miR-29 介导的代谢重编驱动小肠干细胞的再生过程

林莹莹 ,  陆瑶 ,  王宇琦 ,  吕聪 ,  陈娟 ,  罗永挺 ,  全亨 ,  于伟茹 ,  陈俪宁 ,  黄子彧 ,  郝彦玲 ,  王清宇 ,  罗庆锋 ,  闫竞宇 ,  李依璇 ,  张伟 ,  杜敏 ,  何剑 ,  任发政 ,  郭慧媛

工程（英文） ›› 2024, Vol. 42 ›› Issue (11) : 43 -62.

PDF (14887KB)
工程（英文） ›› 2024, Vol. 42 ›› Issue (11) : 43 -62. DOI: 10.1016/j.eng.2024.08.008
研究论文

miR-29 介导的代谢重编驱动小肠干细胞的再生过程

作者信息 +

The Regeneration of Intestinal Stem Cells Is Driven by miR-29-Induced Metabolic Reprogramming

Author information +
文章历史 +
PDF (15244K)

摘要

肠道干细胞（ISCs）是肠道上皮更新及肠道肿瘤的原动力，当受到损伤时，它们会快速补充丢失的库存，从而支持上皮的修复或肿瘤的再生过程。揭示这种可塑性的机制对于肠道健康至关重要。近年来，研究表明代谢途径可以控制稳态下干细胞的命运，但是代谢对于ISCs损伤后再生的作用尚不明确。在本研究中，我们发现miR-29a和miR-29b（miR-29a/b）在人结直肠肿瘤数据库中是与肠道成瘤及放疗后不良预后高度相关的代谢调控因子。我们还发现，这两种小RNA是维持小鼠肠道干性所必需的，并且它们的表达会在辐照损伤后的新生ISCs中升高，驱使ISCs的命运从分化向自我更新转变。ISCs中上调的miR-29a/b会抑制脂肪酸氧化（FAO），降低氧化磷酸化水平，从而调控ISCs的分化更新平衡。敲除miR-29a/b会妨碍上述作用，导致ISCs介导的肠道上皮修复受阻。最后，我们筛选了miR-29a/b的潜在靶点，确定了转录因子Hnf4g为关键靶基因，且该基因能够通过调控FAO相关酶的表达来实现代谢重编。本研究发现了ISCs介导再生的一个重要的代谢调控机制，并为肠道修复及肿瘤治疗挖掘了更多针对性的有效策略。

Abstract

Intestinal stem cells (ISCs) initiate intestinal epithelial regeneration and tumorigenesis, and they experience rapid refilling upon various injuries for epithelial repair as well as tumor reoccurrence. It is crucial to reveal the mechanism underlying such plasticity for intestinal health. Recent studies have found that metabolic pathways control stem cell fate in homeostasis, but the role of metabolism in the regeneration of ISCs after damage has not been clarified. Here, we find that in a human colorectal cancer dataset, miR-29a and b (miR-29a/b) are metabolic regulators highly associated with intestinal tumorigenesis and worse prognostic value of radiotherapy. We also show that these two microRNAs are required for intestinal stemness maintenance in mice, and their expression is induced in regenerated ISCs after irradiation injury, resulting in skewed ISC fate from differentiation towards self-renewal. This upregulation of miR-29a/b expression in ISCs leads to suppression of fatty acid oxidation (FAO) and depression of oxidative phosphorylation, which in turn controls the balance between self-renewal and differentiation of ISCs. Deletion of miR-29a/b prevents these effects and thus impairs ISC-mediated epithelial recovery. Finally, we filter the potential targets of miR-29a/b and identify Hnf4g, a transcription factor, that drives this metabolic reprogramming through regulating FAO-related enzymes. Our work discovers an important metabolic mechanism of ISC-mediated regeneration and potentially pave the way for more targeted and effective therapeutic strategies for intestinal repair as well as tumor treatment.

关键词

MiR-29a/b / 肠道干细胞 / 再生 / 线粒体氧化磷酸化 / 脂肪酸氧化 / Hnf4g

Key words

MiR-29a/b / Intestinal stem cells / Regeneration / Mitochondrial oxidative phosphorylation / Fatty acid oxidation / Hnf4g

引用本文

引用格式 ▾
林莹莹,陆瑶,王宇琦,吕聪,陈娟,罗永挺,全亨,于伟茹,陈俪宁,黄子彧,郝彦玲,王清宇,罗庆锋,闫竞宇,李依璇,张伟,杜敏,何剑,任发政,郭慧媛. miR-29 介导的代谢重编驱动小肠干细胞的再生过程[J]. 工程（英文）, 2024, 42(11): 43-62 DOI:10.1016/j.eng.2024.08.008

登录浏览全文

4963

注册一个新账户 忘记密码

富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5阳性（Lgr5+）肠道干细胞（ISCs）分布在肠道隐窝底部，因此又被称为隐窝基底柱状（CBC）细胞，它们既能通过分化产生其他类型的肠道细胞，又能通过自我更新维持自身库存。ISCs的自我更新与分化平衡促使肠道上皮在生理状态下每3~5天完成一次更新[1]。当受到各种形式的损伤时，ISCs会通过减少分化、加快更新的方式驱动上皮再生[2]。衰老时，ISCs的上述可塑性会降低，肠道功能也会发生障碍。而在肿瘤中，这种可塑性会更强，帮助它们抵抗治疗。虽然已有研究报道了一些调控ISCs可塑性的信号通路[3]，但它的机制十分复杂，需要进一步研究来阐明。
代谢途径已被广泛认为能够根据环境变化调控细胞，因此代谢重编在损伤后再生中发挥着重要作用。细胞通过两种代谢方式获取能量：线粒体中进行的氧化磷酸化（OXPHOS）和不依赖于线粒体的糖酵解。这两种代谢模式能够决定细胞功能，OXPHOS通常参与稳态下的细胞生长，而糖酵解一般与细胞的快速增殖（如肿瘤）相关。ISCs也遵循着这个原则，有着丰富且高活性的线粒体，通过OXPHOS维持稳态下的功能[4‒6]，而在ISCs介导组织再生时的代谢模式尚未有定论。越来越多证据显示与OXPHOS相关的线粒体内代谢途径，如脂肪酸氧化（FAO），也能够调控ISCs的性状[7]。近年来的研究表明FAO对于ISCs的维持至关重要。禁食通过激活FAO改善ISCs功能，但不影响细胞增殖[8]。在高脂饮食（HFD）诱发的肠道肿瘤中，增强的FAO被认为与细胞增殖有关[9]。与之相反，另两项研究[10‒11]发现，通过基因敲除下调ISCs的FAO水平可促进增殖并抑制分化。由此可见，虽然FAO对于ISCs命运调控的重要性是毋庸置疑的，但鉴于在不同场景下FAO功能的复杂性，已有的研究存在许多矛盾，代谢途径如何参与ISCs在上皮再生中的可塑性尚不明确。
为了更好地了解ISCs应对损伤时的代谢可塑性，并依据此制定干预策略，我们需要寻找参与这个生物过程的内源调控因子。目前，除了直接参与代谢过程的酶，一些能够影响ISCs功能的代谢调控因子也被研究者们挖掘[12]。其中，小RNA（miRNA）因其在表观遗传学中的独特作用引起了广泛关注，它们既能响应环境的变化，又能同时调控一系列蛋白的表达，是高效的干预靶点。近期的研究发现microRNA-277能够调控ISCs中与FAO相关的基因[13]。另外，microRNA-31被发现能够响应肠道损伤，从而改变ISCs命运[14‒15]。这些证据说明miRNAs作为代谢和ISCs损伤的双重调控因子具有巨大潜力。miRNAs中microRNA-29（miR-29）就展现出这种潜力。miR-29家族的三个成员包括miR-29a、miR-29b和miR-29c，它们包含着相同的种子序列。它们位于两条不同染色体上，一个染色体上包含miR-29a和miR-29b1，另一个包含miR-29c和miR-29b2（miR-29b1和miR-29b2的基因序列相同）。miR-29a和miR-29b（miR-29a/b）在代谢紊乱中的调控作用在心脏、肝脏、肺和肾脏中已被报道脂肪稳态有关，通过靶向编码脂吸收或分解相关酶的信使RNA（mRNA）实现[16‒19]。这些结果表明miR-29a/b是潜在的代谢调控因子，但它们对于肠道稳态及再生的代谢调控作用尚未有研究。同时，一些体内研究表明miR-29a/b能够通过免疫调节作用缓解肠道炎症[20‒22]，但它们对于肠上皮细胞的影响只在体外研究中报道[23‒26]。另外，我们的前期研究[27]发现补充miR-29b可以促进肠道上皮炎症损伤后的修复，这可能与ISCs有关，但尚无直接证据。综上所述，miR-29a/b在代谢调控和肠上皮修复中都展现出了潜力，是ISCs损伤后代谢可塑性的潜在调控因子。
为了探究miR-29a/b在ISCs介导上皮再生过程中的作用，并明确miR-29a/b是否通过代谢途径调控ISCs命运，我们构建了Mir29ab1-敲除（KO）小鼠，为ISCs在稳态及损伤场景下的命运变化锁定新的代谢调控因子。

2 材料与方法

2.1 小鼠模型

雄性或雌性小鼠以同性别、标准饲料、每笼6只饲养于中国农业大学无特定病原体（SPF）级动物房。辐照实验中，小鼠在北京大学接受12 Gy的60Co源γ-射线处理。所有动物实验皆由中国农业大学实验动物福利及动物实验伦理审查委员会批准（批准号为AW31012202-4-3）。Villin-Cre和Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2转基因小鼠由中国农业大学于政权教授赠送。Mir29ab1flox/+ 和Mir29ab1 +/-转基因小鼠由上海南方模式生物科技股份有限公司构建。Mir29ab1 +/-小鼠合笼得到Mir29ab1 +/+小鼠和Mir29ab1 -/-小鼠；Mir29ab1flox/+ 小鼠合笼得到Mir29ab1 +/+小鼠和Mir29ab1flox/flox 小鼠；Mir29ab1 +/+和Mir29ab1 -/-小鼠与Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2小鼠合笼；Mir29ab1flox/flox 小鼠与Villin-Cre小鼠合笼得到Mir29ab1villin-KO 小鼠。所有实验小鼠皆为C57BL/6N品系，3~5月龄小鼠用于实验。本研究采用同窝对照。

2.2 人群样本

本研究在中国人民解放军总医院收集了23个人的新鲜结肠息肉及其息肉旁正常组织。实验由中国农业大学人类研究伦理委员会批准（批准号为CAUHR2021020）。样本收集后立即置于液氮保存。

2.3 隐窝提取及类器官培养

小鼠小肠隐窝提取采用文献报道的方法[28]。简单来说，先取出小鼠小肠，刮去绒毛并多次清洗，于5 mmol∙L-1 乙二胺四乙酸（EDTA）中消化。收集隐窝后，过70 μm细胞筛，离心取沉淀，用DMEM/F12培养基（Gibco，美国）重悬并计数，以每孔2000个隐窝的密度接种于24孔板。每孔接入50 μL液滴，包含30%的DMEM/F12和70%的Matrigel [Corning（美国），356237]，并用450 μL含1×青霉素-链霉素-庆大霉素的小肠类器官生长培养基[GM；StemCell （美国），06005]覆盖。培养7天后形成原代类器官。

类器官传代时，先用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）吹散基质胶，之后200g离心5 min，重悬并吹吸分散，以原代类器官培养时相同的方法接种于24孔板。

2.4 细胞系培养及转染

LS174T细胞（ATCC，美国）用含有1 mmol∙L-1丙酮酸钠盐（Gibco）和10%胎牛血清（Biological Industries，以色列）的MEM培养基（Gibco, 11095080）培养。HEK293T细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基（Gibco, 11995065）培养。二者培养时皆加入青霉素-链霉素。进行miR-29a/b过表达或抑制时，细胞用Opti-MEM培养基（Gibco）培养，并用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen，美国）转染40 nmol∙L-1 hsa-miR-29a-3p或hsa-miR-29b-3p模拟物或抑制剂（Biolino）6 h。抑制剂是可以特异性结合特定miRNA的化学修饰RNA，能够抑制miRNA对靶基因发挥的功能。转染后在正常培养基中培养24 h后提取RNA，培养48 h时提取蛋白。敲低Hnf4g实验中，细胞转染50 nmol∙L-1小干扰RNA（siRNA） （si-Hnf4g, GenePharma）。过表达Hnf4g实验中，先构建包载人源HNF4G DNA的质粒（pcDNA-Hnf4g, GenePharma），之后用2 μg∙mL-1质粒转染细胞。

2.5 定量聚合酶链反应（Q-PCR）

用TRIzol法提取组织或细胞系RNA，用微量RNA纯化试剂盒（TIANGEN）提取类器官RNA。RNA用5× All-In-One RT MasterMix（Applied Biological Materials，加拿大）反转录成互补DNA（cDNA）。目标基因表达的测定采用Q-PCR，依据TB Green Premix Ex Taq（Takara，日本）使用说明进行。结果用内参基因和相对CT法处理。引物序列在附录A表S1中展示。

定量检测miR-29表达时，先向提取的RNA加入1 μL miR-29a/b-RT、1 μL U6-RT配成10 μL体系，70 °C加热10 min，之后加入0.6 μL脱氧核苷三磷酸（dNTP）、0.6 μL莫罗尼小鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLV）、1 μL重组核糖核酸酶抑制剂（RRI）和5× M-MLV（Promega，美国）缓冲液并在42 °C下反转1 h。引物序列在附录A表S2中展示。

2.6 RNA测序

本研究采用标准流程进行RNA测序分析：首先分离隐窝组织并提取RNA，使用美国NEBNext® Ultra™ Directional RNA Library Prep Kit for Illumina®建库试剂盒构建Illumina测序文库。采用美国Thermo Fisher Scientific公司Qubit2.0荧光计进行初始浓度定量（稀释至1.5 ng∙μL-1），随后通过美国Agilent 2100生物分析仪检测插入片段大小，并运用Q-PCR精确定量确保有效浓度大于2 nmol∙L-1。合格文库经美国Illumina NovaSeq 6000平台进行HiSeq测序，使用HISAT2（v2.0.5）将读数比对至参考基因组，通过DESeq2 R（v1.20.0）完成差异表达分析。全部实验由诺禾致源公司完成，原始数据已存储于基因表达综合数据库（登录号为GSE216670）。分析过程中排除了1例野生型（WT）小鼠样本和1例Mir29ab1 -/-基因敲除小鼠样本。

2.7 细胞分选

从Lgr5-GFP小鼠小肠分离出来的隐窝用Dispase II（Roche，德国）和100 U DNaseI（TIANGEN）在37 °C下消化4 min，之后过40 μm细胞筛，获得单细胞悬液。500g 离心5 min后，细胞用1 mL PBS重悬，加入7-氨基放线菌素D（7-AAD）染料，在冰上放置15 min。Lgr5high、Lgr5low、CD24-Lgr5-和CD24+侧向散射（SSC）high Lgr5-细胞用流式分选仪（BD）分离收集。

2.8 细胞周期测定

细胞用70%乙醇在-20 °C下固定2 h，之后用细胞周期与凋亡检测试剂盒（Beyotime）中的碘化丙啶在37 °C染色30 min。最后，用流式细胞分析仪（Beckman，美国）测定不同细胞周期的细胞占比。

2.9 组织病理学分析

小肠组织用多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋。将样品切成5 μm厚切片，脱蜡后用苏木素染色30 s，伊红染色10 s。检测杯状细胞时，脱蜡的切片用过碘酸-雪夫（PAS）试剂盒（LEAGENE）染色。

2.10 免疫组化及免疫荧光染色

切片在脱蜡和抗原修复后进行封闭，加入一抗并在4 °C过夜，之后用结合辣根过氧化物酶（HRP; ZSGB-BIO）或荧光标记（Abcam，英国）的抗体孵育。免疫组化采用二氨基联苯胺和苏木素处理，免疫荧光用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（Beyotime）染色。随后，用显微镜（Leica，德国）观察。免疫组化及免疫荧光染色抗体如下：Ki67（Abcam, ab15580）、OLFM4 [Cell Signaling Technology（美国），39141]、绿色荧光蛋白（GFP; Cell Signaling Technology, 2956）、溶菌酶（Abcam, ab108508）、黏蛋白2（MUC2; Servicebio, GB11344）、嗜铬粒蛋白A（CHGA; Abcam, ab15160）、cleaved caspase3（Cell Signaling Technology, 9664）、性别决定区Y框蛋白9（SOX9; Abcam, ab185230）、增殖细胞核抗原[PCNA；Santa Cruz Biotechnology（美国），sc-56]。

2.11 EdU染色

小鼠腹腔注射50 μg·g-1体重（BW）的5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）。小肠用上述方式处理成切片，脱蜡、清洗后用BeyoClick™ EdU 细胞增殖试剂盒（Beyotime）的click反应液孵育30 min，用Hoechst 33342染细胞核。

2.12 阿利新蓝染色

细胞用4%多聚甲醛固定15 min，之后用阿利新蓝（Solarbio，中国）染色15 min。核固红（Solarbio）用作细胞核染料。

2.13 原位杂交

脱蜡水化后的组织切片用10 μg∙mL-1蛋白酶K在37 °C处理10 min、0.1 mol·L-1三乙醇胺在室温处理10 min去除蛋白。用预杂交缓冲液在60 °C平衡2 h，与30 nmol·L-1探针（Exiqon，丹麦）在65 °C杂交16 h。之后依次用2×生理盐水柠檬酸钠（SSC; 2 × SSC是将0.15 mol·L-1氯化钠和0.017 mol·L-1柠檬酸钠溶于无RNA酶的水中，pH = 9.5, 65 °C, 2 × 10 min）、50%福尔马林和2 × SSC （3 × 30 min）、1% Tween-20和PBS（5 × 5 min）清洗，然后用碱性磷酸酶标记的抗地高辛检测抗体室温孵育2 h，最后用显色试剂[0.35%氮蓝四唑（NBT），0.35% 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（BCIP）和1.17 mmol∙L-1左旋咪唑]避光染色48 h以上。样品用核固红衬染。

2.14 免疫印迹

分别用放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液和细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（Beyotime）提取总蛋白和核蛋白。调节浓度后用5×上样缓冲液煮沸，通过十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离蛋白，转印至聚乙二烯膜，孵育一抗。孵育二抗（Beyotime）和化学发光试剂后，使用Amersham Imager 600仪器（GE，美国）曝光获得蛋白印迹。使用的一抗如下：PCNA（1∶500, Santa Cruz Biotechnology, sc-56）、单链抗体1（SCA1; 1∶2000, Abcam, ab109211）、β-tubulin（1∶2000, YEASEN，30301ES60）、肉毒碱棕榈酰基转移酶1A（CPTA1; 1∶1000, Abcam, ab234111）、三羟基三甲基辅酶A合成酶2抗体（HMGCS2; 1∶2000, Abcam, ab137043）、肝细胞核因子4γ [HNF4γ; 1∶1000, Novus （美国）, NBP2-98898，反应种属为小鼠]、HNF4γ [1∶1000, Lsbio （美国），LS-C164948，反应种属为人]、丙酮酸脱氢酶激酶4（PDK4; 1∶1000, Abcam, ab214938）、聚类分化群36（CD36; 1∶1000, Abcam, ab133625）、中链脂酰辅酶A脱氢酶 （ACADM; 1∶10000, Abcam, ab92461）、组蛋白3（H3; 1∶2000, Cell Signaling Technology, 4499）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH; 1∶1000, Novus, NB300-211）。

2.15 双荧光素酶实验

将人胚肾细胞（HEK293T）接种于24孔板，用DMEM培养基培养。miRGLO荧光素酶对照（miRGLO basic, Promega）、野生型（WT）miRGLO Hnf4g 3′-非翻译区（UTR）（Hnf4g-WT）和突变型miRGLO Hnf4g 3′-UTR（Hnf4g-Mut, 敲除了miR-29a/b与Hnf4g 3′-UTR区域的结合序列）荧光素酶质粒由吉玛基因构建。用Lipofectamine 2000转染试剂，将40 nmol∙L-1阴性对照（NC）模拟物/抑制剂或miR-29a/b-3p模拟物/抑制剂（GenePharma），以及50 ng质粒共转染细胞6 h。再培养24 h后，用Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒（Promega）测定荧光素酶，用海肾荧光素酶做对照。上述模拟物、抑制剂及质粒的序列在附录A中表S3至表S5展示。

2.16 Seahorse细胞能量代谢分析

类器官Seahorse能量代谢分析方法遵循前人报道[29]。类器官第四次传代并培养36 h后，将4孔类器官接种到24孔Seahorse XFe24细胞培养微孔板上（Agilent, 102340-100），每孔接种3 μL。线粒体压力测试中，培养36 h时将培养基替换成测试培养基（含10 mmol∙L-1葡萄糖、5 mmol∙L-1丙酮酸纳和2 mmol∙L-1谷氨酰胺的Seahorse XF DMEM培养基，pH = 7.4, Agilent, 103575-100），在37 °C下培养1 h，随后开展测试：依次加入5 μmol·L-1寡霉素（MCE，美国，HY-N6782）、2 μmol·L-1羰基氰对三氟甲氧基苯腙（FCCP; MEC, HY-100410）和4 μmol·L-1鱼滕酮（MCE, HY-B1756），每次添加后混合4 min、测定2 min，循环三次（寡霉素加入后的第一个循环为混合5 min、等待10 min、测定2 min）。糖酵解压力测试中，将培养基替换成含2 mmol·L-1谷氨酰胺的测试培养基，测试加药依次为10 mmol·L-1葡萄糖、5 μmol·L-1 寡霉素、100 mmol·L-1 2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG; MCE, HY-13966），分别进行混合4 min、等待1 min、测定2 min；混合5 min、等待10 min、测定2 min，一次循环；再混合4 min、测定2 min，两次循环；混合4 min、测定2 min，共完成上述三次循环。FAO压力测试中，培养基先替换成底物限制性培养基，该限制性培养基为含0.667 × B27（Gibco）、1 × N2 （Gibco）、50 ng·mL-1表皮生长因子（EGF; Peprotech，美国，315-09-100）、100 ng∙mL-1 noggin（Peprotech, 250-38）、500 ng·mL-1 R-spondin1（Sinobiological, 50316-M08S）、0.5 mmol·L-1葡萄糖、1 mmol·L-1谷氨酰胺（Gibco）和0.5 mmol·L-1 L-肉碱（MCE, HY-B0399）的Seahorse XF DMEM培养基，培养6 h（5% CO2），再替换成含2.5 mmol·L-1葡萄糖和0.5 mmol·L-1 L-肉碱的测试培养基，培养45 min。随后，加入100 mmol·L-1棕榈酸（Sigma，德国）或牛血清白蛋白（BSA），按照线粒体压力测试程序上机，除了在添加寡霉素前增加一步添加40 μmol·L-1 etomoxir（MCE, HY-50202），进行混合4 min、测定2 min，三个循环的测试。测试得到耗氧速率（OCR）和胞外酸化率（ECAR）。

LS174T细胞的线粒体压力测试与类器官的差别为测试培养基是含10 mmol·L-1葡萄糖、1 mmol·L-1丙酮酸钠、2 mmol·L-1谷氨酰胺的Seahorse XF DMEM（pH = 7.4）。添加药物依次为1.5 μmol·L-1寡霉素、1 μmol·L-1 FCCP、1 μmol·L-1鱼滕酮，并进行混合3 min、等待2 min、测定3 min的三个循环测试。

2.17 13C-棕榈酸标记和液相色谱-质谱（LC-MS）测定

代谢产物按照文献报道的方法标记和测定[9]。分离的隐窝或转染的LS174T细胞用含100 μmol·L-1 13C-棕榈酸（Sigma, 605573）的RPMI 1640无糖培养基（Gibco）以每孔500 μL接种于24孔板，37 °C、5% CO2孵育1 h。PBS清洗后200g离心5 min，LC-MS级别甲醇、乙腈和水以1∶1∶2的比例混合加入沉淀，涡旋10 min，4 °C离心10 min，真空干燥后用100 μL LC-MS级水重悬。LC-MS采用两性离子亲水相互作用液相（ZIC-pHILIC）色谱柱（2.1 mm × 150 mm, 5 μm, EMD Millipore，德国）。A相是20 mmol·L-1 NH4HCO3、0.1% NH3·H2O；B相是乙腈。B相的比例按照线性梯度改变：80% 到20% 20 min，20%到80% 30 s，最后在80% 维持9.5 min。流速为0.15 mL·min-1。质谱使用Q Exactive orbitrap仪器 （Thermo Fisher Scientific）， 通过多重反应监测模式完成，参数设定如下：喷雾电压为负离子模式4500 V，正离子模式5500V，温度为500 °C，辅助气体1/2设定在55 psi（1 psi = 6894.76 Pa）。标准品从Sigma购入。

2.18 脂肪酸摄取及消耗

LS174T细胞接种于爬片上，转染NC抑制剂或miR-29a/b-3p抑制剂后，用100 μmol·L-1 BOTIBY标记棕榈酸 （Invitrogen, D3821）处理12 h。随后，更换新鲜培养基，再培养24 h后用显微镜拍摄。

2.19 DNA拷贝数测定

类器官总DNA用TIANamp微量DNA提取试剂盒（TIANGEN）提取。线粒体DNA拷贝数（mtDNA）用Q-PCR将mtDNA片段（Atp6、Nd2、Cytb、Dl）扩增测定，以核基因β-actin为内参。mtDNA引物序列在附录A表S1中展示。

2.20 JC-1染色

类器官接种在爬片上，传代后第三天染色。10 μg∙mL-1 5,5′,6,6′-四氯-1,1′,3,3′-四乙基苯并咪唑基碳菁碘化物（JC-1）染料（Invitrogen, T3186）加入培养基，在37 °C下孵育20 min。随后，更换新鲜培养基，用Zeiss共聚焦显微镜和结构光照明显微镜（中国科学院生物物理所，李栋实验室）进行实时成像。

2.21 电子显微镜拍摄

肠道组织用2.5%戊二醛（Solarbio）在室温固定1 h后放于4 °C。之后用1% OsO4进一步固定4 h，梯度丙酮脱水（50%、70%、80%、90%、95% 各15 min；100% 20 min两次）。包埋聚合（37 °C 12 h、45 °C 12 h、60 °C 48 h）后，样品制成70~100 nm厚的切片，2%醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色。用JEM-1200EX电子显微镜（JEOL，日本）拍摄。

2.22 三磷酸腺苷（ATP）测定

细胞ATP水平在转染后48 h测定，使用增强型ATP检测试剂盒（Beyotime）。上清和检测液反应后用Infinite M200 Pro多功能酶标仪（Tecan，瑞士）检测相对荧光。ATP含量用蛋白浓度标准化，蛋白浓度用二辛可宁酸（BCA）法（Beyotime）检测。

2.23 代谢组学

从小肠提取隐窝后冻存于液氮。在200 μL水中涡旋30 s，将样品冻融三次，在冰上超声10 min。根据蛋白浓度，将样品用水溶解，转移到离心管中，加入含同位素标记内标物的450 μL甲醇，在40 °C下孵育1 h。随后，4 °C、13 800g离心15 min。上清注入超高效液相色谱（UPLC）仪，使用高强度二氧化硅（HSS） T3 2.1 mm × 100 mm色谱柱（粒径为1.8 μm）（Vanquish, Thermo Fisher Scientific）。A相是5 mmol∙L-1乙酸铵、5 mmol∙L-1乙酸；B相是乙腈。质谱使用Orbitrap Exploris 120质谱仪（Orbitrap MS），分辨率为60 000（全扫描MS）和15 000（MS/MS），毛细管温度设定在320 °C，碰撞能量设定在10/30/60，归一化碰撞能量（NCE）模式，喷雾电压为3400 V（负离子）和3800 V（正离子），鞘气流速为50 Arb（即任意单位），辅助（Aux）气流速为15 Arb。整个测序由百趣公司开展。

2.24 数据分析

所有实验均有三次独立重复。类器官实验和体内实验，每个组别的样本均来自于至少三只不同小鼠。除了miR-29a/b和Hnf4g在辐照（IR）后不同天的表达结果是用平均值±标准误（SEM）的形式呈现，以及生存率是用Kaplan-Meier生存曲线图展示的，其他结果以平均值±标准差（SD）的形式呈现。数据分析使用SPSS（IBM，美国）、Excel（Microsoft，美国）和GraphPad Prism（GraphPad Software，美国）软件。作图及图像分析使用Image J（National Institutes of Health，德国）软件。流式分析使用FlowJo 10.4 （FlowJo LLC.，美国）软件。基因集富集分析（GSEA）使用GSEA 4.1.0（Broad Institute，美国）软件。两组之间差异显著性分析采用Student t检验。P < 0.05被认为差异显著，*表示P < 0.05，**表示P < 0.01，***表示P < 0.001，ns表示差异不显著。多组间差异显著性分析采用单因素方差分析（ANOVA）伴随邓肯事后检验，P < 0.05被认为差异显著，显著性用a、b表示。动物按照基因型随机分组。动物实验非双盲实验。

2.25 数据可用性

未剪裁的免疫印迹条带已上传至Mendeley（DOI: 10.17632/8kkgwgy4xj.1）。

3 结果

3.1 MiR-29a/b是小肠上皮更新所必需的

结直肠癌（CRC）的发生起始于过度增生的腺瘤，伴随着肠道上皮干性的增加。基于癌症和肿瘤基因图谱中结直肠腺瘤（TCGA-COAD/READ）队列的miRNA测序数据，我们发现hsa-miR-29a-3p和hsa-miR-29b-1-3p在肿瘤中的表达比在正常组织中高[图1（a）]。另外，对于CRC患者放疗预后效果的生存率分析中，预后较差的患者这两种miRNA的表达也更高[图1（b）]。在COAD和READ的不同时期，miR-29a/b的表达从肿瘤发生开始就一直稳定维持在一个高水平，在最严重的IV期时变得更高[图1（c）]。同时，纯度高的肿瘤miR-29a/b也更多[图1（d）]。我们鉴定出许多在COAD和READ中与miR-29a/b表达具有相关性的基因，且基因本体论（GO）分析显示，有很大一部分基因属于线粒体代谢途径[图1（e）]。另外，GSEA结果显示能量代谢和脂代谢与miR-29a/b表达相关。基于这些分析结果，miR-29a/b表达与干性的上调正相关、与放疗预后负相关，且可能调控肠道代谢途径。

上述结果说明miR-29a/b对于肠道干性和损伤后干性复发十分重要，因此，我们推测miR-29a/b可能参与ISCs介导的上皮再生。miR-29a/b在不同物种间高度保守[图2（a）]，尤其是哺乳动物，所以可以用小鼠作为理想的模型来研究这两种miRNAs。为了明确miR-29a/b在小鼠肠道中的作用，我们首先进行了原位杂交染色，发现小肠miR-29a/b主要表达于上皮，且与绒毛相比，ISCs及过渡态的转运扩增（TA）细胞所在的小肠（SI）隐窝部位的表达更高[图2（b）]。接着，我们采用12 Gy的γ-射线辐照（γ-IR）破坏ISCs，并检测了miR-29a/b在损伤后的表达变化。MiR-29a/b在24 h（DNA损伤/细胞凋亡时期）的表达维持在低水平，但在辐照后2~3天（ISCs回补后开始出现再生性隐窝增殖）的新生隐窝中，它们的表达急剧上升，最终又在第5天（隐窝分化，上皮重建）恢复初始水平[图2（c）~（e）]。这些结果表明miR-29a/b可能在隐窝细胞中发挥功能，参与上皮的损伤后再生。

为了验证这种作用，我们构建了Mir29ab1基因敲除小鼠[附录A中图S1（a）~（c）]，与WT小鼠相比，稳态下的敲除鼠肠上皮结构没有变化[附录A中图S1（d）]，但ISCs介导的肠上皮更新速率减慢了[图2（f）和（g）]。

接着，为了进一步明确miR-29a/b在肠上皮再生中的作用，我们采用12 Gy γ-辐照处理WT和Mir29ab1-/- 小鼠[图3（a）]。Mir29ab1-/ -小鼠与WT小鼠相比体重下降更多、生存率更低[图3（b）和（c）]。组织病理分析显示，Mir29ab1-/ -小鼠与WT小鼠相比再生响应减弱[图3（d）]。另外，敲除小鼠的新生隐窝数量及增殖都更少[图3（e）~（g）；附录A中图S2（a）]。作为这些增殖隐窝的原动力，修复起点的再生ISCs数量在敲除鼠中也更少[图3（h）和（i）]。敲除鼠更低的增殖及CBC细胞标志基因表达水平进一步证实了这个结果[图3（j）和（k）]。修复相关（Sca1、Clu、Anxa1）及上皮紧密连接相关的标记基因表达也有所下调[图3（j）和（k）]。因此，再生隐窝分化细胞的数量也减少，导致辐照第5天时，Mir29ab1-/- 小鼠用足够数量的隐窝细胞重建上皮的能力也比WT小鼠更差[图3（l）和（m）；附录A中图S2（b）~（d）]。

因为间质及肠道以外其他组织也会对肠上皮再生产生影响，我们又用Villin-Cre工具小鼠构建了Mir29ab1肠上皮条件敲除的Mir29ab1villin-KO 小鼠，来排除miR-29a/b通过其他组织影响肠上皮的情况[图3（n）]。我们发现辐照对于肠上皮条件敲除小鼠的影响与对全身敲除小鼠的影响一致[图3（o）~（z）]。简而言之，Mir29ab1villin-KO 小鼠再生ISCs和增殖细胞数量、再生ISCs分化出来的细胞数量都比WT小鼠更低，由于上皮重建动力不足，在修复终点，绒毛长度也更短[图3（q）和（r）]。综上所述，我们的结果表明miR-29a/b在ISC介导的小肠上皮更新中发挥着直接作用，并且主要作用于辐照损伤后新生隐窝的产生过程。

3.2 缺失 miR-29a/b损伤ISCs干性

Lgr5+ ISCs能够维持肠道上皮在稳态下的正常更新及损伤时通过自我更新进行上皮重建。由于我们发现miR-29a/b在富含ISC的隐窝中高表达，且是稳态下肠上皮更新及损伤后上皮修复所需要的，我们想进一步探究miR-29a/b是如何调控ISCs命运的。首先，我们发现敲除Mir29ab1会导致CBC标记基因（Lgr5、Ascl2）和静息态ISCs标记基因（Dclk1、Lrig1、Bmi1、Msi1）的下调[图4（a）]。另外，我们采用Lgr5-GFP小鼠对ISCs进行标记[图4（b）]，并且发现在Mir29ab1 -/-小鼠小肠中，Lgr5+细胞群相比于WT小鼠占比降低[图4（c）~（f）]，表明敲除Mir29ab1会导致Lgr5+ ISCs的减少。我们又发现在隐窝细胞中G0/G1期的细胞占比在敲除鼠中更高[图4（g）；附录A中图S3（a）]，表明细胞分裂减少，因此ISCs自我更新受阻。

为了评估在没有微环境影响下，ISC在上皮再生中的功能，我们分析了从WT和Mir29ab1-/- 小鼠分离的小肠隐窝形成类器官的能力。值得注意的是，敲除Mir29ab1的隐窝形成小肠类器官的能力下降，出芽率变低[图4（h）~（j）]，并且传代后形成子代类器官的能力也受限[附录A中图S3（b）]。为了进一步评估ISCs的再生能力，我们用Wnt3a（WENR培养基）来诱导类器官囊泡化（隐窝结构消失），破坏干性（表示ISCs的数量及自我更新能力）。之后，我们将WENR培养基换成正常培养基（ENR）来评估隐窝重新形成能力[图4（k）]。WENR造模后，我们能观察到WT小鼠类器官在更换为ENR培养基后囊泡结构向出芽转化，而敲除Mir29ab1的类器官失去了隐窝形成能力[图4（l）和（m）]。另外，CBC细胞标记基因表达在敲除Mir29ab1的类器官中低于在WT类器官中[附录A中图S3（c）]，与体内结果一致。Lgr5+细胞数量在敲除的类器官中更低[图4（n）~（p）]，但有更多的分化细胞，包括潘氏细胞和杯状细胞[图4（q）和（r）；附录A中图S3（d）和（e）]，说明干性的降低是因为自我更新向分化转化。

为了确定miR-29a/b对ISCs的直接作用，我们对人源的LGR5+ LS174T细胞系[1]转染了miR-29a-3p和miR-29b-3p抑制剂[图4（s）；附录A中图S3（f）]，发现相比于对照组，G0/G1期细胞占比增多[图4（t）]。抑制miR-29a/b的这种效果能够解释敲除鼠中ISCs数量减少、更新变慢的原因。同时，我们发现miR-29a/b抑制剂处理后LGR5+细胞系分化变多[图4（u）和（v）]，体现了自我更新向分化的转化。综上所述，缺失miR-29a/b会通过细胞周期阻滞、促进细胞分化来降低ISCs自我更新，从而抑制干性。

3.3 缺失miR-29a/b引起ISCs线粒体代谢的改变

为了明确miR-29a/b参与调节ISCs干性的机制，我们对WT和Mir29ab1-/- 小鼠小肠隐窝进行了转录组测序[图5（a）~（d）]。通过GO分析，我们富集到了很多代谢途径，尤其是与代谢物转运相关的途径[图5（e）]，并且两组间的差异基因很多与营养代谢相关[图5（f）]。GSEA结果富集到与线粒体代谢相关途径，尤其是OXPHOS [图5（g）；附录A中图S4（a）]。

ISCs富含线粒体，线粒体代谢能够影响ISCs的自我更新与分化。为了明晰miR-29a/b与ISCs线粒体能量代谢的关系，我们首先关注能量的产生。miR-29a或miR-29b抑制剂会提升LGR5+细胞ATP的浓度[图5（h）]，这可能主要来源于OXPHOS。接着，我们评估了类器官的OXPHOS [图5（i）]，发现线粒体呼吸能力及与OXPHOS相关的耗氧率在敲除Mir29ab1的类器官[图5（j）~（m）]和抑制miR-29a/b的LGR5+细胞系中更高[附录A中图S4（b）~（d）]。与之一致的是，我们拍摄了线粒体并评估其膜电位（MMP），发现缺失Mir29ab1的隐窝OXPHOS水平更高[图5（n）~（p）；视频S1]。

基于上述结果，我们推测缺失Mir29ab1引起线粒体功能的改变。因此，我们用透射电镜分析了ISCs线粒体形态，发现在WT和Mir29ab1-/- 类器官中无差异[图5（q）；附录A中图S4（e）]。同时，mtDNA拷贝数在两组类器官间，以及在对照组和miR-29a/b抑制剂处理的LS174T细胞系间无差异[附录A中图S4（f）和（g）]。这些结果说明缺失miR-29a/b引起的OXPHOS升高不是通过影响线粒体结构及mtDNA含量实现。

3.4 缺失 miR-29a/b提高隐窝和ISCs中的FAO

由于缺失miR-29a/b激活OXPHOS不改变线粒体结构和mtDNA拷贝数，我们猜测miRNA引起的变化与为线粒体呼吸提供电子的代谢途径改变有关，进而驱动OXPHOS。为OXPHOS提供动力的代谢途径主要包括丙酮酸氧化和FAO。我们对WT和Mir29ab1-/- 小鼠来源小肠隐窝进行代谢组测序，基于主成分分析，我们发现两组的代谢物组成不同[图6（a）和（b）]。在敲除Mir29ab1隐窝和WT隐窝中有差异的代谢物大部分属于脂类或类脂类分子[图6（c）~（f）；附录A中图S5（a）]，即使是非脂类差异代谢物也与类脂类分子具有相关性[图6（g）]。另外，在敲除Mir29ab1的隐窝中，长链脂肪酸更少，它们能够被线粒体摄取，通过FAO代谢；而磷脂酰胆碱更多，它们能够加速FAO [图6（h）]。相似地，基于之前的转录组测序分析，我们发现基因敲除的隐窝中与FAO相关的基因在mRNA水平表达升高，而与丙酮酸氧化相关基因表达降低[附录A中图S5（a）~（c）]。与这些结果相一致的是，GO分析表明与脂肪酸代谢相关的基因在敲除Mir29ab1后表达上调[图6（i）]。PDK4的表达进一步证实了这些结果，它能抑制丙酮酸转化为乙酰辅酶A，从而限制糖酵解来源的乙酰辅酶A进入三羧酸（TCA）循环，从而让更多FAO来源的乙酰辅酶A进入TCA循环[附录A中图S5（a）]。PDK4的表达在基因敲除的隐窝和类器官，以及在抑制了miR-29a或miR-29b的LS174T细胞系中更高[附录A中图S5（d）~（g）]。综上所述，FAO激活可能是缺失miR-29a/b后OXPHOS升高的原因。

接着，我们通过以下实验验证我们的猜测[图6（j）]。我们用FAO抑制剂etomoxir处理类器官，之后进行Seahorse能量分析，发现敲除Mir29ab1的类器官对etomoxir的敏感性比WT类器官更高[图6（k）]，显示出OXPHOS对FAO更强的依赖性。为了验证FAO的上升，我们进行了代谢底物标记，来评估FAO对底物的利用。用[U-13C]标记棕榈酸处理后，Mir29ab1-/- 类器官产生的（M+2）乙酰肉碱和（M+2）柠檬酸盐占比更高[图6（l）]，这两个代谢物都来源于FAO对棕榈酸的代谢。为了鉴定FAO的激活是否发生在ISCs中，我们分选了隐窝中的Lgr5high细胞，检测FAO相关基因表达，发现在Mir29ab1-/- ISCs中表达更高[图6（m）；附录A中图S5（h）]，而在Lgr5-细胞中未看到这种变化[附录A中图S5（i）]。这些靶点基因能够编码对FAO非常重要的酶：肉碱棕榈酰转移酶1A（Cpt1A）是调控活化后的长链脂酰辅酶A进入线粒体发生氧化的酶；中链酰基辅酶A脱氢酶（Acadm）负责脂酰辅酶A氧化；3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶2（Hmgcs2）在FAO之后参与酮体合成。我们在抑制了miR-29a/b的LGR5+ LS174T细胞系中得到了一致的结果[图6（n）~（p）]。最后，我们用荧光标记的棕榈酸处理LS174T细胞系12 h后，更换新鲜培养基培养24 h。在抑制了miR-29a/b的细胞中，剩余的荧光标记棕榈酸更少[图6（q）和（r）]，说明棕榈酸通过FAO被消耗得更多。因此，缺失或抑制miR-29a/b确实能够激活ISCs中的FAO。为了明确FAO的升高是否足以驱动OXPHOS的增加，我们用FAO激活剂处理了LS174T细胞[附录A中图S5（j）]，发现提高FAO水平能够增加 OXPHOS水平[图6（s）和（t）]。

除了FAO，我们也关注了细胞能量代谢的另一个重要途径——糖酵解。MiR29ab -/-类器官更倾向于将葡萄糖变为乳酸，而不是丙酮酸氧化[附录A中图S5（k）~（m）]，排除了糖酵解促进OXPHOS的可能。另外，在缺乏葡萄糖时，敲除Mir29ab1的类器官依旧表现出更高的OXPHOS相关线粒体呼吸水平[附录A中图S5（n）和（o）]。这些结果突出了FAO是ISCs中促进OXPHOS升高的关键途径。

为了验证FAO的升高是miR-29a/b调控ISCs命运的途径，我们分析了激活FAO对ISCs干性的影响。我们发现FAO的激活促进LS174T细胞分化[图6（u）和（v）]。然而，当激活FAO时[附录A中图S5（j）]，抑制OXPHOS [附录A中图S5（p）]会使促分化的作用降低[图6（w）和（x）]，强调了缺失miR-29a/b对LGR5+细胞干性的调控是通过上调FAO并促进OXPHOS实现的。

接着，我们探索上升的FAO及其促进OXPHOS的效果是否也参与miR-29a/b介导的肠道损伤后再生。为了探究miR-29a/b如何在辐照后修复阶段调控ISCs，我们对辐照后3天WT和Mir29ab1 -/-小鼠小肠新生隐窝进行转录组测序[图7（a）]。我们通过京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析发现两组间差异基因与代谢途径相关性很强[附录A中图S6（a）]。值得注意的是，Mir29ab1 -/-小鼠在辐照后小肠新生隐窝中显著上调的基因，显示出与ATP产生及线粒体相关途径[图7（b）]，以及脂肪酸代谢途径[图7（c）]的富集。类似地，调控FAO的过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）途径相关基因在敲除Mir29ab1的隐窝细胞中表达高于WT细胞[图7（d）~（g）]。接着，我们确定了辐照损伤后隐窝中FAO相关酶在蛋白水平在敲除Mir29ab1的隐窝中的表达更高[图7（h）；附录A中图S6（b）~（c）]。我们进一步发现肠上皮FAO相关酶表达在损伤后第3天会降低[图7（i）]，与之前发现的miR-29a/b表达在同一时间点表达上升相对应，解释了Mir29ab1 -/-小鼠辐照损伤后的上皮更新受阻的原因。

综上所述，我们发现缺失miR-29a/b引起ISCs中FAO介导的OXPHOS水平升高，从而损伤其干性。我们还推测损伤引起的miR-29a/b上调能通过降低FAO和OXPHOS水平促进ISCs再生。

3.5 MiR-29a/b通过负靶向作用Hnf4g调控ISCs

MiRNA通过靶向基因mRNA的3′-UTR区域，诱导其降解，从而抑制基因翻译来发挥生物功能。为了特异性地找出miR-29a/b调控ISCs代谢重编及再生能力的靶基因，我们进行了计算机模拟（in silico）分析，在WT和Mir29ab1-/- 小鼠小肠隐窝在辐照后第3天的差异基因中寻找潜在的靶点。基于三个数据库（Targetscan、miRD8、PicTar），Hnf4g是唯一一个能预测到在3′-UTR区域和miR-29a/b有结合序列的差异基因[图8（a）]，并且结合区域在不同物种中保守[附录A中图S7（a）]。为了验证miR-29a/b能靶向作用Hnf4g，我们在HEK293T细胞上进行了双荧光素酶实验，发现miR-29a/b的模拟物/抑制剂能够抑制/提高野生型Hnf4g荧光强度，但当靶基因的miRNA种子结合序列发生突变时，miR-29a/b的调控作用消失[图8（b）]。有趣的是，Hnf4g在Lgr5high ISCs里表达比Lgr5 - 细胞低很多，但敲除Mir29ab1的Lgr5high ISCs中Hnf4g水平提升到与WT鼠的Lgr5 - 细胞相当[图8（c）]，说明miR-29a/b特异性调控Lgr5+ ISCs而非其他上皮细胞中的Hnf4g。接着，我们发现在人类的肠道组织样本中，HNF4G表达与MIR29A/B水平负相关[图8（d）和（e）]。在小鼠类器官中，敲除Mir29ab1会导致Hnf4γ表达水平的升高[附录A中图S7（b）]。同时，我们发现LS174T细胞中的HNF4G/HNF4γ在抑制miR-29a/b后上升[图8（f）；附录A中图S7（c）]。重要的是，作为一个转录因子，HNF4γ在抑制miR-29a/b后，在细胞核内的表达量上升[图8（g）和（h）]）。

值得注意的是，敲除Mir29ab1会上调辐照后第3天隐窝中Hnf4g/Hnf4γ的表达[图8（i）和（j）；附录A中图S7（d）和（e）]，而WT小鼠的Hnf4g在辐照后新生隐窝中的表达与未辐照的相比显著降低[图8（k）]，与miR-29a/b变化相反而与FAO相关酶的变化一致。这些结果暗示Hnf4γ可能与miR-29a/b介导的肠道再生及FAO在这个过程中的下降有关。

为了确认HNF4γ是否参与代谢调控ISCs，我们通过向LGR5+ LS174T细胞转染含HNF4G DNA的质粒来过表达HNF4G [附录A中图S7（f）]，发现FAO相关蛋白表达上调[图8（l）；附录A中图S7（g）]。我们发现过表达HNF4G提高LS174T细胞的线粒体基础呼吸及OXPHOS水平[图8（m）和（n）]，与抑制miR-29a/b的效果一致。最后，上调HNF4G与抑制miR-29a/b一样能够促进 LS174T细胞分化[图8（o）和（p）]。

为了明确靶向作用HNF4G是否足以应对ISCs中缺失miR-29a/b的影响，我们探究了敲低HNF4G是否消除抑制miR-29a/b的作用[附录A中图S7（j）]。抑制miR-29a/b引起的FAO相关蛋白表达上调在用HNF4G siRNA介导敲低后恢复正常水平[图8（q）]。类似地，抑制miR-29a/b引起的LS174T细胞OXPHOS相关线粒体呼吸水平变化在敲低HNF4G后也恢复正常[图8（r）和（s）]。另外，在用siRNA抑制HNF4G 表达后，抑制miR-29a/b也无法促进细胞分化[图8（t）和（u）]。综上所述，这些结果说明miR-29a/b在重塑代谢、干预ISCs干性方面的功能依赖于Hnf4g。

4 讨论

在不同生物过程中调控ISCs的自我更新与分化平衡，对于维持肠道健康至关重要。许多研究揭示了稳态下代谢对ISCs的调控，但是少有人关注代谢如何参与ISCs损伤后的快速回补及之后的组织修复过程。同时，在CRC治疗方面，传统的方法包括放疗、化疗及手术，而ISCs的代谢可塑性会导致肿瘤在放化疗后的复发。调控ISCs可塑性的有效靶点尚不清楚。另外，在衰老过程中，肠上皮的更新速率下降，再生能力受阻，从而增加了肠屏障损伤的风险并引起肠道功能的衰退。本研究中，我们发现ISCs介导的再生过程需要上调miR-29a/b，从而通过靶向作用Hnf4g抑制FAO介导的OXPHOS，这样的代谢变化能通过牺牲分化作用来促进ISCs的再生（图9）。这两种miRNA在腺瘤中的上调也与CRC患者的不良预后有关，可能导致放疗后的肿瘤再生。我们的结果表明了受损ISCs的代谢重编方式，并揭示了能够改善肠黏膜在疾病及衰老中修复、阻止肿瘤复发的潜在靶点。

4.1 MiR-29a/b是ISCs自我更新与分化平衡的开关

Lgr5+ ISCs驱动组织损伤后的肠上皮再生。然而，Lgr5+ ISCs的库存需要先被补充，因为它们对损伤的敏感性极高[30]，补充的库存来源于静息态ISCs和去分化的祖细胞或成熟的上皮细胞[31‒36]。这暗示我们，调控ISCs从分化向自我更新转变的开关对于再生非常关键。在本文中，我们发现缺失miR-29a/b会损害ISCs干性，即这会抑制自我更新、导致过度分化。ISCs向分化的转变可能与损伤后去分化作用的减弱有关，因此阻碍了肠上皮修复及Lgr5+细胞库存恢复。此外，基于对miR-29a/b在上皮修复过程中新生隐窝内表达上调的发现，我们推测上调的miR-29a/b能够通过驱动去分化作用提升ISCs的自我更新。

接着，我们想明确miR-29a/b如何导致这种平衡的变化。由于Lgr5+ ISCs细胞周期活跃，它们主要处于S期或G2/M期，它们持续的不对称分裂也维持着自我更新与分化间的平衡[37]。与之相反，G0/G1期细胞分裂的时间很长，容易最终进入分化。我们发现，缺失miR-29a/b会让更多隐窝细胞或LGR5+细胞处于G0/G1期，意味着更低的分裂速率和更高的分化概率，因此导致Lgr5+ ISCs的干性及迁移速率下降。然而，miR-29a/b如何调控细胞周期还不明确。研究表明，细胞周期进程与代谢调控有关[38‒39]，因此，细胞周期阻滞可能也与miR-29a/b介导的代谢重编相关。

4.2 短暂抑制FAO/OXPHOS轴促进 ISCs回补

由于调控ISCs命运的经典信号包括无翅型整合位点（WNT）、骨形态发生蛋白（BMP）和Notch [40‒43]都被排除（数据未展示），我们关注了代谢调控在miR-29a/b功能中的重要性。研究已报道ISCs分化与线粒体代谢紧密相关[5‒6]。在分化过程中，ISCs线粒体活性、mtDNA拷贝数和活性氧水平都会显著上升，因为OXPHOS驱动ISCs分化。另一方面，发现敲除ISCs中的丙酮酸载体1（Mpc1）能提升ISCs干性，而过表达Mpc1/Mpc2会获得相反的效果[44‒45]，与我们miR-29a/b缺失后OXPHOS提升、ISCs分化增加、干性损伤的结果一致。另外，前期研究显示，再生过程中Sox9-EGFPhigh/Lgr5low祖细胞会在辐照后修复中过度增殖，伴随OXPHOS相关基因表达降低，但线粒体实际的呼吸没有被检测[46]。包括我们结果在内的这些证据表明在以增殖为特征的肠上皮修复中，OXPHOS会受到抑制，从而促进上皮再生。综上所述，肠上皮损伤后上调miR-29a/b可能会抑制ISCs的OXPHOS水平，从而驱动增殖与去分化过程，实现肠上皮再生。

随着FAO在ISCs生物学中的功能吸引了越来越多关注，它在ISCs命运调控中的积极作用被慢慢揭示，但我们的工作挑战了之前的观点。Mihaylova等[8]发现长期敲除PPAR/Cpt1a，会慢性抑制FAO，从而损害ISC干性，表明FAO是ISCs生存和发挥功能所必需的。在HFD诱导肠道成瘤和禁食促进ISCs功能方面，PPAR/Cpt1a介导的FAO与ISCs干性提高有关[9]。然而，HFD和禁食都能通过FAO以外的途径调控ISCs。例如，HFD通过肠道菌群调控ISCs和免疫因子的互作[47]，禁食还能调控潘氏细胞和静息态ISCs [8,48]。此外，这两种饮食模式都能促进FAO下游的酮体合成，而酮体能够通过Notch通路促进ISCs自我更新、抑制分泌型细胞分化，而 OXPHOS的变化并没有被检测[49‒50]。在酮体合成途径被抑制时，辐照后的肠道修复会受阻，但此时，FAO的水平并不会改变，OXPHOS水平会上升。这些证据表明，FAO促进ISCs干性的前提是促进生酮作用，而不是促进OXPHOS，虽然生酮作用对ISCs的影响也存在争议[51‒52]。相反，敲除Mex3a会通过抑制PPAR通路损害Lgr5+ ISCs自我更新[53]，说明PPAR介导的FAO激活对ISCs再生会有负面效果。另外，通过敲除Hnf4a/g抑制FAO会损害干性，但是激活隐窝细胞增殖的暴发，这个过程线粒体耗氧率会下降[10]。Lgr5+ ISCs中特异性敲除驱动线粒体呼吸的转录因子Prdm16会抑制FAO和ISCs分化[11]。综上所述，抑制FAO从而限制ISCs的OXPHOS水平有利于上皮的增殖，不利于其分化。本研究中，我们没有检测到miR-29a/b能调控Notch通路，但OXPHOS水平会随着HNF4γ介导的FAO水平变化。我们还发现，激活FAO促进 LGR5+细胞分化，这与Prdm16介导的FAO水平在上肠道祖细胞比ISCs处更高相一致[11]。因此，我们推测抑制FAO介导的OXPHOS水平对于再生是必需的，能够抑制分化作用、增加ISCs数量。

4.3 MiR-29a/b特异性调控 ISCs中的 FAO/OXPHOS轴并参与再生过程

值得注意的是，ISCs和分化细胞的代谢模式是不同的[5]，因此同一因子对不同细胞的调控作用可能也是不同的[54‒55]。在我们的结果中，敲除Mir29ab1只特异地激活Lgr5+ ISCs中的FAO水平，而Lgr5-的分化细胞中，敲除没有效果，甚至对FAO相关基因有相反的作用，这说明miR-29a/b对于不同细胞类型的调控作用是有差异的。因此，对混合着Lgr5+和Lgr5-细胞的隐窝进行转录组测序没有显示出FAO途径的明确变化。而在辐照损伤后，新生的隐窝中，上调miR-29a/b会抑制FAO，因为这些隐窝中富集着Lgr5+细胞，而当缺失了miR-29a/b，ISCs就无法降低其FAO水平，导致再生能力的下降。这些结果强调了FAO驱动的OXPHOS在ISCs中的独特作用，因此能够促进上皮再生。

4.4 Hnf4γ的缺失是肠上皮损伤后修复所必需的

Hnf4γ是驱动肠上皮分化的主要因子，在分化的上皮细胞中富集[56]，这与我们发现Lgr5-细胞比ISCs的Hnf4γ表达高，以及过表达HNF4G促进LGR5+细胞分化的结果相一致。缺乏miR-29a/b的ISCs和分化细胞Hnf4g表达水平相似，说明了ISCs向分化细胞转化。Hnf4α和Hnf4γ属于同一家族，因此具有相似的功能。单独敲除Hnf4a或Hnf4g对ISCs稳态没有显著影响，因为另一个基因可以弥补被敲除基因的缺失。同时敲除Hnf4α和Hnf4γ这两种在分化细胞富集的类器官中表达更高的因子，会抑制FAO从而限制上皮分化、促进隐窝增殖[57]，这可能在肠上皮修复中发挥作用。关于Hnf4α，在结肠类器官中敲除Hnf4a1能够增加Lgr5表达并提高Lgr5high细胞数量[58]，表明抑制Hnf4α可促进ISCs干性。与之一致的是，我们发现单独干预Hnf4γ也足够促进干性，并且解析了其机制。此外，我们发现Hnf4g的下调会自然发生于损伤后增殖的新生隐窝，这种下调作用由miR-29a/b介导。然而，之前的研究显示，Hnf4α在辐照后再生的小肠类器官中表达上调[59]，暗示了Hnf4γ可能是在辐照后损伤修复中发挥主要作用，而 Hnf4α的上调是反馈作用导致。

5 结论与启示

总结而言，本研究对ISCs在再生过程中的代谢可塑性提供了全面的探究。研究发现暂时抑制FAO和OXPHOS水平对于ISCs的快速自我更新不可或缺，这也挑战了之前基于稳态和长期影响研究的观点。我们挖掘了miR-29a/b是在损伤状况下调控ISCs代谢可塑性的重要因子，靶向作用miR-29a/b或Hnf4γ有望用于治疗炎症性肠病、克罗恩病等疾病，或用于改善衰老的肠道更新，还有潜力用于防止肿瘤的愈后复发，但这需要更多的研究来证明。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用
[1]

Barker N, van Es JH, Kuipers J, Kujala P, van den Born M, Cozijnsen M, et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5 . Nature 2007;449(7165):1003‒7. . 10.1038/nature06196
[2]

Alonso S, Yilmaz OH. Nutritional regulation of intestinal stem cells. Annu Rev Nutr 2018;38:273‒301. . 10.1146/annurev-nutr-082117-051644
[3]

Gehart H, Clevers H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2019;16(1):19‒34. . 10.1038/s41575-018-0081-y
[4]

Chakrabarty RP, Chandel NS. Mitochondria as signaling organelles control mammalian stem cell fate. Cell Stem Cell 2021;28(3):394‒408. . 10.1016/j.stem.2021.02.011
[5]

Rodríguez-Colman MJ, Schewe M, Meerlo M, Stigter E, Gerrits J, Pras-Raves M, et al. Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function. Nature 2017;543(7645):424‒7. . 10.1038/nature21673
[6]

Ludikhuize MC, Meerlo M, Gallego MP, Xanthakis D, Burgaya Julià M, Bguyen TN, et al. Mitochondria define intestinal stem cell differentiation downstream of a FOXO/Notch Axis. Cell Metab 2020;32(5):889‒900. . 10.1016/j.cmet.2020.10.005
[7]

Wang D, Odle J, Liu YL. Metabolic regulation of intestinal stem cell homeostasis. Trends Cell Biol 2021;31(5):325‒7. . 10.1016/j.tcb.2021.02.001
[8]

Mihaylova MM, Cheng CW, Cao AQ, Tripathi S, Mana MD, Bauer-Rowe KE, et al. Fasting activates fatty acid oxidation to enhance intestinal stem cell function during homeostasis and aging. Cell Stem Cell 2018;22(5):769‒78. . 10.1016/j.stem.2018.04.001
[9]

Mana MD, Hussey AM, Tzouanas CN, Imada S, Barrera Millan Y, Bahceci D, et al. High-fat diet-activated fatty acid oxidation mediates intestinal stemness and tumorigenicity. Cell Rep 2021;35(10):109212. . 10.1016/j.celrep.2021.109212
[10]

Chen L, Vasoya RP, Toke NH, Parthasarathy A, Luo S, Chiles E, et al. HNF4 regulates fatty acid oxidation and is required for renewal of intestinal stem cells in mice. Gastroenterology 2020;158(4):985‒99. . 10.1053/j.gastro.2019.11.031
[11]

Stine RR, Sakers AP, TeSlaa T, Kissig M, Stine ZE, Kwon CW, et al. PRDM16 maintains homeostasis of the intestinal epithelium by controlling region-specific metabolism. Cell Stem Cell 2019;25(6):830‒45. . 10.1016/j.stem.2019.08.017
[12]

Gao YJ, Yan Y, Tripathi S, Pentinmikko N, Amaral A, Päivinen P, et al. LKB1 represses ATOH1 via PDK4 and energy metabolism and regulates intestinal stem cell fate. Gastroenterology 2020;158(5):1389‒401. . 10.1053/j.gastro.2019.12.033
[13]

Zipper L, Batchu S, Kaya NH, Antonello ZA, Reiff T. The microRNA miR-277 controls physiology and pathology of the adult drosophila midgut by regulating the expression of fatty acid beta-oxidation-related genes in intestinal stem cells. Metabolites 2022;12(4):315. . 10.3390/metabo12040315
[14]

Tian YH, Ma XH, Lv C, Sheng XL, Li X, Zhao R, et al. Stress responsive miR-31 is a major modulator of mouse intestinal stem cells during regeneration and tumorigenesis. eLife 2017;6:29538. . 10.7554/elife.29538
[15]

Tian YH, Xu JZ, Li Y, Zhao R, Du SJ, Lv C, et al. MicroRNA-31 reduces inflammatory signaling and promotes regeneration in colon epithelium, and delivery of mimics in microspheres reduces colitis in mice. Gastroenterology 2019;156(8):2281‒96. . 10.1053/j.gastro.2019.02.023
[16]

Wang XL, He Y, Mackowiak B, Gao B. MicroRNAs as regulators, biomarkers and therapeutic targets in liver diseases. Gut 2021;70(4):784‒95. . 10.1136/gutjnl-2020-322526
[17]

Kwon JJ, Factora TD, Dey S, Kota J. A systematic review of miR-29 in cancer. Mol Ther Oncolytics 2019;12:173‒94. . 10.1016/j.omto.2018.12.011
[18]

Lin HY, Wang FS, Yang YL, Huang YH. MicroRNA-29a suppresses CD36 to ameliorate high fat diet-induced steatohepatitis and liver fibrosis in mice. Cells 2019;8(10):1298. . 10.3390/cells8101298
[19]

Widlansky ME, Jensen DM, Wang JL, Liu Y, Geurts AM, Kriegel AJ, et al. MiR-29 contributes to normal endothelial function and can restore it in cardiometabolic disorders. EMBO Mol Med 2018;10(3):8046. . 10.15252/emmm.201708046
[20]

Brain O, Owens BMJ, Pichulik T, Allan P, Khatamzas E, Leslie A, et al. The intracellular sensor NOD2 induces microRNA-29 expression in human dendritic cells to limit iL-23 release. Immunity 2013;39(3):521‒36. . 10.1016/j.immuni.2013.08.035
[21]

Fukata T, Mizushima T, Nishimura J, Okuzaki D, Wu X, Hirose H, et al. The supercarbonate apatite-microRNA complex inhibits dextran sodium sulfate-induced colitis. Mol Ther Nucleic Acids 2018;12:658‒71. . 10.1016/j.omtn.2018.07.007
[22]

Dey S, Udari LM, RiveraHernandez P, Kwon JJ, Willis B, Easler JJ, et al. Loss of miR-29a/b1 promotes inflammation and fibrosis in acute pancreatitis. JCI Insight 2021;6(19):149539. . 10.1172/jci.insight.149539
[23]

Zhu YH, Wang W, Yuan TL, Fu LL, Zhou LA, Lin G, et al. MicroRNA-29a mediates the impairment of intestinal epithelial integrity induced by intrauterine growth restriction in pig. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2017;312(5): G434‒42. . 10.1152/ajpgi.00020.2017
[24]

Xiao L, Rao JN, Zou TT, Liu L, Cao S, Martindale JL, et al. MiR-29b represses intestinal mucosal growth by inhibiting translation of cyclin-dependent kinase 2. Mol Biol Cell 2013;24(19):3038‒46. . 10.1091/mbc.e13-05-0287
[25]

Ouyang M, Su WJ, Xiao L, Rao JN, Jiang LP, Li Y, et al. Modulation by miR-29b of intestinal epithelium homoeostasis through the repression of menin translation. Biochem J 2015;465(2):315‒23. . 10.1042/bj20141028
[26]

Li YW, Chen G, Wang JY, Zou TT, Liu L, Xiao L, et al. Post-transcriptional regulation of Wnt co-receptor LRP6 and RNA-binding protein HuR by miR-29b in intestinal epithelial cells. Biochem J 2016;473(11):1641‒9. . 10.1042/bcj20160057
[27]

Lin YY, Lu Y, Huang ZY, Wang YQ, Song SJ, Luo Y, et al. Milk-derived small extracellular vesicles promote recovery of intestinal damage by accelerating intestinal stem cell-mediated epithelial regeneration. Mol Nutr Food Res 2022;66(11):2100551. . 10.1002/mnfr.202100551
[28]

Sato T, Vries RG, Snippert HJ, van de Wetering M, Barker N, Stange DE, et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature 2009;459(7244):262‒5. . 10.1038/nature07935
[29]

Ludikhuize MC, Meerlo M, Burgering BMT, Rodríguez Colman MJ. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using seahorse. STAR Protocols. 2021;2(1):100386. . 10.1016/j.xpro.2021.100386
[30]

Ayyaz A, Kumar S, Sangiorgi B, Ghoshal B, Gosio J, Ouladan S, et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature 2019;569(7754):121‒5. . 10.1038/s41586-019-1154-y
[31]

Bankaitis ED, Ha A, Kuo CJ, Magness ST. Reserve stem cells in intestinal homeostasis and injury. Gastroenterology 2018;155(5):1348‒61. . 10.1053/j.gastro.2018.08.016
[32]

Murata K, Jadhav U, Madha S, van Es J, Dean J, Cavazza A, et al. Ascl2-dependent cell dedifferentiation drives regeneration of ablated intestinal stem cells. Cell Stem Cell 2020;26(3):377‒90. . 10.1016/j.stem.2019.12.011
[33]

Buczacki SJA, Zecchini HI, Nicholson AM, Russell R, Vermeulen L, Kemp R, et al. Intestinal label-retaining cells are secretory precursors expressing Lgr5 . Nature 2013;495(7439):65‒9. . 10.1038/nature11965
[34]

de Sousae MF, de Sauvage FJ. Cellular plasticity in intestinal homeostasis and disease. Cell Stem Cell 2019;24(1):54‒64. . 10.1016/j.stem.2018.11.019
[35]

van Es JH, Sato T, van de Wetering M, Lyubimova A, Yee Nee AN, Gregorieff A, et al. Dll1(+‍) secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nat Cell Biol 2012;14(10):1099‒104. . 10.1038/ncb2581
[36]

Yan KS, Gevaert O, Zheng GXY, Anchang B, Probert CS, Larkin KA, et al. Intestinal enteroendocrine lineage cells possess homeostatic and injury-inducible stem cell activity. Cell Stem Cell 2017;21(1):78‒90. . 10.1016/j.stem.2017.06.014
[37]

Calibasi-Kocal G, Mashinchian O, Basbinar Y, Ellidokuz E, Cheng CW, Yilmaz ÖH. Nutritional control of intestinal stem cells in homeostasis and tumorigenesis. Trends Endocrinol Metab 2021;32(1):20‒35. . 10.1016/j.tem.2020.11.003
[38]

Kalucka J, Missiaen R, Georgiadou M, Schoors S, Lange C, De Bock K, et al. Metabolic control of the cell cycle. Cell Cycle 2015;14(21):3379‒88. . 10.1080/15384101.2015.1090068
[39]

Roy D, Sheng GY, Herve S, Carvalho E, Mahanty A, Yuan S, et al. Interplay between cancer cell cycle and metabolism: challenges, targets and therapeutic opportunities. Biomed Pharmacother 2017;89:288‒96. . 10.1016/j.biopha.2017.01.019
[40]

Nusse R, Clevers H. Wnt/β‍-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell 2017;169(6):985‒99. . 10.1016/j.cell.2017.05.016
[41]

Van Es JH, van Gijn ME, Riccio O, van den Born M, Vooijs M, Begthel H, et al. Notch/gamma-secretase inhibition turns proliferative cells in intestinal crypts and adenomas into goblet cells. Nature 2005;435 (7044):959‒63. . 10.1038/nature03659
[42]

Pellegrinet L, Rodilla V, Liu ZY, Chen SA, Koch U, Espinosa L, et al. Dll1- and Dll4-mediated notch signaling are required for homeostasis of intestinal stem cells. Gastroenterology 2011;140(4):1230‒40. . 10.1053/j.gastro.2011.01.005
[43]

VanDussen KL, Carulli AJ, Keeley TM, Patel SR, Puthoff BJ, Magness ST, et al. Notch signaling modulates proliferation and differentiation of intestinal crypt base columnar stem cells. Development 2012;139 (3):488‒97. . 10.1242/dev.070763
[44]

Schell JC, Wisidagama DR, Bensard C, Zhao HL, Wei P, Tanner J, et al. Control of intestinal stem cell function and proliferation by mitochondrial pyruvate metabolism. Nat Cell Biol 2017;19(9):1027‒36. . 10.1038/ncb3593
[45]

Bensard CL, Wisidagama DR, Olson KA, Berg JA, Krah NM, Schell JC, et al. Regulation of tumor initiation by the mitochondrial pyruvate carrier. Cell Metab 2020;31(2):284‒300. . 10.1016/j.cmet.2019.11.002
[46]

van Landeghem L, Santoro MA, Krebs AE, Mah AT, Dehmer JJ, Gracz AD, et al. Activation of two distinct Sox9-EGFP-expressing intestinal stem cell populations during crypt regeneration after irradiation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2012;302(10):G1111‒32. . 10.1152/ajpgi.00519.2011
[47]

Beyaz S, Chung CR, Mou HW, Bauer-Rowe KE, Xifaras ME, Egin I, et al. Dietary suppression of MHC class II expression in intestinal epithelial cells enhances intestinal tumorigenesis. Cell Stem Cell 2021;28:1922‒35. . 10.1016/j.stem.2021.08.007
[48]

Richmond CA, Shah MS, Deary LT, Trotier DC, Thomas H, Ambruzs DM, et al. Dormant intestinal stem cells are regulated by PTEN and nutritional status. Cell Rep 2015;13(11):2403‒11. . 10.1016/j.celrep.2015.11.035
[49]

Cheng CW, Biton M, Haber AL, Gunduz N, Eng G, Gaynor LT, et al. Ketone body signaling mediates intestinal stem cell homeostasis and adaptation to diet. Cell 2019;178(5):1115‒31. . 10.1016/j.cell.2019.07.048
[50]

Gebert N, Cheng CW, Kirkpatrick JM, Di Fraia D, Yun JN, Schädel P, et al. Region-specific proteome changes of the intestinal epithelium during aging and dietary restriction. Cell Rep 2020;31(4):107565. . 10.1016/j.celrep.2020.107565
[51]

Wang QD, Zhou YN, Rychahou P, Fan TWM, Lane AN, Weiss HL, et al. Ketogenesis contributes to intestinal cell differentiation. Cell Death Differ 2017;24(3):458‒68. . 10.1038/cdd.2016.142
[52]

Dmitrieva-Posocco O, Wong AC, Lundgren P, Golos AM, Descamps HC, Dohnalová L, et al. β‍-hydroxybutyrate suppresses colorectal cancer. Nature 2022;605(7908):160‒5. . 10.1038/s41586-022-04649-6
[53]

Pereira B, Amaral AL, Dias A, Mendes N, Muncan V, Silva AR, et al. MEX3A regulates Lgr5(+‍) stem cell maintenance in the developing intestinal epithelium. EMBO Rep 2020;21(4):48938. . 10.15252/embr.201948938
[54]

Yilmaz OH, Katajisto P, Lamming DW, Gultekin Y, Bauer-Rowe KE, Sengupta S, et al. mTORC1 in the paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature 2012;486(7404):490‒5. . 10.1038/nature11163
[55]

Igarashi M, Guarente L. mTORC1 and SIRT1 cooperate to foster expansion of gut adult stem cells during calorie restriction. Cell 2016;166(2):436‒50. . 10.1016/j.cell.2016.05.044
[56]

Lindeboom RGH, van Voorthuijsen L, Oost KC, Rodriguez-Colman MJ, Luna-Velez MV, Furlan C, et al. Integrative multi-omics analysis of intestinal organoid differentiation. Mol Syst Biol 2018;14(6):8227. . 10.15252/msb.20188227
[57]

Chen L, Toke NH, Luo S, Vasoya RP, Fullem RL, Parthasarathy A, et al. A reinforcing HNF4-SMAD4 feed-forward module stabilizes enterocyte identity. Nat Genet 2019;51(5):777‒85. . 10.1038/s41588-019-0384-0
[58]

Shin JH, Jeong J, Choi J, Lim J, Dinesh RK, Braverman J, et al. Dickkopf-2 regulates the stem cell marker LGR5 in colorectal cancer via HNF4 alpha 1. iScience 2021;24(5):102411. . 10.1016/j.isci.2021.102411
[59]

Montenegro-Miranda PS, van der Meer JHM, Jones C, Meisner S, Vermeulen JLM, Koster J, et al. A novel organoid model of damage and repair identifies HNF4 alpha as a critical regulator of intestinal epithelial regeneration. Cell Mol Gastroenterol Hepatol 2020;10 (2):209‒23. . 10.1016/j.jcmgh.2020.02.007
AI Summary AI Mindmap
PDF (14887KB)

Supplementary files

2024-42-11-S39

3675

访问

0

被引

详细
导航
相关文章

AI思维导图

/

〈 〉