasible strategy to enhance denitrification under low C/N conditions.

关键词

人工湿地 / β-环糊精 / 生物炭 / 脱氮 / 碳代谢 / 电子传递效率

Key words

Constructed wetland / β-Cyclodextrin / Biochar / Nitrogen removal / Carbon metabolism / Electron transfer efficiency

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石弘弢,冯骁驰,肖子杰,姜辰仪,王文倩,曾溱瑶,杨博文,司麒石,吴清莲,任南琪. 强化人工湿地低C/N比反硝化——基于电子利用的碳代谢分配重塑分析[J]. 工程（英文）, 2025, 45(2): 222-233 DOI:10.1016/j.eng.2024.07.020

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1 引言

近年来，过量的氮排放造成了全球性的氮素污染，其影响范围从富营养化到气候变化[1]。为了确保水安全和恢复水生态健康，我国污水处理厂（WWTPS）的出水标准越来越严格[2]。虽然标准严格的监管与治理可以在短时间内改善环境质量，但这也会导致过高的处理成本和能源消耗，从而与环境保护的初衷相悖[3‒4]。因此，亟需具有成本效益和环境友好型的市政二级出水净化技术来减轻污水处理厂的处理负担。

人工湿地（CWs）作为污水处理设施，具有造价低廉、操作简便、运行能耗低等优点。基于以上优点，人工湿地现已广泛应用于二级和三级污水处理[5]。人工湿地中的氮代谢主要依赖于微生物的硝化和反硝化作用。硝化作用是由氨氧化菌（AOB）和亚硝酸盐氧化菌（NOB）驱动，将氨氮转化为硝酸盐的氧化过程[6]。反硝化包括一系列还原反应，依次将硝酸盐转化为亚硝酸盐、一氧化氮、一氧化二氮，最后转化为无害的氮气[7]。依据《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB18918‒2002）中的IA级标准，我国污水处理厂二级出水具有低化学需氧量（COD, < 50 mg·L^-1）、氨氮（≤ 5 mg·L^-1）和高硝酸盐残留（10~15 mg·L^-1）的典型特征[8‒9]。然而，地表水能够接收和同化污水的理想总氮浓度为1.5 mg·L^-1 [我国《地表水环境质量标准》（GB3838‒2002）]。因此，污水处理厂二级出水需要进一步处理，以减少其对地表水环境的影响。因此，在低碳氮比条件下实现高效脱氮，对应用人工湿地深度处理污水处理厂二级出水具有重要意义。

通常，人工湿地中硝酸盐的去除主要依靠异养反硝化，这需要微生物氧化有机底物产生电子和能量，来支持NO _x 还原所涉及的生化反应[10]。在低碳氮（C/N）比条件下，有机底物不足将导致反硝化所需的能量和电子供应难以为继，这严重阻碍了反硝化脱氮过程。在实际应用中，常规的解决方案是提供额外碳源以提高脱氮性能。然而，外部添加有机化合物会增加处理过程的碳排放强度和系统的运营成本，这与可持续发展的原则背道而驰[11]。近年来，很多学者为提高反硝化脱氮效率提供了新的调控方向，许多研究报道了具有氧化还原特性的功能材料可以通过促进细胞内电子转移来增强反硝化作用[12‒13]。然而，低碳氮比条件下增强反硝化作用的具体机制尚不清楚。特别是，反硝化过程中电子的产生、转移与最终电子利用之间的相互关系尚不清楚。

由于基质填料为微生物提供了定植和与污染物相互作用的栖息地，人工湿地对于水体污染物的去除效果在很大程度上取决于其所使用的填料类型。在众多的填料之中，生物炭因其比表面积高、孔隙丰富、氧化还原活性高等特点而受到广泛关注[14‒15]。然而，以往的研究[16‒17]大多集中在生物炭的理化性质对人工湿地反硝化效率的影响上，而对低碳氮比条件下强化生物炭反硝化效果的策略关注较少。β-环糊精（β-CD）是一种合成简单、用途广泛的环保型环状低聚糖类化合物。在之前的研究中，我们报道了β-CD通过改善碳代谢、促进电子转移和调节铁获取来提高反硝化模式细菌Paracoccus denitrificans（P. denitrificans）的脱氮能力[16]。此外，在低碳氮比条件下，通过接枝合成水不溶性β-环糊精功能化生物炭（BC@β-CD），我们揭示了BC@β-CD通过提高底物对反硝化的支持利用率，强化P. denitrificans的反硝化性能的机制[17]。因此，BC@β-CD有作为人工湿地基质填料强化人工湿地低C/N比反硝化的应用潜质，但其在复杂系统中的具体作用效果和强化机制尚不清楚。

本研究将BC@β-CD作为功能化基质填料应用于人工湿地中，评估其对湿地系统内反硝化脱氮过程的影响效果，并探讨其具体强化机制。研究中，分别在低碳氮比（4和2）条件下，比较了传统砾石、砾石掺加BC和砾石掺加BC@β-CD作为基质填料时人工湿地的脱氮性能，揭示了BC@β-CD对人工湿地深度脱氮的强化作用。首先，我们使用宏基因组学研究不同组间微生物群落的差异，探讨BC@β-CD对脱氮的影响是否源于功能微生物的富集。随后，基于功能基因丰度和酶学分析，从代谢角度阐明了BC@β-CD对反硝化过程中电子生成、运输和利用的强化情况。最后，利用结构方程模型分析了各要素对反硝化性能的影响，揭示了低C/N比条件下BC@β-CD调控碳代谢向氮代谢再分配的核心机制。本研究不仅提出了BC@β-CD在人工湿地中的新应用，更为低C/N比污水的反硝化强化策略提供了新的见解。

2 材料与方法

2.1 生物炭填料与合成污水的制备

本研究以河北省保定市白洋淀芦苇秸秆为原料制备生物炭。根据我们之前的研究[17]，将秸秆切成1~2 cm的短柱状颗粒，在800 ℃的氮气气氛中热解2 h，得到原始生物炭（BC）。随后，以环氧氯丙烷（ECH）为交联剂，将β-CD接枝到生物炭表面，制备功能生物炭（BC@β-CD）。生物炭活化过程、接枝反应和生物炭表征等过程的详细信息参见附录A中的补充信息S1和S2。本研究中使用的BC和BC@β-CD均为短柱状颗粒，具有良好的机械强度。

为了研究BC和BC@β-CD作为基质填料对人工湿地净化市政污水处理厂尾水效果的影响，我们制备了含硝酸盐氮、氨氮和总磷含量分别为10 mg·L^-1、2 mg·L^-1和1.5 mg·L^-1的合成污水，模拟符合GB18918‒2002（附录A文本S3）中IA级标准排放的二级出水。为探讨C/N比对人工湿地去除污染物性能的影响，实验中以葡萄糖为碳源，在不同运行阶段调节碳氮比。

2.2 人工湿地微生态系统的建设及运行条件

在高50 cm、内径为20 cm的圆柱形聚氯乙烯罐中建立3种实验室规模的人工湿地，分别为对照、BC和BC@β-CD。底部支撑层充填砾石（直径为1~2 cm），深度为10 cm。对于中间功能层，BC组和BC@β-CD组分别填充直径为0.3~0.5 cm、体积比为10%的BC和BC@β-CD砾石，填充高度为30 cm。对照组在不添加生物炭的情况下，将相同粒径的砾石添加到与其他组相同的高度。CWs顶部覆盖10 cm（直径为1~2 cm）的砾石，用于固定植物（菖蒲）根系。在系统中心安装一根穿孔聚氯乙烯管（高50 cm，内径为5 cm），用于从基质中收集生物样品[附录A中的图S1（a）]。

实验前，所有CWs均接种来自深圳市南山水质净化厂的活性污泥。在接种（第I阶段）和启动（第II阶段）阶段，连续向CWs提供连续批次的合成污水，水力停留时间（HRT）为2 d，直到达到稳定运行。随后，进行正式实验，研究不同基质对CWs去除污染物的影响。详细的实验流程图和操作条件分别如图S1（b）和表1所示。

2.3 运行过程中样品的采集和分析

定期从CWs收集出水，均匀混合，并通过0.45 μm过滤器过滤。每个水样（50 mL）中的污染物浓度采用美国公共卫生协会（APHA）建立的标准方法测定[18]。

在第III和IV阶段结束时，收集每个系统中功能层的基质样品并对其进行超声提取，以从表面提取生物膜。使用微生物酶联免疫吸附测定试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）测定与氮去除和氧化磷酸化过程相关的功能酶的活性。

设计高50 cm、内径为24 cm的圆柱形聚氯乙烯罩，采用水封法收集CWs运行过程中释放的气体，并使用配有导热检测器和电子捕获检测器（ECD）的气相色谱仪（Thermo Fisher Scientific, USA）进行气体成分及浓度分析[19]。

2.4 支持反硝化的电子传递系统活性和碳代谢分析

通过测定微生物将碘硝基氯化四氮唑蓝（INT）还原为甲臜的效率来评估电子转移系统（ETS）的活性[20]。

为了研究BC和BC@β-CD对支持反硝化的碳代谢的影响，我们在前人研究[17]的基础上进行了一些修改，计算了反硝化的理论COD。具体计算方法如附录A中的文本S4所述。

2.5 宏基因组分析

在第III和IV阶段结束时，将过滤系统功能层中提取的生物膜样品，立即冷冻在液氮中，并低温运输到上海美吉生物医药科技有限公司进行宏基因组测序。

使用MEGAHIT（v1.1.2）和Prodigal（v2.6.3）分别组装简洁读取和预测开放阅读框（ORFs）。通过CD-HIT（v4.7）对预测的基因序列进行聚类，得到非冗余基因序列。随后，利用Diamond软件（v2.0.13）与非冗余（NR）蛋白序列数据库进行比对，获得各分类水平上的物种和丰度信息。通过检索京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库获得序列的功能注释和统计信息。

2.6 统计分析

所有实验均设置三次重复，结果以均值±标准差表示。采用SPSS Statistics（v23, IBM, USA）和Origin 2021软件（OriginLab, USA）进行显著差异分析和数据制图。采用结构方程模型分析关键因素对脱氮的贡献（AMOS 24, IBM）。

3 结果与讨论

3.1 BC和BC@β-CD的表征

基质填料为CWs中的微生物提供必要的生长空间，其理化性质将影响微生物的活性。如图1（a）和（b）所示，BC表面孔隙较多，边缘形貌光滑且整齐，而BC@β-CD表面聚合物颗粒较多。我们用能谱仪（EDS, ZEISS Sigma 300, Germany）分析了碳、氧、磷和铁在不同填料上的分布。BC@β-CD表面的氧含量明显高于BC表面的氧含量（附录A图S2和图S3），表明β-CD接枝过程在BC表面引入了更多的含氧官能团。

为了进一步分析BC和BC@β-CD的化学组成差异，采用傅里叶变换红外光谱（FTIR, Nicolet iS5, Thermo Fisher Scientific, USA）和X射线光电子能谱（XPS, Nexsa, Thermo Fisher Scientific, USA）分析了BC和BC@β-CD的官能团成分和特定化学键组成的变化。如图1（c）所示，BC和BC@β-CD表面的主要官能团出现在3430~3433 cm^-1、1590~1617 cm^-1和1086~1094 cm^-1附近，分别由-OH拉伸振动、-COO拉伸振动和C-O拉伸振动产生[21]。化学键组成的变化如图1（d）~（f）所示。在XPS光谱的C 1s能级，结合能为284.8 eV、285.6 eV、286.5 eV和288.7 eV的峰分别与C-C、C-OH、C-O-C和O=C-O有关[22‒23]。在接枝过程中，用环氧氯丙烷将β-CD连接到BC表面的羟基上，这解释了BC@β-CD表面的C-OH被C-O-C取代的原因[21]。XPS光谱的O 1s水平也证明了这一点，β-CD接枝显著增加了BC@β-CD表面C-O-C的相对含量。由植物生物质制备的生物炭可能富含磷，因此可能将磷释放到人工湿地中造成污染。EDS和XPS分析结果表明，接枝处理后，磷的相对质量比和原子比分别从1.23%和0.41%下降到1.09%和0.18%。这些结果表明，β-CD接枝工艺降低了BC@β-CD的磷含量，这可能有利于减少其作为基质填料时向环境中释放的磷。此外，水接触角反映了基质的亲疏水性，这与基质表面含氧官能团的数量和类型有关[24]。如图1（g）~（h）所示，β-CD接枝增加了材料表面的亲水性，说明BC@β-CD具有更好的生物相容性和传质性能[25]。

3.2 CWs污染物去除性能的增强

根据运行参数，将人工湿地运行分为四个阶段。第I阶段从第1天持续到第10天，在此期间，系统接种活性污泥。第II阶段从第10天持续到第40天，在此期间，系统在C/N比为4、HRT为2 d的条件下运行，以确保有足够的营养供应供微生物定植。接种和启动期（0~40 d）后，各系统出水稳定后进行正式实验。

如图2（a）所示，与对照相比，BC和BC@β-CD均显著提高了人工湿地中总氮的去除效率。当进水C/N比为4时，对照组总氮去除率（32.53%）低于BC组（54.16%）和BC@β-CD组（78.42%），如附录A图S4所示。随着C/N比由4降至2，BC@β-CD组的平均总氮去除率降至58.17%，说明进水C/N比较低限制了系统的脱氮能力。但BC@β-CD组的总氮去除率仍显著高于对照组（15.37%）和BC组（39.51%）。不同系统间硝酸盐氮去除率的变化与总氮的变化一致[图2（b）]。在第III和IV阶段，BC@β-CD组的硝酸盐氮去除率分别为79.54%和54.18%，显著高于对照组和BC组在同一阶段的硝酸盐氮去除率（附录A图S5）。此外，在所有CWs的出水中，亚硝酸盐氮和氨氮的含量都很低[图2（c）和（d）]。这些结果表明，反硝化作用，特别是硝酸盐还原过程，在CWs脱氮过程中起主导作用。值得注意的是，当C/N比从4降低到2时，对照组的硝酸盐氮去除率从27.38%显著下降到7.29%，说明CWs的反硝化功能在C/N比很低的情况下受到严重抑制。另一个值得注意的方面是，一氧化二氮作为重要的氮代谢中间体，具有很强的温室效应，需要重点关注与控制。如附录A图S6所示，在BC@β-CD组中，反硝化过程所产生的一氧化二氮得到了很好的控制。具体而言，在第III和IV阶段，BC@β-CD组的一氧化二氮排放量分别比对照组低70.57%和85.45%。上述结果表明，BC@β-CD不仅能提高人工湿地的脱氮能力，还能缓解低碳氮比造成的过量一氧化二氮排放。这些发现与我们之前的研究结果一致，即BC@β-CD在低C/N比条件下促进了反硝化作用，进一步证明了其作为基质填料适用于CWs [17]。此外，从附录A中的图S7可以看出，在实验过程中，BC@β-CD上的化学官能团没有发生变化，说明BC@β-CD作为基质填料在CWs中具有良好的稳定性。

异养反硝化是硝酸盐还原的主要途径，而碳含量直接影响反硝化速率[26]。虽然各系统在第III和IV阶段的COD去除率均超过90% [图2（e）和附录A图S8]，但随着进水C/N比的降低，各系统的脱氮性能均有所下降，再次说明有机底物含量会影响人工湿地反硝化效率。有趣的是，即使C/N比下降到2，处理组之间的底物消耗率相似，BC@β-CD组的反硝化效率仍然显著高于对照组和BC组。这表明BC@β-CD使微生物能够克服碳代谢和氮循环之间的一些潜在限制。

除氮外，过量的磷释放也会导致富营养化和藻华[27]。因此，我们也考察了各CWs对于总磷的去除效果。如图2（f）所示，对照组和BC@β-CD组对磷的去除率明显高于BC组。BC组出水总磷含量高于进水，说明BC向环境中缓慢释放磷。生物炭中磷的释放主要受原料含磷量和制备工艺的影响[28]。直接使用植物源生物炭作为化学废物的底物将有增加磷释放的潜在风险。相比之下，BC@β-CD作为填料，经过活化和接枝工艺后，可以有效地减少磷的浸出。

3.3 微生物群落与氮代谢途径分析

CWs中污染物的去除主要依赖于定植在基质填料上的微生物。因此，微生物群落的组成是CWs去除污染物的功能和效率的潜在决定因素之一。如附录A表S1所示，三种体系的Chao 1指数无显著差异，而低C/N比下BC@β-CD组的Shannon指数和Simpson指数分别较其他体系显著升高和降低。这些结果表明，BC@β-CD不会影响系统中物种丰富度，但有助于保护低碳氮比系统中微生物的多样性。

在图3（a）中，在门水平上，所有系统的优势微生物为放线菌门（Actinomycetota）、假单胞菌门（Pseudomonadota）、糖细菌门（Candidatus_Saccharibacteria）、绿弯菌门（Chloroflexota）和拟杆菌门（Bacteroidota），它们占总细菌群落的80.80%~93.23%。这些门是污水处理厂中参与碳和氮循环的优势细菌[29‒31]。具体来说，假单胞菌和拟杆菌是常见的反硝化细菌，放线菌在营养贫乏的环境中广泛存在[32‒33]。在本研究中，低营养水平的进水可能不利于其他微生物的生长，导致放线菌的相对丰度增加。绿弯菌门和拟杆菌门含有许多能降解有机物的异养物种[34]。图3（b）显示了CW系统中属水平的微生物组成。系统中主要的潜在反硝化细菌包括Nakamurella（放线菌门）[35]、unclassified_p_Candidatus_Saccharibacteria（糖细菌门）[36]、unclassified_o_Burkholderiales（假单胞菌门）和unclassified_c_Betaproteobacteria（假单胞菌门）[37]。据报道，Microlunatus（放线菌门）与聚积多磷酸盐的生物有关[38]。值得注意的是，BC@β-CD组unclassified_c_Actinomycetes（放线菌门）的丰度分别为9.62%（第III阶段）和4.90%（第IV阶段），显著高于对照组（1.43%和1.87%）和BC组（1.72%和3.34%）。由于unclassified_c_Actinomycetota在营养贫乏的条件下能够矿化有机底物，因此BC@β-CD组中unclassified_c_Actinomycetota丰度的增加可能促进了有机底物的利用。

影响CWs去除污染物效率的一个潜在因素是功能基因的丰度[39]。图3（c）显示了CWs中由KEGG数据库注释到的主要氮代谢途径，包括硝化和反硝化。在众多代谢途径中，与硝酸盐（EC:1.7.2.1）和亚硝酸盐（EC:1.7.5.1）还原代谢途径相关的基因丰度较高。在第III阶段和第IV阶段，BC@β-CD处理组硝酸盐还原基因（EC:1.7.2.1）的相对丰度分别是对照组的1.19倍和1.32倍。此外，与对照组相比，BC@β-CD处理组亚硝酸盐还原基因（EC:1.7.5.1）的相对丰度分别为1.14倍（第III阶段）和1.06倍（第IV阶段）。这些结果表明，BC@β-CD可能通过促进硝酸盐和亚硝酸盐的还原来提高CWs脱氮性能。考虑到BC@β-CD对CWs脱氮效率有显著的提升作用，而对CWs生物群落和功能基因丰度的影响有限，同时CWs的反硝化效率还取决于反硝化酶活性、底物代谢或电子转移效率等因素，因此，BC@β-CD对其他机制的调控作用可能会影响CWs的反硝化效率。

3.4 BC@β-CD对CWs中氮代谢功能酶活性的影响

功能酶活性可以反映微生物群落的功能表现。为了更好地了解BC@β-CD对氮循环中微生物活性的影响，我们测定了氮代谢相关功能酶的活性。脱氮过程由两种典型的生物反应组成[图4（a）]。一种是硝化过程，由氨单加氧酶（AMO）、羟胺氧化酶（HAO）和亚硝酸盐氧化还原酶（NXR）驱动，将氨氮转化为硝酸盐[40]。氨氧化是该过程的第一步，也是限速步骤，由AMO和HAO驱动，直接影响硝化效率[41]。如图4（b）和（c）所示，虽然BC@β-CD组的AMO和HAO活性略高于对照组，但出水氨氮浓度没有差异。这说明本研究中氨氮的去除对人工湿地的脱氮效率没有影响，这可能与进水氨氮含量较低有关。

另一个参与脱氮的生物反应是反硝化作用，该过程通过硝酸还原酶（NAR）、周质硝酸还原酶（NAP）、亚硝酸还原酶（NIR）、一氧化氮还原酶（NOR）和一氧化二氮还原酶（NOS），将硝酸盐还原为无害的氮气[42]。NAR和NAP催化反硝化过程的第一步，即将硝酸盐转化为亚硝酸盐[43]。如图4（d）所示，BC@β-CD处理组中NAR的活性在第III阶段为427.89 U∙mg^-1，在第IV阶段为462.02 U∙mg∙^-1，显著高于对照组（分别为274.62 U∙mg∙^-1和327.26 U∙mg^-1）和BC处理组（分别为372.45 U∙mg^-1和399.7 U∙mg^-1）。此外，在所有处理组中，各个阶段的NAP活性相同，且其活性水平远低于NAR（附录A图S9）。这些结果表明，BC@β-CD通过增强NAR活性促进了硝酸盐还原过程。下游反硝化功能酶NIR和NOR的活性在三组之间水平相当[图4（e）和（f）]。值得注意的是，尽管BC@β-CD处理组中亚硝酸盐还原功能基因（EC 1.7.5.1）的相对丰度略高于对照组和BC组，但各组间NIR活性并无显著差异，这表明亚硝酸盐还原过程并非人工湿地反硝化的限速步骤。此外，BC@β-CD组中NOS的活性在第III阶段为58.86 U∙mg^-1，在第IV阶段为57.99 U∙mg^-1，比同一阶段对照组的相应值分别高出43.64%和34.92% [图4（g）]。有趣的是，NOS活性与参与一氧化氮还原的基因（EC 1.7.2.4）相对丰度并不完全匹配。反硝化酶的活性不仅取决于功能基因的丰度，还与其他影响因素有关，如功能基因转录、底物代谢或电子消耗。因此，这些结果表明，BC@β-CD主要通过调节代谢过程来增强反硝化作用，而非仅仅依赖于反硝化功能基因的丰度。此外，进水碳氮比的降低对反硝化性能产生了显著抑制，但各组的反硝化酶活性并未下降。这进一步说明，电子的产生和转移是影响人工湿地脱氮效率的关键因素。因此，接下来，我们将重点研究BC@β-CD在这些方面的调控作用。

3.5 BC@β-CD对碳代谢产生电子供体的影响

反硝化过程依赖于碳代谢和氧化磷酸化产生的电子和能量[44]。微生物主要通过糖酵解（Embden-Meyerhof-Parnas, EMP）途径和三羧酸（TCA）循环代谢作为有机底物的葡萄糖，以产生电子供体（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NADH）和能量载体（三磷酸腺苷，ATP），如图5（a）所示。如图5（b）和（c）所示，通路富集分析结果表明，与对照组相比，BC处理组和BC@β-CD处理组中与EMP途径和TCA循环相关的基因丰度显著增加，这表明BC处理组和BC@β-CD处理组CWs脱氮性能的提升可能归因于更好的底物代谢。

为探究BC和BC@β-CD对CWs中碳代谢的增强机制，我们分析了EMP途径和TCA循环相关基因丰度的变化。图5（d）显示，与对照组相比，BC处理组和BC@-CD处理组中参与EMP途径的大多数基因丰度更高，这表明BC和BC@β-CD促进了人工湿地中葡萄糖的初级代谢。在第III阶段，与BC处理组相比，BC@β-CD 处理组中编码己糖激酶（EC:2.7.1.1）、葡萄糖激酶（EC:2.7.1.2）、多聚磷酸葡萄糖激酶（EC:2.7.1.63）、葡萄糖-6-磷酸异构酶（EC:5.3.1.9）、果糖-1,6-二磷酸酶Ⅱ（EC:3.1.3.11）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（EC:1.2.1.59）的基因丰度显著更高（表S2）。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（EC:1.2.1.59）在EMP途径中参与合成NADH。因此，BC@β-CD可通过增强EMP途径促进NADH的生物合成。值得注意的是，在第IV阶段，BC@β-CD组中与EMP途径相关的功能基因丰度更高。与对照组和BC处理组相比，在检测的23个基因中，分别有21个和18个基因的丰度有所增加（表S2）。这些结果表明，在低碳氮比条件下，BC@β-CD可通过增强EMP途径促进葡萄糖代谢。

更彻底的底物代谢过程会利用EMP的产物乙酰辅酶A，在TCA循环中继续产生NADH和ATP [45]。与在EMP途径中观察到的模式类似，在TCA循环中，与对照组相比，BC处理组和BC@β-CD处理组中的大多数功能基因丰度更高，这表明在BC和BC@β-CD处理组中葡萄糖的代谢更为彻底[图5（e）]。具体而言，在BC@β-CD组中，编码ATP柠檬酸裂解酶（EC:2.3.3.8）和琥珀酰辅酶A合成酶β亚基（EC:6.2.1.4 和 6.2.1.5）的基因丰度更高。然而，在BC处理组和BC@β-CD处理组中，TCA循环相关功能基因丰度增加和减少的数量大致相等，这表明BC和BC@β-CD对TCA循环的影响相似。因此，BC和BC@β-CD通过促进碳代谢，增加了用于反硝化过程的NADH和ATP的合成。不过，与BC相比，BC@β-CD必定还有其他优势，从而使其具有更好的反硝化性能。

3.6 高效碳利用对脱氮的贡献

第3.5节结果表明BC和BC@β-CD能够通过促进葡萄糖代谢，提高电子供体（NADH）和能量载体（ATP）的生成。然而，BC组和BC@β-CD组对葡萄糖代谢的促进作用相近，这使我们怀疑BC@β-CD处理组更好的反硝化效果可能归因于其更高的电子利用和能量效率。鉴于反硝化所需的电子是在氧化磷酸化过程中由NADH脱氢酶对电子供体（NADH）进行氧化而产生的，我们进一步研究了CWs中NADH脱氢酶相关功能基因的丰度以及NADH脱氢酶的实际活性。如图6（a）和表S4所示，在第III阶段和第IV阶段，BC组和BC@β-CD组中所有与NADH脱氢酶相关的功能基因的丰度均高于对照组。值得注意的是，与BC组相比，BC@β-CD组中与NADH脱氢酶相关且丰度增加的基因数量显著更多，如表S4所示。这些发现与人工湿地中NADH脱氢酶的活性变化一致。如图6（b）所示，在同一时期，BC@β-CD组的NADH脱氢酶活性高于对照组和BC组。具体而言，与对照组相比，第III阶段提高了39.87%，第IV阶段提高了61.60%；与BC组相比，第III阶段提高了13.76%，第IV阶段提高了28.62%。这些结果表明，BC@β-CD通过增强NADH脱氢酶的活性，促进了用于反硝化的电子的产生。氧化磷酸化过程的另一个重要功能是ATP合成，这一过程由F型ATP合酶催化。据报道，细胞内超过90%的ATP是由ATP合酶合成的[46]。图6（c）和表S5显示，在第IV阶段，BC组和BC@β-CD组中几乎所有与ATP合酶相关的基因的表达都高于对照组。同时，在检测到的13个与ATP合酶相关的功能基因中，BC@β-CD组中有10个基因的丰度高于BC组，只有3个基因的丰度较低。相应地，在第IV阶段，BC@β-CD组的ATP酶活性比对照组高17.77%，比BC组高15.84% [图6（d）]。因此，BC@β-CD在低碳氮比条件下提高了ATP酶的活性，为微生物的生长和代谢提供了能量。

反硝化过程与电子传递系统活性（ETSA）直接相关，因为反硝化所需的电子是通过NADH氧化产生的，并随后通过电子传递系统转移到反硝化功能酶上[20]。如图6（e）所示，BC@β-CD组的ETSA水平最高。与对照组和BC组相比，在第III阶段，BC@β-CD组的ETSA分别高出25.35%和12.89%；在第IV阶段，分别高出22.06%和14.27%。这些结果表明，BC@β-CD不仅促进碳代谢以产生电子供体（NADH），还促进NADH的氧化以产生电子，并将足够的电子传递给反硝化功能酶，最终增强反硝化作用。

考虑到微生物体内存在其他各种需要消耗能量和电子的生化过程，BC@β-CD可能通过提高电子产生和转移的效率，增强反硝化过程对电子的竞争力。为了验证这一假设，我们计算了反硝化过程理论消耗COD与实际消耗COD的比值，以评估碳代谢支持反硝化过程的效率。如图6（f）所示，BC@β-CD组中碳代谢支持反硝化过程的比值在第III阶段为64.13%，第IV阶段为55.57%，显著高于对照组（第III阶段为21.13%，第IV阶段为4.94%）和BC组（第III阶段为39.57%，第IV阶段为33.30%）。

上述结果表明，BC@β-CD通过多种途径增强了人工湿地中的反硝化作用，包括优化碳源利用、提高电子产生和转移能力，以及增强反硝化酶活性。我们使用结构方程模型进一步了解这些增强途径之间的相互关系。在第III阶段，碳代谢支持反硝化的比例对反硝化速率的影响最为显著[图6（g）]。以NAR和NOS为代表的反硝化功能酶受到NADH脱氢酶和ETSA的支持。这增强了它们的活性，并提高了碳代谢支持反硝化的比例。值得注意的是，随着第IV阶段碳氮比的降低，这些增强途径之间的原始相互关系发生了显著变化[图6（h）]。微生物更多地依赖增强NADH脱氢酶的活性，以促进底物代谢转化为支持反硝化反应的电子。总体而言，尽管调控途径的重点有所不同，但BC@β-CD系统有利于碳代谢的重新分配，以更有力地支持反硝化作用，从而提高了在低碳氮比条件下人工湿地的脱氮效果。

3.7 环境意义

本研究采用CWs对低C/N比的市政二级出水进行深度处理。然而，受低C/N比的限制，传统砾石基质人工湿地的反硝化性能并不理想，大量硝酸盐难以去除。这一弊端致使大量硝酸盐随出水流入水生环境，引发水体富营养化问题。特别是当进水碳氮比出现波动时，情况会变得更为严峻。不仅如此，人工湿地在脱氮过程中会排放臭名昭著的温室气体——一氧化二氮。在进水碳氮比从4降至2的过程中，该气体排放量增加了两倍有余，这极有可能进一步加剧全球变暖的态势。

BC@β-CD作为基质填料显著提高了传统人工湿地对低碳氮比废水的反硝化效率，并大幅减少了一氧化二氮的排放。然而，即便使用了BC@β-CD作为基质填料，CWs中的硝酸盐仍无法完全去除。此外，当进水碳氮比为2时，出水的氮浓度高于1.5 mg·L^-1 [《地表水环境质量标准》（GB3838‒2002）IV类标准]。为了利用人工湿地对低碳氮比污水进行深度脱氮，我们从有机底物来源和构建多级人工湿地减少对有机底物依赖这两个角度提出两条建议：①有机底物来源：利用植物产生的根系分泌物作为补充性内部碳源；②减少对有机底物的依赖：在多级人工湿地系统中利用自养微生物的反硝化能力去除水中残留的微量硝酸盐。

4 结论

低C/N比始终是CWs反硝化性能提升的一大桎梏，严重制约着其改善WWTPs出水水质的效能。因此，突破进水有机底物匮乏导致的反硝化效率低下这一瓶颈，显得尤为迫切且关键。本研究开创性地将BC@β-CD作为基质填料构建人工湿地。结果表明，它能够巧妙地对碳代谢流进行再分配，为反硝化作用提供更为充足的支持，进而显著提升反硝化效率，同时大幅降低一氧化二氮的排放。研究结果显示，BC@β-CD并未改变系统中原有的微生物群落组成，而是有效增强了系统内单个功能微生物的碳氮代谢活性。结合宏基因组学与酶学分析发现，相较于BC，BC@β-CD展现出更为卓越的性能。它不仅能够全面强化碳代谢过程，还能凭借提升氧化磷酸化及电子转移效率，精准且策略性地将更多的碳代谢流导向反硝化作用。这一精妙的调控机制，使得在碳源极度匮乏的不利条件下，反硝化作用依然能够获得最大限度的支持，从而有力地保障了低碳氮比环境下的脱氮效果。此外，结构方程模型分析进一步明确指出，在低碳氮比的严苛条件下，提高脱氮效率的核心策略在于增加碳代谢支持反硝化作用的分配比例。可以肯定的是，从合理分配碳代谢以及高效利用资源的全新视角来看，功能性材料将助力反硝化过程成功突破底物限制，显著降低对额外碳源的依赖程度，为实现低碳污水处理目标提供了极具创新性和前瞻性的解决方案。

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