氨基酸转运蛋白LAT2的减少导致衰老过程中蛋白质利用受损

工程（英文） ›› 2024, Vol. 42 ›› Issue (11) : 95 -106. DOI: 10.1016/j.eng.2024.08.009

研究论文

宋蕊 ^a ,
李光 ^b ,
赵亮 ^a ,
仇莉丽 ^a ,
秦锡雨 ^a ,
张晓旭 ^a ,
刘晓雪 ^a ,
周君 ^a ,
胡萌晓 ^a ,
张力圩 ^a ,
苏佳琪 ^c ,
刘心娟 ^b ,
王晓玉 ^a^,^*

作者信息 +

Decreased Amino Acid Transporter LAT2 Is the Main Determinant of Impaired Protein Utilization During Aging

Rui Song ^a^,^# ,
Guang Li ^b^,^# ,
Liang Zhao ^a^,^# ,
Lili Qiu ^a ,
Xiyu Qin ^a ,
Xiaoxu Zhang ^a ,
Xiaoxue Liu ^a ,
Jun Zhou ^a ,
Mengxiao Hu ^a ,
Liwei Zhang ^a ,
Jiaqi Su ^c ,
Xinjuan Liu ^b ,
Xiaoyu Wang ^a^,^*

Author information +

文章历史 +

Received	Accepted	Published
2024-03-31	2024-08-13
Issue Date
2024-08-13

PDF (8332K)

摘要

随着全球人口老龄化加剧，明确老年人蛋白质利用效率变得愈发重要。本文探究了蛋白质摄入与衰老之间的复杂联系，并重点关注老年人的精准营养需求。首先，本研究通过meta分析证实了老年人蛋白质利用效率下降，并明确了对植物与动物蛋白质的利用率存在差异。利用衰老小鼠模型研究发现，老年小鼠对酪蛋白、牛肉蛋白、大豆蛋白和谷蛋白的生物利用率均下降，其中酪蛋白的利用率下降最为显著。因此，后续重点研究衰老对酪蛋白消化吸收的影响。通过肽组学和胃蛋白酶水平检测等，发现老年小鼠胃的消化功能下降，然而这对衰老过程中整体蛋白质消化的影响不显著。进一步应用靶向氨基酸代谢组学，确认了老年小鼠中支链氨基酸（BCAAs）的吸收显著减少，表明氨基酸的吸收异常可能是衰老过程中蛋白质利用率下降的潜在原因。因此，进一步对肠道上皮细胞进行蛋白质组学分析，结果显示在老年人和老年小鼠中，大型中性氨基酸转运蛋白2（LAT2）的表达量减少了约60%，表明LAT2的减少可能是导致BCAAs利用率降低的关键因素。综上所述，本研究明确了LAT2介导的氨基酸吸收途径在衰老过程中对蛋白质利用的重要意义，为老年人蛋白质的高效利用提供新的理论依据。

Abstract

As the global demographic shifts toward an aging population, understanding the efficiency of protein utilization in older adults becomes crucial. Our study explores the intricate relationship between protein intake and aging, with a focus on precision nutrition for older people. Through a meta-analysis, we confirm a decline in protein-utilization capacity in older individuals and examine the different contributions of plant and animal protein. In experiments involving mice of different ages, older mice exhibited decreases in the biological utilization of four proteins (casein, beef protein, soy protein, and gluten), particularly casein. In subsequent research, casein was studied as a key protein. A decline in gastric digestion function was observed through peptidomics and the examination of pepsin levels using casein. Nevertheless, this decline did not significantly affect the overall protein digestion during the aging process. The combined application of targeted amino acid metabolomics identified abnormal absorption of amino acids as the underlying cause of decreased protein utilization during aging, particularly emphasizing a reduction in branched-chain amino acids (BCAAs) in older mice. Delving deeper into the proteomics of the intestinal protein digestion and absorption pathway, a reduction of over 60% in large neutral amino acid transporter 2 (LAT2) protein expression was observed in both older humans and aged mice. The reduction in LAT2 protein was found to be a key factor influencing the diminished BCAA availability. Overall, our study establishes the significance of amino acid absorption through LAT2 in protein utilization during aging and offers a new theoretical foundation for improving protein utilization in the older adults.

关键词

衰老 / 蛋白质利用 / 多肽 / 氨基酸 / 大型中性氨基酸转运蛋白2

Key words

Aging / Protein utilization / Peptide / Amino acid / Large neutral amino acid transporter 2

引用本文

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宋蕊,李光,赵亮,仇莉丽,秦锡雨,张晓旭,刘晓雪,周君,胡萌晓,张力圩,苏佳琪,刘心娟,王晓玉. 氨基酸转运蛋白LAT2的减少导致衰老过程中蛋白质利用受损[J]. 工程（英文）, 2024, 42(11): 95-106 DOI:10.1016/j.eng.2024.08.009

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1 引言

目前，世界人口老龄化不断加剧，预计到2050年60岁以上人口将达到21亿，约占总人口的22% [1]。长期以来，蛋白质一直是老年人营养与健康相关研究的焦点[2]。然而，大约5%~10%的社区老年人患有蛋白质-热量营养不良症[3]，这可能导致少肌症[4]、免疫系统减弱[5]以及发病率和死亡率增加[6]。研究[7‒8]表明，在衰老过程中，机体氨基酸水平显著下降，尤其是支链氨基酸（BCAAs）。而特定氨基酸的缺乏被认为是许多与老年人蛋白质缺乏相关疾病的主要危险因素[9]。因此，需要立即关注并解决老年人氨基酸失衡。

目前的膳食指南强调增加蛋白质摄入从而解决蛋白质缺乏的问题，但往往忽视了老年人体内氨基酸转运的重要性[10]。蛋白质的来源主要分为动物和植物两类，动物蛋白因其高质量和丰富的支链氨基酸而被广泛推荐。然而，研究[11‒12]表明，由于胃肠道功能下降，老年人的氨基酸利用率下降。此外，有关老年人植物蛋白补充剂的研究正在不断增加。目前大多数研究发现，对成年人来说，植物蛋白消化率低于动物蛋白[13]。但是，对于老年人而言，不同膳食蛋白质来源（即植物蛋白或动物蛋白）的利用效率仍有待阐明。此外，氨基酸也可以直接进行补充。然而，过量补充氨基酸会导致食欲过剩和寿命缩短，高水平的支链氨基酸摄入可能导致胰岛素抵抗和肥胖[2]。因此，单纯通过饮食增加蛋白质或氨基酸的摄入可能无法有效解决老年人氨基酸失衡问题。

在胃肠道中，蛋白质最初被分解成多肽和氨基酸，然后通过氨基酸转运体（AATs）被吸收到血液中。衰老过程中胃肠道酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）的变化表明，老年人肽和氨基酸的释放规律可能与年轻人不同[14‒15]。然而，目前衰老过程中胃肠道消化产物的变化规律仍有待阐明。最近的研究[16‒17]提出了一种通过肽组学监测膳食蛋白质消化模式的新方法，该技术已应用于衰老相关的体外研究。然而，对老龄动物体内蛋白质消化产物的检测仍是空白。氨基酸释放随后进入体循环的过程，可能会随着年龄的增长而改变。多项研究[18‒19]表明，老年人的氨基酸吸收动力学发生改变，且支链氨基酸循环水平较低。氨基酸转运体可以调节氨基酸在肠道中的吸收和在不同组织中的利用[20]。然而，最近的研究更多是关注氨基酸在肌肉中的利用，很少关注肠道氨基酸转运体对氨基酸吸收的作用。不过有间接证据表明，衰老可能导致肠道氨基酸转运体的变化。Dickinson等[21]发现运动后摄入必需氨基酸会增强年轻人肌肉氨基酸转运体的表达，而对老年人的影响不显著，这表明衰老可能会导致肠道中氨基酸转运体变化，使氨基酸运输效率降低。因此，老年人肽和氨基酸释放和转运过程中的关键变化亟待阐明，以改善氨基酸缺乏症并提高蛋白质利用率。

为了解决这些问题，我们比较了衰老过程中的动物和植物蛋白的利用情况。我们发现，随着年龄的增长，动物蛋白，尤其是酪蛋白的消化率下降最为明显。因此，后续将酪蛋白作为关键蛋白进一步研究，我们发现氨基酸的吸收在蛋白质利用的过程中起着至关重要的作用，食糜和餐后血浆氨基酸水平的肽谱的变化证明了这一结论。此外，对十二指肠上皮细胞的蛋白质组学分析发现，大型中性氨基酸转运蛋白2（LAT2）的表达随着年龄的增长显著降低，这一结果在小鼠和人类的肠上皮中都得到证实。LAT2的下调影响大型中性氨基酸（尤其是支链氨基酸）的吸收效率。

2 材料与方法

2.1 Meta分析

在PubMed数据库中检索相关文献，检索词采用医学主题词（MeSH）与自由词相结合的形式来制定，检索词为 ("animal proteins, dietary" [MeSH] OR "plant proteins, dietary" [MeSH]) AND ("absorption" [MeSH] OR "digestion" [MeSH] OR "metabolism" [MeSH])，由两名人员独立检索，检索结果限制在2019年1月至2024年1月的英语出版物中，纳入的研究均为随机对照人群试验。本研究共通过电子数据库检索得到1072篇相关文献，排除不符合纳入标准的研究后，最终纳入11篇有用文献。统计分析的结局指标是饮食前后血液氨基酸的最大变化之间的差异。采用标准化平均差（SMD）方法对数据进行分析，通过效应分析计算95%置信区间（CI）。

2.2 饲粮准备

参照美国营养学会AIN-93G饲料配方[22]，在保证总蛋白含量一致的情况下，分别使用酪蛋白、牛肉蛋白、大豆蛋白、谷蛋白制备蛋白质含量为20%的高蛋白饲料，保持各配方饲料能量一致。附录A表S1提供了实验饲粮的详细组成（SYSE）。饲粮总氮使用全自动凯氏定氮分析仪测定（Sonnen），氮换算为蛋白质的系数采用6.25计算[23]。

2.3 动物与实验设计

本实验使用2~4月龄（青年组，YM）、12~14月龄（中年组，MM）和24~26月龄（老年组，OM）的SPF级雄性C57BL/6J小鼠，以12 h∶12 h的光/暗周期饲养在特定的无菌环境中。本研究符合动物福利标准并通过了中国农业大学实验动物福利与动物实验伦理委员会的认证，合格证号：AW52104202-4-1。

2.3.1 动物研究1

将3个不同年龄组（YM、MM和OM）的小鼠随机分为4组（每组6只）：酪蛋白组、牛肉蛋白组、大豆蛋白组和谷蛋白组。每组饲粮中蛋白质含量为20%，且指定的蛋白质来源为唯一的蛋白质供应来源。小鼠可以随意获取食物和水。经过一周的适应期后，将它们从正常鼠笼转移到代谢笼中收集粪便。通过检测粪便中蛋白质水平，选择衰老小鼠体内利用率最低的蛋白质进行后续研究。

2.3.2 动物研究2

随着年龄的增长，酪蛋白的消化率下降最为明显，因此后续的研究关注酪蛋白的消化吸收。小鼠禁食过夜16 h，第二天早晨灌胃酪蛋白纯化饲粮。灌胃后2 h后（蛋白质可在此期间完成全肠道消化；数据未显示），小鼠通过CO₂安乐死并收集血液、肠道和食糜样本。用镊子从胃和小肠的顶部到底部轻轻刮取食糜，并将其放入管中。如前所述[24]分离肠细胞，将十二指肠黏膜表面朝外穿在一根棒上，用预冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤，在乙二胺四乙酸（EDTA）缓冲液中孵育3 min，然后摩擦棒以分离和收集肠上皮细胞，将细胞储存在-80 ℃。

2.4 蛋白质消化率测定

按之前的方法[25]采集粪便样本和测定全肠道表观消化率（ATTD）。将小鼠单独饲养特制的在不锈钢代谢笼中，允许小鼠自由排便，排便时通过笼子底部的大小便分离漏网将尿液与粪便分开。小鼠在10天内自由饮食和饮水，其中最初的4天为适应期；第5~8天，记录24 h内小鼠的摄食量，并收集小鼠的总粪便用于测定营养素表观消化率。第9~10天，通过轻轻按摩小鼠的下腹收集新鲜粪便样本，然后立即存放在-80 ℃。

2.5 氨基酸测定

为制备粪便样品，首先需要将颗粒状的新鲜粪便加水、均质、冷冻干燥转化为粉末。接下来，将10 mg的粉末状粪便样品与500 μL的水混合，涡旋并离心。然后收集所得上清液并冷冻干燥。同样，对于20 μL的血浆样品，加入80 μL的预冷甲醇沉淀蛋白质，然后在相同的条件下离心和冷冻干燥。

氨基酸分析采用UPLC-TripleTOF 7600 （AB SCIEX, USA）。色谱分离使用45 ℃的BEN Admin柱（2.1 mm × 100 mm, 1.7 μL, Waters, USA）。流动相A为含20 mmol·L^-1乙酸铵和0.5%甲酸的水，流动相B为含相同添加剂的乙腈/水（85∶15, V/V）。流动相梯度从15% B开始，持续10 min，然后转变为100% B，持续4 min，0.1 min后回升到15% B，平衡2.9 min。流速为0.3 mL∙min^-1，进样量为5 μL。数据采集以多反应监测（MRM）模式进行，20种氨基酸的离子扫描参数和机器参数汇总在附录A的表S2中。所有数据采集和分析均在SCIEX OS（AB SCIEX, USA）上进行。

2.6 肽组学分析

从胃和回肠收集的食糜肽组学样品的制备方法按照先前描述的方法[26]进行。NanoLC的分离采用nanoAcquity纳米高效液相色谱（HPLC）系统（Waters, USA）。捕集柱为Acclaim PepMap 100（75 μm × 2 mm, C18, 3 μm; Thermo Fisher Scientific, USA）。分析柱为自制的装置，由100 μm内径（ID）熔融石英毛细管（Polymicro, USA）填充20 cm的C18固定相（Aqua 3 μm C18 125A; Phenomenex, USA）组成。流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脱，从1%流动相B开始，在65 min内线性增加到35%流动相B。采用Q-Exactive高分辨率质谱仪（Thermo Fisher Scientific）进行纳米电喷雾电离-质谱分析（ESI-MS），质谱（MS）扫描分辨率为70000，串联质谱（MS/MS）扫描分辨率为17500，采用前10名的MS/MS选择。肽的指纹图谱使用Peptigram进行蛋白质的肽序列比对分析[27]，肽切割预测位点使用EnzymePredictor工具进行预测[28]。

2.7 pH和消化酶活性测定

将胃和空肠切开一个小口，然后使用酸度计（Yanlin Laboratories）测量食糜的pH值[29]。对于酶活性测试，食糜样品根据胃蛋白酶试剂盒（Solarbio）和胰蛋白酶试剂盒（Abcam, UK）提供的说明进行处理。

2.8 体外消化

胃肠消化模拟参照INFOGEST官方的静态体外消化模型[30]，设计了四种体外模型来探索不同胃肠道条件下老年人蛋白质消化能力的变化，包括以健康成年人标准为正常消化组（Adult, AD），以及模拟随年龄增长而常见的累积变化的三种模型：胃功能下降的老年消化组（Older 1, O1），肠功能下降的老年消化组（Older 2, O2），以及胃肠功能均下降的老年消化组（Older 3, O3）。具体条件详见附录A表S3。酪蛋白的水解度（DH）采用如前所述[31]的邻苯二甲醛法测定。剩余样品冷冻干燥后，使用扫描电镜（SEM; Zeiss, Germany）在5.00 kV的加速电压下，以×1000的放大倍率拍摄进行显微结构分析。

2.9 蛋白质组学分析

蛋白质组学分析的程序遵循先前描述的方法[32]。简而言之，从YM、MM和OM组（每组n = 3）的十二指肠上皮样品中提取蛋白质，并使用过滤辅助样品制备程序进行消化。随后，使用捕获离子迁移率光谱飞行时间质谱（Bruker, Germany）进行数据依赖采集（DDA）质谱分析。然后利用数据独立采集模式（Applied Protein Technology）通过液相色谱-质谱法分析肽。使用Spectronaut 14.4.200727.47784软件（Biognosys, USA）中的快速全序列（FASTA）数据库建立DDA库。使用相同的软件和谱库进行数据独立采集和数据分析。十二指肠上皮蛋白质组学数据用于随后的生物信息学分析。采用Cluster 3.0和Java Treeview软件进行分层聚类分析。鉴定的蛋白以p值（p）< 0.05和|log₂倍数变化|（|log₂FC|）> 1为显著变化标准进行比较；然后使用京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库将它们映射到路径上。各组之间蛋白质含量的差异以热图的形式呈现。采用Fisher精确检验进行富集分析，p < 0.05为有显著性。

2.10 志愿者及临床标本

所有志愿者均为来自首都医科大学附属北京朝阳医院的男性。根据他们的人口学和临床特征，志愿者被分为年轻人组[YP；(34 ± 1)岁]、中年人组[MP；(47 ± 1)岁]和老年人组[OP；(63 ± 2)岁]。在提供知情同意后，志愿者在胃镜检查期间接受了远端十二指肠活检。使用夹在内窥镜尖端的钳从十二指肠黏膜收集三份活检样本，其中两份立即冷冻保存在-80 ℃，第三份用10%福尔马林固定后石蜡包埋。实验方案及临床标本采集经首都医科大学北京朝阳医院临床研究管理委员会（LGH-2024-FEI-15）和中国农业大学人类研究伦理委员会（CAUHR-20240103）批准。

2.11 免疫印迹分析

按照如前所述[33]的标准方法进行免疫印迹分析。从十二指肠组织中提取蛋白质裂解物，定量并在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶上分离。将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上，封闭1 h。然后使用β-actin抗体（1∶1000；#4970, Cell Signaling Technology, USA）或LAT2抗体（1∶500, #MG120503, Abmart）4 ℃孵育过夜。使用含有吐温20的tris缓冲生理盐水（TBST）洗涤三次后，用辣根过氧化物酶（HRP）联抗兔IgG（1∶5000；#A0208, Beyotime）或抗小鼠IgG（1∶5000；#A0216, Beyotime），并进行增强化学发光（Cytiva, USA）

2.12 免疫荧光

按照如前所述[34]的标准方案进行免疫荧光检测。新鲜的人体组织被固定、脱水、包埋、切片、脱蜡。用tris-EDTA缓冲液（pH = 9.0）进行热介导抗原修复。排除内源性过氧化物酶，使用1% Triton-X 100处理切片，封闭1 h。随后，用抗LAT2小鼠单克隆抗体（1∶50; # m04381, BOSTER, USA）在4 ℃下孵育切片。经山羊抗小鼠IgG H&L（1∶500, #ab150113；Abcam, UK）和4',6-二咪基-2-苯基吲哚（DAPI; Beyotime）孵育后，在共聚焦显微镜（Zeiss, Germany）下观察切片。

2.13 统计分析

用SPSS Statistic 26.0（IBM, USA）进行统计学分析，显著性水平设为p < 0.05，结果展示时使用*、**和***表示为p < 0.05、p < 0.01和p < 0.001。方差齐性检验完成后，采用单因素方差分析（ANOVA）比较各指标均值的差异，然后用最小显著性差异（LSD）事后检验比较组间差异。使用GraphPad Prism 8.4.3（GraphPad Software, USA）进行统计图的绘制，数据以均值±标准误差（mean ± sem）表示。

3 结果

3.1 年龄和蛋白质来源都会影响餐后氨基酸水平

为了探究年龄对餐后血液氨基酸吸收效率的影响，我们对过去五年内发表的研究蛋白质摄入后血液氨基酸水平的文章进行了meta分析。该分析显示，年轻人补充蛋白质后表现为正向吸收效率，使健康年轻人餐后氨基酸水平增加[图1（a）]。值得注意的是，老年人同样表现为正向吸收效率，尽管与年轻人相比程度略低[图1（b）]。在人体消化和吸收过程中，摄入动物蛋白后，血液氨基酸吸收增量更明显，表明摄入动物蛋白后血液氨基酸吸收效率更高[图1（c）和（d）]。

3.2 小鼠的全肠道蛋白质生物利用度在衰老过程中降低

由于meta分析强调了动物和植物蛋白质消耗之间的生物利用度差异，因此我们使用衰老小鼠模型来探索衰老过程中不同蛋白质的利用。结果表明，小鼠体内酪蛋白、牛肉蛋白、大豆蛋白和谷蛋白的生物利用度随年龄增长而降低。对比青年组和老年组，酪蛋白的消化吸收能力随年龄下降趋势最为显著，达到5.4%；其次为牛肉蛋白，下降趋势为3.1%；大豆蛋白的下降趋势为2.7%；而谷蛋白的消化吸收能力下降趋势最小，仅为1.7%，且无显著性差异。动物蛋白的ATTD在青年至中年间已经出现下降趋势，而植物蛋白要么变化很小，要么保持稳定[图2（b）；附录A表S4]。由于ATTD测量的是蛋白质水平，因此需要进一步分析粪便中的肽水平。结果表明，不同年龄的小鼠蛋白质消化后粪便肽组成是一致的[图2（c）]，但肽段信号强度不同，特别是750~1250 kDa之间的肽，其信号强度随着时间的推移而增加[图2（d）]。与植物蛋白相比，动物蛋白在衰老过程中具有更高的肽段信号强度和分子量。对氨基酸谱的分析显示，摄入动物蛋白后粪便总氨基酸组成在不同年龄段间呈现明显分离[图2（e）]，而摄入四种蛋白质后粪便氨基酸排出量均呈现上升趋势[图2（f）]，表明老年小鼠氨基酸吸收不良，尤其是对酪蛋白。根据上述结果，ATTD下降，而粪便中多肽和氨基酸含量增加，这表明随着年龄增长，机体对蛋白质的利用效率降低。

3.3 衰老过程中肽和氨基酸释放的变化规律

由于衰老过程中酪蛋白的生物利用度发生了显著变化，因此我们进一步对酪蛋白消化吸收下降的原因进行了研究。为了更准确地探究增龄过程中胃肠道内肽的释放规律，本研究通过肽组学测定了胃肠道内容物中的酪蛋白肽序列，其中胃和回肠内容物分别标志着消化过程的开始和结束。通过Peptigram工具鉴定和绘制肽指纹图谱来对蛋白质进行定性分析。胃部（CG）食糜中β-、αs₁-、αs₂-和κ-酪蛋白衍生的肽见图3（a）和附录A图S1（a）~（c），回肠（CI）食糜的肽见图3（b）和附录A图S1（d）~（f）。为了探究了胃食糜中的胃蛋白酶和肠食糜中的胰蛋白酶的酶切位点变化，本研究采用EnzymePredictor对酶切位点进行预测评分（附录A表S5），结果表明增龄过程中酶切位点变化不显著。然而，离子强度在不同年龄组之间有所不同。在胃中，中年组中β-酪蛋白的208-224区域[图3（a）]，αs₁-酪蛋白的180-187区域[图S1（a）]和κ-酪蛋白的38-50区域[图S1（c）]，以及青年组中αs₂-酪蛋白的103-109区域[图S1（b）]的肽段信号强度较高，这表明年轻小鼠的消化能力更好。相反，在回肠中，老年组β-酪蛋白的95-103区域[图3（b）]、αs₁-酪蛋白的40-46区域[图S1（d）]、αs₂-酪蛋白的129-138区域[图S1（e）]和κ-酪蛋白的100-107区域[图S1（f）]肽段信号强度较高，表明在肠道消化结束后，一些肽段在老年小鼠中仍然未被充分消化为氨基酸。

此外，我们还测定了食糜中关键蛋白质消化酶胃蛋白酶和胰蛋白酶的活性。与年轻小鼠相比，老年小鼠胃蛋白酶活性降低60% [图3（c）]，而胰蛋白酶的活力没有发生显著变化[图3（e）]。胃和空肠食糜的pH值保持不变，表明pH不是导致增龄过程中肽释放差异的因素[图3（d）和（f）]。为了探究胃蛋白酶和胰蛋白酶在消化过程中发挥的作用及对整体消化程度的影响，本文根据体内酶活力测定结果设计了符合增龄特性的静态体外消化模型，并测定DH [图3（h）]。结果显示，DH随着消化时间延长逐渐上升。然而在胃蛋白酶活性减少60%后，O1组和O3组的DH曲线在整个胃消化过程中均低于胃蛋白酶正常组别（AD组）。然而，胰蛋白酶的添加弥补了这种减少，使O1组的肠道DH水平恢复到与AD组相当的水平。相反，在肠消化终点，O2组的肠道DH值低于AD组，这表明胰蛋白酶在消化过程中发挥了重要作用。扫描电镜图像进一步直观地说明了酪蛋白体外消化后的结构变化。结果表明，酪蛋白颗粒的初始结构为不规则的多面体颗粒，在所有组中大小一致[图3（i）]。在AD组和O2组中，胃蛋白酶水解后酪蛋白颗粒破裂，表面出现线条状或网状裂纹，而其他组别中，酪蛋白结构变化较小，仍然保持较完整的颗粒结构，仅在边缘位置出现较浅的裂纹[图3（j）]。胰蛋白酶消化后，酪蛋白颗粒结构发生显著变化，其多面体结构消失，被不规则层状网络结构所替代[图3（k）]，其中AD和O1组的颗粒完全消失，结构破碎，层状排列的网络孔隙相对较大且深度较深，表明比胰蛋白酶活性降低的组有更深的消化。尽管胃消化终点存在差异，加入相似浓度的胰蛋白酶后，AD组和O1组达到相似的肠消化终点。然而，在最终消化阶段，AD和O2组的差异显著，凸显了胰蛋白酶是影响酪蛋白水解程度的主要因素。总体而言，尽管消化能力的退化主要发生在衰老期间的胃中，但它在整体消化中起的作用较小，导致衰老期间蛋白质消化能力基本不受影响。

3.4 在衰老过程中观察到餐后循环氨基酸水平下降

由于胃消化的改变可能对老年人蛋白质利用效率的影响较小，所以衰老过程中肠道对氨基酸的吸收值得关注。饲喂不同蛋白质的老年小鼠，粪便中氨基酸的排泄量增加，表明氨基酸吸收能力下降。这一观察结果得到了靶向代谢组学的支持，该研究揭示了餐后小鼠血浆氨基酸谱的变化。图4（a）和（b）所示的主成分分析（PCA）评分图显示，空腹时青年组、中年组和老年组间血浆氨基酸PCA聚类未呈现出明显的分离，而餐后PCA聚类明显分离。热图显示，青年组和中年组热图明显较红，老年组热图明显较蓝，即老年组的餐后氨基酸水平明显低于年轻人[图4（c）]。血浆中中性氨基酸[图4（d）]和BCAAs [图4（e）]随年龄增长显著下降，这与粪便中的BCAAs水平升高相对应[图4（f）和（g）]。虽然在酸性和碱性氨基酸中观察到类似的趋势[图4（h）~（k）]，但它们的变化不太显著。综上所述，衰老过程中氨基酸吸收能力下降，导致餐后血浆中BCAAs水平降低。

3.5 衰老过程中LAT2减少导致氨基酸吸收受损

为了揭示肠道吸收下降的潜在机制，我们对十二指肠上皮进行了蛋白质组学分析。韦恩图结果显示，从所有三组中鉴定出5132个共有蛋白，分别有81个、213个和120个蛋白是YM、MM和OM所特有的[图5（a）]。PCA分析显示，所有组都有明显的聚类，YM更接近MM而不是OM [图5（b）]。为了筛选差异表达蛋白，对各组间上调和下调蛋白进行汇总[图5（c）~（f）]。结果显示，与YM相比，MM有770个蛋白上调，482个蛋白下调。与YM相比，OM有210个蛋白上调，372个蛋白下调。与MM相比，OM有246个蛋白上调，478个蛋白下调。这些发现表明十二指肠蛋白的表达随着年龄的增长而发生显著变化。

此外，功能分析显示蛋白质消化和吸收的KEGG通路显著下调[图5（g）]。如热图[图5（h）]所示，OM中参与该途径的8个关键蛋白显著减少，包括COLA1、NHRF1、LAT2、ACE2、MEP1B、NEP、DPP4和BAT1。然后，对小鼠和人十二指肠上皮进行免疫印迹分析证实，老年小鼠LAT2表达与中年小鼠和青年小鼠相比，显著降低21.4%和61.9%；老年人LAT2表达与年轻人相比显著降低67.8% [图5（i）和（j）]。在衰老过程中，人十二指肠中LAT2的荧光强度也降低[图5（k）]。考虑到LAT2在运输大型中性氨基酸方面的重要作用，我们研究了其对Trp、Phe、Leu、Gln、Ala、Val、Thr、Ile、Met、Gly、His、Ser、Asn和Tyr水平的影响，发现其水平有所下降[图5（l）]。综上所述，这些发现表明衰老小鼠的蛋白质消化和吸收受损，其中LAT2的下调对衰老氨基酸吸收有重要影响。

4 讨论

蛋白质在消化道内分解为氨基酸，在老年人的生理功能中起着至关重要的作用[35]。根据以往的研究[36]，最好是通过评估氨基酸的生物利用度，而不是仅仅关注蛋白质的摄入量，来评估老年人蛋白质摄入的作用。本文考察了衰老如何影响动物蛋白和植物蛋白的消化和吸收，并指出酪蛋白是与年龄相关的消化率下降最显著的蛋白质。对酪蛋白的进一步研究表明，吸收对机体氨基酸水平下降的影响大于消化。值得注意的是，小鼠和人类的十二指肠上皮细胞显示出LAT2的大幅减少，这与蛋白质吸收效率随着年龄的增长而下降有关。这些发现为预防老年人氨基酸缺乏和相关疾病提供了新的见解。

餐后血液中氨基酸的可用性受年龄和蛋白质来源的影响。老年人在食用高蛋白膳食后，其餐后血液氨基酸水平的增加速度比年轻人慢[19]。我们的meta分析证实，年轻人和老年人在摄入蛋白质后均导致正向的吸收效率，年轻人的吸收效率较高，而老年人则略低，这表明相同蛋白质摄入并不能在不同年龄段产生相同的效果，老年人需要更多蛋白质来维持最佳健康状态[37]。在中国，动物和植物蛋白的消费量几乎相等，确定更有益的蛋白质来源至关重要[38]。对动植物蛋白利用效率的meta分析结果表明，摄入动物蛋白后的血液氨基酸吸收效率明显高于摄入植物蛋白后的效率。有研究[39]指出只有通过摄入更多数量的植物蛋白才能获得与动物蛋白相同的补充效果，这支持了我们的发现。然而，另一项研究[38]提出，对老年人来说，当摄入足量的蛋白质时，膳食蛋白质的来源可能并不重要，确保老年人能够获得蛋白质的最佳利用更为重要。因此，进一步通过动物实验明确老年人对不同膳食蛋白质的利用效率至关重要。

衰老过程中，不同来源的蛋白质表现出不同的生物利用度。我们的研究显示，随着年龄的增长，动物蛋白利用率下降程度更为显著，而植物蛋白的变化则较为缓慢。这种差异可能解释了为什么尽管动物蛋白在消化和吸收方面普遍被认为具有优势，但针对植物蛋白的研究结果表明，植物蛋白仍然能作为老年人良好的蛋白质来源[40]。以酪蛋白为蛋白质来源的研究[18]表明，老年人蛋白质消化率和苯丙氨酸吸收率下降更快。我们的研究结果也表明酪蛋白在不同蛋白质来源中的利用率明显降低。可见随着年龄的增长，动物蛋白质利用率显著降低是导致衰老过程中观察到的蛋白质消化和吸收能力下降的关键因素。然而，由于动物蛋白是必需氨基酸的重要来源，所以对于老年人来说，应该在膳食中均衡优质氨基酸组成的动物蛋白和易于消化的植物蛋白，从而更好地提高身体对氨基酸的利用效率。

随着年龄的增长，胃消化能力的变化不会显著降低老年人的蛋白质利用率。在我们的研究中，利用肽组学分析老龄动物肠道食糜，发现胃食糜中肽强度较低。这一发现表明胃消化功能受损，胃蛋白酶水平下降支持了这一结果。有研究[41]表明，在衰老条件下，胃端消化产物的差异比肠端更明显。然而，研究[42‒43]表明，与胰蛋白酶相比，胃蛋白酶在蛋白质消化中发挥的作用较小。当胃消化酶活性降低时，胰蛋白酶可以通过完全将蛋白质水解成多肽和游离氨基酸来弥补胃消化能力的不足[44]。在衰老过程中，胃蛋白酶活性显著下降，而肠道胰蛋白酶活性保持稳定，使老年人的蛋白质消化能力基本不受影响。同样，研究[45]表明，在模拟老年人消化状况时，衰老对蛋白质消化没有显著影响。因此，尽管在衰老过程中消化能力受损主要发生在胃中，但消化功能的改变并不影响老年人对蛋白质的利用。

吸收能力受损是衰老过程中循环氨基酸减少的主要原因。多项研究[18‒19]表明，氨基酸的吸收动力学在老年人中发生变化。我们的研究发现血浆中中性氨基酸的循环水平下降，尤其是支链氨基酸。先前的研究[8,46‒47]结果也支持这一点，表明与其他氨基酸相比，支链氨基酸的吸收率受到更大的损害。与许多其他氨基酸不同，BCAAs能跨过肝脏的首过代谢，迅速进入血液中，被肌肉利用，刺激老年人的肌肉蛋白质合成[48‒49]。餐后支链氨基酸的吸收能力随着年龄的增长而降低，可能是限制肌肉蛋白质代谢调节和导致骨骼肌功能随年龄增长而下降的关键因素。总的来说，衰老过程中氨基酸吸收能力下降是导致老年人氨基酸利用率变化的主要原因。对于老年人而言，直接通过饮食补充BCAAs及其对肌肉合成的效果有待进一步探究。

AATs的下调有助于减少衰老过程中氨基酸的吸收。AATs在调节体内氨基酸水平、控制其吸收和利用方面起着至关重要的作用[20]。研究表明，AATs的变化与年龄变化相关[50]。研究发现，运动后摄入必需氨基酸可增强年轻人体内AATs的表达，而对老年人的影响则不那么明显[21]。因此，衰老可能潜在地影响特定AATs的功能，从而影响氨基酸的生物利用率。我们的初步研究表明，负责运输大型中性氨基酸的LAT2蛋白的表达随着年龄的增长而减少。LAT2是体内支链氨基酸的主要转运蛋白，参与蛋白质合成和肌肉生长[51]。因此，解决与衰老相关的LAT2水平下降可能是一种提高老年人氨基酸利用的新方法，利用LAT2的抑制剂或调节剂调控LAT2表达可能是提高老年人蛋白质利用效率的一个全新思路。

总之，本研究通过meta分析和动物实验证实，随着年龄的增长，蛋白质的消化和吸收能力下降，其中动物蛋白酪蛋白的变化尤为明显。随后，我们发现胃消化能力的下降对衰老过程中蛋白质利用的影响很小。因此，我们进一步关注了肠道氨基酸吸收能力的变化。结果显示，餐后老年组小鼠血浆总氨基酸水平显著下降，尤其是中性氨基酸和BCAAs的肠道吸收减少，粪便排出增加。此外，十二指肠上皮细胞的蛋白质组学分析表明，衰老过程中LAT2的表达显著降低。这一发现在小鼠和人类肠道中都得到了验证，表明氨基酸转运蛋白LAT2的减少是导致衰老过程中蛋白质利用受损的关键因素。

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