移植年轻小鼠粪菌实现老年小鼠皮肤年轻化

于守娟 ,  李子阳 ,  张晓旭 ,  张琪 ,  张力圩 ,  赵亮 ,  刘平 ,  郭杰 ,  陈娟 ,  张承英 ,  刘心娟 ,  于梦洋 ,  金德奎 ,  王晓枫 ,  李广 ,  曹琰 ,  任发政 ,  王然

工程（英文） ›› 2024, Vol. 42 ›› Issue (11) : 29 -42.

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工程（英文） ›› 2024, Vol. 42 ›› Issue (11) : 29 -42. DOI: 10.1016/j.eng.2024.08.005
Research

移植年轻小鼠粪菌实现老年小鼠皮肤年轻化

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Skin Rejuvenation in Aged Mice by Fecal Transplantation Microbiota from Young Mice Feces

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摘要

皮肤衰老是健康老龄化背景下日益突出的问题。在衰老过程中，皮肤的屏障功能减弱，表现在含水量减少，皱纹逐渐形成，肠道微生物群组成发生变化。然而，肠道微生物群与皮肤衰老之间的关系尚不清楚。本研究通过粪菌移植（FMT）的方法探索年轻小鼠粪便对老年小鼠皮肤年轻化的影响。结果表明，接受年轻小鼠粪便的老年小鼠皮肤的保水性增强，角质层增厚，胶原蛋白含量增加，上皮细胞分化得到改善。值得注意的是，粪菌移植后老年小鼠肠道菌群中乳杆菌和乳球菌的丰度显著提高，它们在没有接受年轻鼠粪便的老年小鼠中几乎检测不到。非靶向和靶向代谢组学分析表明，粪菌移植显著提高了老年小鼠粪便和血清中色氨酸（Trp）及其微生物群代谢产物[如吲哚-3-乳酸（ILA）]的丰度。Trp和ILA通过激活芳烃受体（AhR）促进皮肤表皮细胞分化进而逆转老年小鼠的皮肤衰老。总之，年轻小鼠的FMT能够通过代谢Trp的细菌（乳杆菌、乳球菌）及其衍生代谢物逆转老年小鼠的皮肤衰老，这表明针对Trp及其代谢物的干预措施可以有效改善皮肤衰老。

Abstract

Skin aging is an increasingly prominent topic in the context of healthy aging. During the aging process, the skin’s barrier function diminishes, its water content decreases, wrinkles begin to form, and changes occur in the gut microbiota composition. However, the relationship between gut microbiota and skin aging remains unclear. In this study, we explored skin rejuvenation in aged mice through fecal microbiota transplantation (FMT) using feces from young mice. The results demonstrated enhanced water retention, thickened stratum corneum, increased collagen content, and improved epithelial cell differentiation in aged mice following FMT. Notably, FMT particularly increased the abundance of Lactobacillus and Lactococcus in aged mice, which were nearly undetectable in untreated aged mice. Non-targeted and targeted metabolomics analyses indicated that FMT significantly elevated levels of tryptophan (Trp) and its microbiota metabolites (e.g., indole-3-lactic acid (ILA)) in the feces and serum of aged mice. Both Trp and ILA appeared to rejuvenate aged skin by activating the aryl hydrocarbon receptor (AhR) to promote epidermal cell differentiation. In conclusion, FMT from young mice rejuvenated aged skin via Trp-metabolizing bacteria (Lactobacillus and Lactococcus) and Trp-derived metabolites, suggesting that interventions targeting Trp metabolites may effectively improve skin aging.

关键词

皮肤衰老 / 粪菌移植 / 色氨酸 / 吲哚-3-乳酸 / 芳烃受体 / 表皮分化

Key words

Skin aging / FMT / Tryptophan / Indole-3-lactic acid / AhR / Epidermal differentiation

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于守娟,李子阳,张晓旭,张琪,张力圩,赵亮,刘平,郭杰,陈娟,张承英,刘心娟,于梦洋,金德奎,王晓枫,李广,曹琰,任发政,王然. 移植年轻小鼠粪菌实现老年小鼠皮肤年轻化[J]. 工程（英文）, 2024, 42(11): 29-42 DOI:10.1016/j.eng.2024.08.005

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1 引言

皮肤作为人体表面积最大的组织能够直接与外界环境接触，在保护和调节体内平衡方面起着至关重要的作用[1‒3]。皮肤过早衰老会引起美观性降低和皮肤功能受损，如含水量减少、经表皮水分散失增加和胶原蛋白含量降低，最终导致皮肤厚度降低和屏障功能损伤[4]。皮肤在衰老过程中会发生明显的变化，包括产生皱纹和色素沉积。皮肤衰老的主要原因是细胞衰老，细胞特性和组成随年龄发生改变，这对表皮干细胞的结构和生态位产生不利影响[5‒7]。此外，皮肤细胞增殖和分化减少会导致皮肤细胞再生能力逐渐下降，最终引发皮肤衰老[8‒11]。

在医学美容和抗衰老领域，皮肤衰老已经引起了非常多的研究关注，促使人们努力寻找逆转皮肤衰老的方法。目前，皮肤衰老可以通过外部干预和口服补充剂来延缓[12]。一些表面涂抹的抗衰老护肤品，如透明质酸和胶原蛋白等，可能暂时改善保水性，但是很难长期保持皮肤功能[13]。口服补充剂为我们提供了一种内源性延缓皮肤衰老的系统性方法。文献[14‒15]中报道的可以改善皮肤衰老的物质包括维生素C、维生素E和益生菌等。维生素C和维生素E通过清除体内的自由基来延缓皮肤衰老。口服益生菌补充剂（如干酪乳杆菌）可以通过加速皮肤屏障修复来改善皮肤炎症和痤疮[16‒18]；长双歧杆菌及其色氨酸代谢物吲哚-3-乙醛可以通过激活芳烃受体（AhR），促进表皮分化，改善特应性皮炎炎症[19]。

由于肠道菌群组成非常复杂并且有许多细菌无法培养，通过口服单一的益生菌类产品难以实现菌群效益最大化。因此，粪菌移植（FMT）已被广泛用于治疗各种肠道菌群生态失调相关疾病[20‒21]。FMT涉及肠道菌群整体结构的改变，其中供体菌群在受体肠道内建立了稳定的联系，能够将多种益生菌引入受体肠道中，是快速调节肠道微生物群的最直接方法之一。据报道，FMT可用于治疗皮肤病、胃肠道疾病、代谢综合征和癌症[22]。例如，已有研究证明FMT可以抑制皮肤癌患者对抗程序性细胞死亡蛋白1治疗的耐药性[23]。此外，FMT通过恢复肠道微生物群和免疫平衡来抑制特应性皮炎引起的过敏反应[24]。然而，FMT对衰老皮肤的影响还有待进一步研究。

很多研究已经报道了肠道生态失调主要通过炎症和损伤皮肤屏障来促进器官衰老（如皮肤）[24‒25]。FMT共存研究通常用于解决肠道生态失调[26‒28]。因此，通过调节宿主微生物群来延缓皮肤衰老似乎成为一种可能。在本文中，我们将年轻小鼠的粪便移植到老年小鼠肠道中，改变了老年小鼠的肠道微生物群，并发现了改善皮肤衰老的有益细菌和相关代谢物。

2 实验方法

2.1 FMT动物实验

年轻（2月龄，n = 6，以下称为Young组）和老年（24月龄，n = 12，分为Old组和Old-Y组）雄性C57BL/6 J小鼠，购买于菲诺泰克生物科技有限公司。小鼠被安置在中国农业大学的实验动物设施中，适应环境一周，喂食基础饲料。环境条件保持在22~25 ℃、60%的相对湿度和12 h/12 h的光/暗循环。动物实验获得中国农业大学动物实验伦理委员会批准（批准号：AW82303202-5-1）。

2.2 FMT的样本接种准备

在严格厌氧条件下收集年轻鼠粪便作为FMT供体样本。取120 mg样品于1 mL预冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中匀浆，在4 ℃、800g条件下离心10 min，收集上清液于-80 ℃保存[29]。

2.3 粪菌移植方法

将小鼠随机分为3组，每组6只：①Young组小鼠灌胃PBS；②Old组小鼠灌胃PBS；③Old-Y组小鼠灌胃粪便上清样品。粪菌移植前，Old-Y组小鼠灌胃广谱抗生素混合物，包括氨苄西林（1 g∙L-1）、万古霉素（0.5 g∙L-1）、新霉素（1 g∙L-1）和甲硝唑（1 g∙L-1），持续两周。实验期间Old-Y组小鼠每天灌胃年轻小鼠粪便菌液200 μL，持续1个月[29]。

2.4 苏木精-伊红（HE）染色

粪菌移植实验结束后收集皮肤样本浸泡于中性固定液中，随后用梯度乙醇脱水处理，并对组织进行石蜡包埋、切片。HE染色步骤按照试剂盒说明书（G1120，索莱宝）进行。使用ImageJ（version 4.0.2，Scion公司，美国）测量表皮厚度。角质层到基底层的距离为表皮厚度。

2.5 马松染色

马松染色切片厚度为5 μm，根据试剂盒说明书（G1340，索莱宝）进行染色。使用ImageJ测量胶原体积比。

2.6 免疫荧光（IF）染色

取小鼠背侧皮肤标本，用中性固定液固定24 h，取5 μm厚切片进行IF染色。用细胞角蛋白10抗体（ab76318, Abcam，英国，1∶200）、桥粒芯蛋白I抗体（ab124798, Abcam, 1∶100）和兜甲蛋白抗体（ab85679, Abcam, 1∶100）孵育，随后用荧光二抗孵育。使用徕卡DM1000显微镜和徕卡Microsystems软件（徕卡，德国）成像。

2.7 皮肤性能检测

皮肤性能检测在Kim等[30]的研究基础上进行了适当修改。测量前一天将小鼠背部毛发剃净。将VapoMeter（Delfin，意大利）测量探头放置在裸露的背部皮肤表面，在读数稳定后记录经皮水分散失（TEWL）值。

2.8 免疫印迹检测

使用放射免疫沉淀溶液从皮肤样品中提取蛋白质。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离靶蛋白，随后转移到聚偏二氟乙烯膜上，用以下一抗孵育：I型胶原蛋白（CST，美国，72026, 1∶1000）、III型胶原蛋白（Santa Cruz Biotechnolog，美国，sc-271249, 1∶1000）、β‍-肌动蛋白多克隆抗体（Proteintech，美国，20536-1-AP, 1∶1000）、ZO1（Proteintech, 21773-1-AP, 1∶1000）、Occludin（Servicebio，GB111401, 1∶1000）、Claudin-1（Proteintech, 28674-1-AP, 1∶1000）、AhR（Proteintech, 287271-AP, 1∶1000）和CYP1A1（Proteintech, 13241-1-AP, 1∶1000）。然后将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育60 min。使用化学发光试剂检测蛋白质信号。

2.9 16S核糖体RNA（rRNA）测序

在灌胃给药前和给药四周后于上午9点至10点收集小鼠粪便样本，并立即在-80 °C冰箱中冻存。使用DNA提取试剂盒提取粪便DNA。采用341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′）序列引物扩增细菌16S rRNA的V3-V4区。使用美吉生物云平台进行数据处理和分析。为了获得高质量的干净片段，使用FASTP（版本0.18.0）软件按照以下规则对原始片段进行进一步过滤：去除含有未知核苷酸大于10%和小于50%的质量评分大于20的碱基片段。过滤后获得的干净片段用于组装分析。使用FLASH（版本1.2.11）将末端干净的片段按最小重叠为10 bp，错配率最高2%的阈值合并为标签。使用UPARSE（版本7.1）对相似度为97%的操作分类单元（OTUs）进行聚类，并对嵌合序列进行识别和去除。最低的OTU分类注释定义为具有大于或等于70的相似分数。采用Kruskal-Wallis检验评价α-多样性的显著性。p值小于0.05认为存在统计学差异。

2.10 使用气相色谱-飞行时间质谱（GC-TOF-MS）进行非靶向粪便代谢组学研究

粪便样本（50 mg）以及内标（0.5 mg∙mL-1的糖醇）中加入预冷提取液（甲醇乙腈水体积比= 2∶2∶1），涡旋30 s后用35 Hz研磨仪处理4 min。将样本在4 ℃、12 000g的条件下离心15 min，得到200 μL上清液。质量控制（QC）样品由所有样品的均匀混合物组成。在真空干燥机中干燥后，用盐酸甲氧胺（20 mg∙mL-1吡啶溶液）和BSTFA试剂（1% TMCS）对上清进行衍生化。在QC样品中加入5 μL FAME等分试样的氯仿溶液。

使用安捷伦7890气相色谱-飞行时间质谱联用仪进行分析[31]，在DB-5MS毛细管柱上以不分流模式进样1 μL。载气为氦气（入口流速为3 mL∙min-1，通过柱流速为1 mL∙min-1）。初始温度为50 ℃，逐渐升高到310 ℃。注入线和转移温度为280 ℃，离子源温度为250 ℃。在电子碰撞模式下，能量为-70 eV。选择全扫描模式，在50~500质量电荷比（m/z）范围内获得质谱数据，在12.5个光谱波段∙s-1的溶剂延迟为6.4 min。

使用ChromaTOF软件（V 4.3x, LECO）对质谱数据进行了峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析。对物质定性工作中，使用了LECO-Fiehn Rtx5数据库，包括质谱匹配及保留时间指数匹配。

2.11 使用高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）进行非靶向粪便代谢组学分析

粪便样本加入预冷提取液（甲醇乙腈水体积比=2∶2∶1）为了沉淀蛋白质，将样品混合并在-20 °C下孵育1 h。在4 °C、12 000g条件下离心15 min，获得上清。质量控制样品由等分混合上清液组成。

样品采用超高效液相色谱（UHPLC）系统（Vanquish, Thermo Fisher Scientific，美国），Phenomenex Kinetex C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm, 2.6 μm）与Orbitrap Exploris 120质谱联用（Orbitrap MS, Thermo Fisher Scientific）。流动相A和B分别为0.01%乙酸水溶液和异丙醇∶乙腈（1∶1, V/V）。自动进样器温度为4 ℃。MS数据采用信息依赖型采集方式获取。电喷雾电离气体流速为50个大气压，毛细管温度为320 ℃，MS分辨率为60 000，MS/MS分辨率为15 000，碰撞能量为阶梯归一化碰撞能量20/30/40，喷射电压为3.8 kV（正模式）或-3.4 kV（负模式）[32]。

使用R语言对数据进行处理，并将数据转换为mzXML格式，用于峰检测、提取、对齐和集成。使用MS2数据库（BiotreeDB）进行代谢物注释，注释截止值设置为0.3。

2.12 使用HPLC-MS的非靶向血清代谢组学

用含内标的甲醇提取血清样品（V∶V = 4∶1）。将混合物在4 ℃、 12 000g下离心10 min，随后将上清置入真空冷冻干燥机（Labconco，美国）。使用UPLC（LC-40D X3，岛津，日本）和四极TOF-MS系统（TripleTOF 7600, AB SCIEX，美国）进行非靶向分析。

正离子模式下检测采用桥接乙基杂化（BEH）C8（2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm）UPLC色谱柱（Milford，美国）和C8保护柱（2.1 mm × 10 mm, 1.7 μm）。流动相A、B分别为0.1%甲酸水溶液和0.1%乙腈/甲酸。负离子模式下采用高强度二氧化硅（HSS）T3（2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm）UPLC柱（Milford）和T3保护柱（2.1 mm × 10 mm, 1.8 μm）。流动相A、B分别为6.5 mmol∙L-1 NH4HCO3水溶液和6.5 mmol∙L-1 NH4HCO3甲醇/水（95∶5, V/V）溶液[33]。

2.13 利用高效液相色谱-质谱进行靶向代谢组学研究

用甲醇/水（4∶1, V/V）提取粪便、皮肤组织和血清样品中的代谢物。将悬浮液在4 ℃、12 000g离心10 min，吸取上清放入真空干燥机干燥。

采用UHPLC系统（LC-40D X3, Shimadzu）耦合四极TOF-MS（TripleTOF 7600, AB SCIEX）检测色氨酸和吲哚-3-乳酸（ILA）。采用BEH C18（2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm）UPLC柱和C18保护柱（2.1 mm × 10 mm, 1.7 µm）进行检测。流动相A、B分别为20 mmol∙L-1乙酸铵溶液和20 mmol∙L-1乙酸铵乙腈/水（85∶15, V/V）溶液。

采用多反应监测模式获取数据。TOF-MS扫描质量范围为60~1000 Da，累积时间为100 ms。对于Trp和ILA，产物离子扫描参数如下：前体离子分别为205.0972和206.0812；碎片离子分别为146.0606和117.9000；去簇电压为45 V，碰撞能为25 V或40 V；并启用Zeno脉冲。所有数据采集和分析均使用SCIEX OS（AB SCIEX）进行。

2.14 Trp和ILA干预研究

为了研究Trp（麦克林，153-94-6）和ILA（阿拉丁，1821-52-9）对衰老引起的皮肤屏障功能损伤的影响，将12月龄C57BL/6J雄性小鼠分为6组，每组6只：对照组、鼠乳杆菌（Lac, BNCC, ATCC 35020）组、Trp组、ILA组、Trp与抗生素（Trp + A）组、ILA与抗生素（ILA + A）组。本研究获得Pony检测国际集团有限公司动物实验伦理委员会批准（伦理批准代码：PONY-2023-fl-18）。

2.15 AhR拮抗剂（CH223191）研究

选取12月龄的C57BL/6J，随机分为5组，每组6只：①对照组，②Trp组，③ILA组，④Trp和CH223191（Trp + C）组，⑤ILA和CH223191（ILA + C）组。在Trp或ILA处理前30 min，将10 μmol∙L-1的CH223191（301326-22-7，Sigma，美国）溶液均匀涂抹于小鼠背部皮肤[34]。

2.16 统计分析

使用GraphPad Prism（Version 8, GraphPad Prism Institute，美国）和SPSS 20软件（SPSS Inc.，美国）对数据进行分析。采用单因素方差分析（ANOVA）检验平均值之间的差异，事后分析采用Tukey检验。p < 0.05为有显著的统计学差异。

3 结果

3.1 粪菌移植后皮肤表型的变化

为了研究来自年轻小鼠的肠道微生物群是否能改善老年小鼠的皮肤衰老，我们评估了粪菌移植后的皮肤表型变化[图1（a）]。皮肤检测结果显示，与Old组相比Old-Y组小鼠的水分含量显著增加[Old-Y组小鼠为30.8% ± 2.79%，Old组小鼠为24.3% ± 1.51%；图1（b）]、TEWL值显著降低[Old-Y组小鼠为(6.120 ± 0.580) g∙m-2∙h-1，Old组小鼠为(12.400 ± 0.840) g∙m-2∙h-1；图1（c）]、表皮厚度和胶原体积比显著提高[Old-Y组小鼠分别为(11.8±1.03) μm和55.1% ± 2.34%，Old小鼠分别为(8.88±1.12) μm和45.5% ± 4.96%，图1（d）~（f）]。

免疫荧光（IF）检测分化标志物的结果显示，Old-Y组小鼠皮肤中细胞角蛋白10的表达显著增加。Old组小鼠桥粒芯蛋白I的表达下调表明皮肤上皮紧密连接的完整性受到损害[图1（g）~（h）]。免疫印迹结果表明，与Old组小鼠相比，Old-Y组小鼠皮肤中I型胶原和III型胶原含量显著增加[图1（i）~（j）]，这与胶原体积比数据一致[图1（f）]。此外，FMT后Old-Y小鼠的紧密连接蛋白[zonula occluden-1（ZO1）、occludin和claudin-1]相比于Old组小鼠表达显著增加[图1（k）~（m）]。因此，FMT逆转了老年小鼠的皮肤衰老，主要表现为水分含量增加、经皮水分散失减少、胶原蛋白含量增加、表皮厚度增加和细胞分化增强。

3.2 粪菌移植后小鼠肠道菌群的变化

本研究采用抗生素处理的粪菌移植小鼠模型验证微生物群对老年小鼠皮肤的影响。实验将年轻小鼠的粪便移植到老年（Old-Y组）无菌小鼠体内后，比较粪菌移植前后菌群的α多样性和β多样性指数以及微生物群组成的改变。FMT后肠道菌群的α多样性发生变化，相较于Old组小鼠，Old-Y组小鼠粪便菌群多样性指数（Shannon和Chao）显著下降，并向供体小鼠靠拢[p < 0.05；图2（a）~（b）]。主成分分析（PCA）结果表示肠道微生物群中β多样性情况，粪菌移植后Old-Y组小鼠肠道菌群向Young组小鼠聚拢，表明Old-Y小鼠的β多样性与Young小鼠相似[图2（c）]。

粪菌移植四周后，Old-Y小鼠肠道细菌菌群结构发生了改变，厚壁菌门和拟杆菌门的比例更高，这与年轻小鼠的微生物群相似[图2（d）]。我们关注了FMT前后肠道中的特征性细菌的变化。Old组小鼠肠道菌群中变化最显著的属是乳杆菌属、库特特氏杆菌属、气球菌属和乳球菌属，其中乳杆菌和乳球菌在年轻小鼠粪便中丰度较高，而在老年小鼠粪便中丰度较低[图2（e）~（f）]。粪菌移植后Old-Y小鼠的乳杆菌和乳球菌丰度显著上调[图2（g）~（h）]。此外，Young和Old-Y组小鼠的Candidatus stoquefichus和气球菌丰度较高。

3.3 粪菌移植后粪便代谢物的变化

肠道菌群通常通过其代谢物影响宿主健康。因此，我们使用液相色谱质谱联用（LC-MS）和气相色谱质谱联用（GC-MS）对小鼠粪便进行了检测，并鉴定出2506种代谢物。PCA分析结果表明三组间存在差异[图3（a）]，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）变异度分别为23.2%和19.5% [相似性分析（ANOSIM），p = 0.002，R 2 = 0.412]。偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）表明三个组的聚类具有显著的分离性。PLS-DA模型的置换检验结果为R 2X（cum）= 0.848， R 2Y（cum）= 0.991，Q 2Y（cum）= 0.841，表明模型具有良好的可靠性和可预测性[图3（b）~（c）]。

差异火山图中展示了所有代谢物的p值和差异大小，红点和蓝点分别代表显著上调和下调的代谢物。我们发现，与Old组相比，Old-Y小鼠粪便中有194种代谢物显著上调、272种显著下调[图3（d）~（f）]，Young组小鼠中有53种代谢物显著上调、93种代谢物显著下调。与Young小鼠相比，Old-Y小鼠分别有267种代谢物显著上调、223种显著下调。为了确定Old-Y小鼠中变化最大的代谢物，我们根据p值筛选了40种代谢物。相较于Old组小鼠，Old-Y小鼠的ILA（p = 4.65 × 10-6）和L-Trp（p = 1.43 × 10-6）显著上调[图3（g）]。此外，京都基因组百科全书（KEGG）分析结果显示，Old-Y小鼠中Trp代谢途径相较于Old小鼠显著富集[图3（h）~（i）]。

3.4 粪菌移植后血清代谢物的变化

为了进一步探索粪菌移植后老年小鼠皮肤衰老逆转的原因，我们采用非靶向LC-MS的方法分析了血清代谢物。血清中共检出2459种代谢物。PCA和PLS-DA结果显示，三个组的血清代谢物都明显分离[图4（a）~（b）]。Old-Y和Old小鼠PLS-DA模型的置换检验结果表明模型具有较高的可靠性和可预测性[图4（c）]。两组代谢物差异火山图结果[图4（d）~（f）]显示，与Old小鼠相比，Old-Y小鼠血清中有201种代谢物显著上调，423种代谢物显著下调；而Young小鼠血清中有122种代谢物显著上调，201种代谢物分别显著下调。与Young组相比，Old-Y组有353种代谢物显著上调，112种代谢物显著下调。为了确定粪菌移植后显著改变的代谢物，我们筛选了Old-Y小鼠粪便和血清中共同显著增加的代谢物，发现只有Trp和ILA同时升高[图4（g）~（j）]。随后，我们对粪便中显著增加的细菌丰度以及粪便和血清中的差异代谢物进行了Spearman相关分析。结果表明，粪便[图4（k）~（l）]和血清[图4（m）~（n）]中的Trp、ILA和乳杆菌之间存在显著的正相关。

3.5 粪便、血清和皮肤组织中Trp和ILA的靶向检测

此前，我们使用非靶向代谢组学，筛选粪菌移植后显著增加的代谢物（Trp和ILA），并使用靶向代谢组学对粪便、血清和皮肤组织中的这些代谢物进行量化。样品处理和LC-MS定量分析过程在附录A中图S1（a）中进行了概述。Trp的标准曲线（y = 329 386x + 7128, R 2 = 1）和ILA的标准曲线（y = 82 140x + 454, R 2 = 1）在图S1（b）~（c）中进行了展示。Old-Y组小鼠的粪便、血清和皮肤组织中的Trp浓度显著高于Old组小鼠[p < 0.05，图S1（d）~（f）]。而且除皮肤组织外，Young组小鼠与Old组小鼠的粪便和血清代谢物水平无显著差异。Old-Y组小鼠粪便、血清和皮肤组织中的ILA浓度明显高于Old组小鼠[p < 0.05，图S1（g）~（i）]，这与之前的趋势一致[图4（g）~（j）]。

3.6 Trp和ILA处理对衰老小鼠皮肤表型的影响

通过非靶向和靶向代谢组学检测，我们发现粪菌移植后小鼠的Trp和ILA代谢物含量显著增加。因此，我们猜测这些代谢物可能与皮肤年轻化有关，并且通过动物实验进一步验证了它们的作用[图5（a）]。首先，我们评估了皮肤中的含水量[图5（b）]和TEWL值[图5（c）]。Lac、Trp、ILA和ILA + A组的水分含量显著高于对照组（p < 0.01），Trp + A与对照组之间无显著差异；Lac、Trp、ILA和ILA +A组TEWL值显著低于对照组（p < 0.01），而Trp + A与对照组之间无显著差异。与对照组相比，Lac、Trp、ILA和ILA+A组表皮厚度和胶原体积比增加[图5（d）~（e）]。

免疫荧光染色显示，相比于对照组，补充乳杆菌、Trp和ILA显著提高了表皮细胞角蛋白10、兜甲蛋白和桥粒芯蛋白-1蛋白的表达水平[p < 0.01，图5（f）~（h）]。Lac、Trp、ILA和ILA + A组的效果优于Trp + A。与对照组相比，Lac、Trp、ILA和ILA + A组皮肤中AhR和CYP1A1的表达显著增加，而Trp + A组皮肤中AhR和CYP1A1的表达无显著变化[图5（i）]。与之前的结果相同[图5（e）]，与对照组相比，免疫印迹显示Lac、Trp、ILA和ILA + A组皮肤中I型胶原和III型胶原相比于对照组显著增加[图5（j）]。此外，Lac、Trp、ILA和ILA + A组皮肤中紧密连接蛋白（ZO1、occludin和claudin-1）的表达量相较于对照组也显著增加[图5（k）]。由此可见，乳杆菌、Trp和ILA的补充缓解了老龄小鼠的皮肤衰老，主要表现在水分含量增加、经皮水分散失减少、胶原蛋白含量增加、表皮厚度增加、表皮细胞分化增强。

3.7 Trp和ILA在小鼠皮肤衰老机制中的作用

上述研究结果表明，Trp和ILA能够上调AhR的表达[图5（i）]。因此，我们推测这些代谢物可能通过AhR发挥其抗衰老作用。为了验证这一假设，我们在灌胃Trp和ILA的同时用CH223191（一种AhR拮抗剂）处理小鼠[图6（a）]。我们首先检测了皮肤中的含水量和TEWL值，发现单独使用Trp和ILA可显著增加含水量并降低TEWL值。然而，当与CH223191联合使用时，这些结果与对照组相比没有显著差异[图6（b）~（c）]。同样，Trp、ILA与CH223191联合使用后，表皮厚度和胶原体积比相较于对照组也没有显著差异[图6（d）~（f）]。此外，Trp + C和ILA + C组AhR和CYP1A1的表达、I型胶原和III型胶原的含量以及紧密连接蛋白（ZO-1、occludin和claudin-1）的表达与对照组相比均无显著差异。因此，Trp和ILA与AhR拮抗剂CH223191联合使用时，并不能逆转皮肤衰老，表明这些代谢物通过激活AhR来促进皮肤表皮细胞分化，从而发挥抗衰老作用。

4 讨论

皮肤作为人体面积最大的器官，在发挥重要的生理功能的同时，其社会和美观作用同样不可忽视。然而，随着年龄的增长，皮肤也在逐渐衰老，其含水量、胶原蛋白含量和表皮厚度有所下降，最终产生皱纹[35]。因此，逆转皮肤衰老已成为重要的研究热点。在皮肤衰老的过程中，肠道微生物群也会被破坏。我们假设年轻小鼠的肠道微生物群可以改善老年小鼠的皮肤衰老。我们的研究结果表明，给老年小鼠移植来自年轻小鼠的肠道菌群确实可以缓解皮肤衰老，其机制主要是通过Trp和ILA代谢物激活AhR促进皮肤表皮分化。

首先，我们使用了抗生素处理的小鼠模型[36]。将年轻小鼠的粪便菌群移植到Old-Y小鼠肠道中。我们发现了Old-Y组小鼠皮肤含水量、表皮厚度、胶原含量以及分化蛋白和紧密连接蛋白（ZO-1、occludin和claudin-1）表达量的增加，这表明来自年轻小鼠的微生物群对皮肤屏障功能有积极影响[37]。与我们的研究结果相似，先前的一项研究[30]也报道从年轻小鼠移植粪便菌群到老年小鼠能够改善老年小鼠的皮肤衰老和整体健康。总的来说，这些数据表明，来自年轻小鼠的微生物群可以缓解由衰老引起的皮肤屏障损伤。

已有研究表明，肠道微生物可以通过肠道-皮肤轴影响皮肤健康[20]。我们的研究发现粪菌移植可以通过重建正常的肠道菌群来延缓衰老小鼠的皮肤衰老，粪菌移植后Old-Y组小鼠肠道菌群的α多样性和β多样性与Young组小鼠的微生物群相似。粪菌移植使老年小鼠体内菌群结构和组成发生变化，主要表现为年轻小鼠中的有益菌定植，如乳杆菌和乳球菌。这表明移植年轻小鼠的肠道菌群能够恢复老年小鼠的健康微生物群。乳杆菌是一种对人体有益的益生菌，已有研究报道了几种乳杆菌具有抑制致病菌[38‒39]、改善肠道屏障[40]、调节免疫系统[41]、显示抗癌活性[42]和延缓皮肤衰老[43]等益处。Levkovich等[44]给小鼠补充罗伊氏乳杆菌发现其能够降低皮肤pH值，增加皮肤厚度，并通过促进皮脂细胞的产生使皮肤更有光泽。然而我们的研究也存在一定的局限性，肠道微生物群可能通过影响皮肤等其他器官的微生物群发挥作用[45‒46]，但本研究并没有对此进行探究。后续我们也将开展粪菌移植对皮肤微生物群的变化及其对皮肤功能的影响。

我们假设肠道中的益生菌可能通过产生有益代谢物使皮肤年轻化，所以我们检测了粪菌移植后小鼠粪便和血清中的代谢物。有趣的是，在Old-Y组小鼠的粪便和血清中，L-Trp和ILA水平均有所增加；KEGG结果表明，相较于Old组小鼠，Old-Y组小鼠粪便中的代谢物主要与Trp代谢相关。此外，为了验证非靶向代谢组检测结果，我们对小鼠粪便、血清和皮肤组织中的Trp和ILA浓度进行了定量分析。Trp是一种人体无法合成、仅能通过饮食获得的必需氨基酸。作为蛋白质生物合成的关键前体，Trp对维持肠道屏障完整性和免疫功能至关重要，并已被证明可以缓解衰老小鼠的神经性变性和皮肤炎症[47‒49]。

已有研究报道肠道菌群影响色氨酸代谢，例如，吲哚及其衍生物被确定为肠道Trp代谢物[50]。文献报道乳杆菌可以通过Trp代谢物ILA发挥抑癌作用[51]。因此，我们假设Trp可能通过其代谢物ILA缓解皮肤衰老。我们通过研究Trp/ILA对衰老皮肤屏障功能的改善情况验证这一预设。值得注意的是，单独使用Trp或ILA都能显著缓解衰老导致的皮肤屏障破坏；而Trp与抗生素联合使用则不能发挥作用，但抗生素不能改变ILA的效果。这表明，肠道菌群在Trp的抗衰老功能中起着至关重要的作用，肠道微生物通过代谢Trp产生ILA改善皮肤功能。

皮肤屏障功能包括机械屏障、微生物屏障、化学屏障和免疫屏障，机械屏障包括紧密连接、黏附复合物、角质层和细胞骨架[52‒53]。AhR在包括皮肤在内的各种屏障组织中表达。AhR在角质形成细胞中对皮肤细胞分化至关重要，AhR受体缺乏的小鼠表现出经皮水分散失增加和皮肤屏障受损[28,54]。在本研究中，我们通过使用AhR抑制剂CH223191阻断AhR激活，同时给药Trp和ILA观察小鼠皮肤屏障功能的变化，对Trp和ILA发挥抗衰老作用的机制进行了研究。我们发现CH223191降低了先前在人类皮肤和角质形成细胞中发现的AhR靶基因CYP1A1，这表明AhR通路受到抑制。之前的研究表明，AhR缺陷小鼠在吡喹酮诱导的牛皮癣样皮肤炎症中表现出增强的炎症[55]。类似的研究发现煤焦油洗剂可以诱导表皮分化，恢复聚丝蛋白表达，并通过激活AhR，以AhR依赖的方式改善皮肤屏障蛋白[56]。其他研究也表明，乳杆菌代谢Trp产生的AhR配体，如吲哚-3-甲醛，能够促进白细胞介素-22的产生[57]。

5 结论

我们的研究结果表明，将年轻鼠的粪便移植给老年鼠可以逆转皮肤衰老。乳杆菌和乳球菌等益生菌代谢Trp产生的ILA代谢物促进肠道和皮肤之间的联系。因此，补充乳杆菌、Trp和ILA可以达到与粪菌移植相似的效果。Trp和ILA都通过AhR途径改善皮肤表皮分化。因此，补充益生菌或其代谢产物可能是改善皮肤衰老的潜在策略。

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