肺泡2型细胞产生的PAI-1驱动与衰老相关的肺纤维化

全蕊 ,  石晨宏 ,  孙亚楠 ,  张承英 ,  毕然 ,  张怡然 ,  毕昕 ,  刘斌 ,  董子衡 ,  金德奎 ,  李依璇

工程（英文） ›› 2024, Vol. 42 ›› Issue (11) : 79 -94.

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工程（英文） ›› 2024, Vol. 42 ›› Issue (11) : 79 -94. DOI: 10.1016/j.eng.2024.08.014
研究论文

肺泡2型细胞产生的PAI-1驱动与衰老相关的肺纤维化

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摘要

肺纤维化（PF）是一种致命性肺部疾病，其主要影响老年人；然而，衰老是否以及如何引发纤肺维化仍不清楚。为了确定PF的主要诱发因素，我们首先分析了45名正常供体和51名PF患者肺组织的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，发现衰老可能是PF发展的主要催化剂。为了进一步研究衰老对PF形成的影响，我们利用自然衰老小鼠模型进行了全面深入的研究。我们发现，在衰老诱导的PF进展过程中，胶原纤维数量和类型的动态变化，尤其是胶原（Col）I的变化，成为PF的主要驱动因素。随后，我们利用原代肺泡2型（AT2）细胞和A549细胞系，通过条件培养基和Transwell共培养技术研究了增龄过程中Col I的合成，结果发现，衰老的AT2细胞分泌物[尤其是纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）]通过转化生长因子（TGF）-β/Smad2/3通路加速了纤维化和Col1al的产生。此外，scRNA-seq和人类肺组织的组织学分析表明，在衰老的肺组织和AT2细胞中，SERPINE1（编码PAI-1的基因）和PAI-1的表达均显著上调，这与我们在动物实验中的发现一致，为PAI-1在衰老和PF发展过程中的关键作用提供了更多证据。我们的研究表明，PAI-1是衰老的AT2细胞分泌的一种关键因子，它在促进成纤维细胞中Col1a1的合成、随后导致Col I沉积以及通过介导TGF-β/Smad2/3通路推动PF进展方面发挥着关键作用。我们的研究结果为上皮功能障碍参与的年龄相关性PF提供了关键证据，并为临床干预提供了潜在的治疗新靶点。

Abstract

Pulmonary fibrosis (PF) is a lethal lung disease that predominantly affects older adults; however, whether and how aging triggers fibrosis remains unclear. To pinpoint the predominant initiating factors of PF, we first analyzed single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) data from the lung tissues of 45 normal donors and 51 PF patients and found that aging might serve as the primary catalyst for PF development. To further investigate the influence of aging on PF formation, we conducted a comprehensive and thorough study employing a natural aging mouse model. We found that dynamic alterations in the quantity and types of collagen fibers during aging-induced PF progression, especially in collagenous (Col) I, emerged as the predominant driver of PF. We then investigated the regulation of Col I synthesis during aging using primary alveolar type 2 (AT2) cells and A549 cells line through conditioned media and Transwell coculture, and found that secretions—particularly plasminogen activator inhibitor (PAI)-1—from aged AT2 cells promoted fibrosis and enhanced collagen type I alpha 1 (Col1al) production via the transforming growth factor (TGF)-β/small mother against decapentaplegic (Smad)2/3 pathway. Furthermore, scRNA-seq and a histological analysis of human lung tissue demonstrated a significant upregulation of SERPINE1 (the gene encoding PAI-1) and PAI-1 expression in both aging lung tissue and AT2 cells, which was consistent with our findings from animal experiments, providing additional evidence for the pivotal role of PAI-1 during aging and the development of PF. Our research demonstrates that PAI-1, a crucial factor secreted by aging AT2 cells, exerts a pivotal role in promoting the synthesis of Col1a1 in fibroblasts, subsequently leading to Col I deposition, and in driving the progression of PF by mediating the TGF-β/Smad2/3 pathway. Our findings offer critical evidence for the involvement of epithelial dysfunction in age-related PF and provides potential novel therapeutic targets for clinical intervention.

关键词

衰老 / 肺纤维化 / 肺泡2型细胞 / PAI-1

Key words

Aging / Pulmonary fibrosis / Alveolar type 2 cells / PAI-1

引用本文

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全蕊,石晨宏,孙亚楠,张承英,毕然,张怡然,毕昕,刘斌,董子衡,金德奎,李依璇. 肺泡2型细胞产生的PAI-1驱动与衰老相关的肺纤维化[J]. 工程（英文）, 2024, 42(11): 79-94 DOI:10.1016/j.eng.2024.08.014

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1 引言

肺纤维化（PF）是一种慢性呼吸道疾病，估计全球发病率为每百万人中9~130例，患病率为每百万人中33~451例[1]。与PF相关的死亡率持续上升[2]，因此，治疗这种疾病是现代社会面临的一项重大医学挑战。PF的特点是肺功能受损、细胞外基质（ECM）沉积、组织重塑和纤维化瘢痕形成，并伴有肺泡上皮损伤和炎症[3]。胶原蛋白占细胞外基质的30%~70%，在纤维化中起着关键作用[4]。抗纤维化药物的有效性通常通过胶原合成和沉积的减少情况来评估[5]。超过16种胶原纤维亚型与纤维化的形成有关[6]。显然，胶原纤维亚型的合成和构成在PF进展中起着至关重要的作用。

越来越多的证据表明，随着年龄的增长，PF的发病率会急剧上升[7‒10]。调查显示，70岁以上的人患PF的风险是40岁以下的6.9倍[11]。随着年龄的增长，机体对外界刺激的反应减弱，细胞发生老化，再生能力减弱，使肺组织更容易受到损伤，并发生纤维化。然而，治疗PF的特效药物（如吡非尼酮和N-乙酰半胱氨酸）主要通过减少炎症、细胞因子的产生和氧化应激来达到治疗目的。虽然免疫细胞（包括T细胞和巨噬细胞）在PF中的致病作用已被广泛记录[12‒13]，但从临床试验结果来看，炎症对该疾病的影响仍存在很大争议；抗炎治疗已被证明对PF患者无效，甚至会产生不良反应[14]。此外，先前的研究[15‒16]表明，非特异性间质性肺炎和胶原血管病相关性PF患者表现出严重的PF症状，但炎症病理特征相对较轻。因此，导致PF发病的主要因素可能不是炎症，而是衰老本身。

在增龄过程中，衰老肺细胞的积累和微环境的演变可能在PF的发展中起着至关重要的作用。研究[17‒18]发现，在PF患者的肺部，与年龄相关的生物标志物大幅增加。随着肺细胞的衰老，它们的分泌模式会发生改变，通过释放衰老相关分泌表型（SASP）因子、各种细胞因子、趋化因子、基质重塑酶和促纤维化因子，来影响成纤维细胞的增殖和分化[18]，从而加速纤维化的发展。在增龄过程中，与年龄相关的肺泡上皮功能下降可能会引发进行性PF [19‒21]。在PF患者中已观察到纤维化区域上皮祖细胞的区域性耗竭[22‒23]，肺泡2型（AT2）细胞功能/数量降低，SASP因子和促纤维化介质广泛分泌[24‒25]，以及多种细胞衰老相关通路的异常激活[17,19,26‒27]。最近一项关于小鼠和人类PF的体外器官模型研究数据表明，衰老的AT2细胞可通过自分泌的p53和TGF-β信号通路直接影响肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，从而导致PF发展[28]。此外，研究表明在体外使用抗衰老药物靶向清除小鼠肺中衰老的AT2细胞，可以稳定肺泡上皮细胞的功能，减少纤维化介质的表达，进而减轻纤维化[29‒30]。同样，选择性消除衰老的AT2细胞可逆转电离辐射导致的小鼠持续性PF症状[31]。很明显，衰老的AT2细胞对PF的发展起着重要作用。

尽管PF发生的具体机制尚不明确，但越来越多的研究表明，PF涉及内源性或外源性因素引起的成纤维细胞持续活化，导致胶原蛋白过度合成和ECM过度沉积，最终诱发器官衰竭[5]。在纤维化过程中，多种信号共同调控胶原蛋白的合成，包括转化生长因子-β（TGF-β）、无翼因子（Wnt）/β-catenin、表皮生长因子受体（EGFR）、yes 相关蛋白（YAP）/具有PDZ结合基调的转录协同激活因子（TAZ）、雷帕霉素机制靶标（mTOR）、骨形态发生蛋白（BMP）和炎症 [32‒34]。然而，胶原蛋白亚型的具体组成及其在自然老化的PF中合成的调控机制仍未确定。尽管大量证据表明，功能失调的AT2细胞是PF发生和发展的核心，但人们对衰老的AT2细胞在胶原合成中的作用仍知之甚少。老化的AT2细胞与成纤维细胞之间的直接交流以及所涉及的特定调控因子和分子机制尚未完全阐明。

本研究旨在探索衰老诱导的PF中胶原蛋白的主要成分，并阐明老化的AT2细胞对胶原蛋白合成的调节作用。我们使用了自然衰老小鼠模型，并对人类肺组织进行了单细胞数据分析。我们的研究为了解上皮功能障碍对PF发展的影响提供了重要证据，并进一步提供了新的临床治疗靶点。

2 方法

2.1 小鼠和组织取样

动物试验按照《动物福利指南》（欧盟第2010/63/EU号指令）进行，并经中国农业大学动物保育与使用委员会批准（批准号：AW41203202-5-3）。由于C57BL/6J小鼠在遗传和生理方面与人类相似度高、基因组成明确、表型相对稳定且寿命相对较短，因此被广泛用于人类衰老的相关研究[35]。无病原体的C57BL/6J小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，每只小鼠单独饲养，并自然衰老。研究包括3~28月龄的六个年龄组（即3月龄、6月龄、12月龄、18月龄、24月龄和28月龄）。

对每组小鼠进行麻醉并用生理盐水灌注以去除血液，然后用4%多聚甲醛（PFA）进行灌注和固定。对肺叶进行解剖、固定、处理和石蜡包埋。未经PFA处理的组织储存在-80 ℃，以备后续分析。

2.2 人体肺组织取样

人体癌旁肺组织的采集遵守世界医学协会伦理准则《赫尔辛基宣言》，研究方案经中国农业大学人体研究伦理委员会批准（批准号：CAUHR-20230502）。肺衰老研究涉及5名年轻个体（≤ 40岁）和5名老年个体（≥ 60岁）。在距离肿瘤边缘2 cm的位置采集肺组织样本。部分样本于-80 ℃冷冻，部分样本则在4 °C下用福尔马林固定过夜，然后制成5 μm的石蜡切片进行组织学分析。

2.3 小鼠肺功能评估

我们采用DSI Buxco 全身体积描记（WBP）系统（Wilmington, USA）来检测自然衰老小鼠的肺功能。WBP系统是一种用于分析清醒动物呼吸功能的无创程序。在呼吸参数监测开始之前，每只小鼠都要在密闭的环境内进行30 min的适应，以达到稳定和自然的呼吸状态。实验开始后，传感器每2 s捕捉并自动记录与小鼠呼吸相关的压力变化（ΔP）。实验检测到的典型呼吸参数的详细信息见附录A表S1。随后使用SPSS 26.0软件（IBM, USA）分析每只小鼠20 min测量结果中各参数的平均值。

2.4 苏木精和伊红（H&E）染色

使用H&E染色试剂盒（G1120, Solarbio）来评估衰老小鼠的肺组织结构。按照生产商的说明书以及参考文献[36‒37]中描述的方法，在明场显微镜（DM6B, Leica, Germany）下以20倍的放大率对染色的肺组织切片进行观察。

2.5 Masson三色染色法

使用Masson三色染色试剂盒（G1340, Solarbio），按照生产商的说明来检测肺组织中胶原纤维的含量。在放大10倍的传统光学显微镜（DM6B, Leica）下观察蓝色染色区域。

2.6 天狼星红染色

使用改良的天狼星红染色试剂盒（G1472, Solarbio），来区分胶原纤维的类型并量化其在肺组织中的含量。染色切片在偏振光显微镜（DM4B, Leica）下拍照。使用ImageJ软件提取和分析红色和绿色荧光信号，并计算平均荧光强度。

2.7 透射电子显微镜检测

肺组织样本（约1 mm3）在2.5%戊二醛溶液中进行固定，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次，然后在1%四氧化锇溶液中固定2 h。使用梯度乙醇溶液和丙酮进行脱水处理后，用包埋树脂和丙酮浸润样本。聚合后使用超微切片机（EMUC7, Leica）将样品切成90 nm的超薄切片。最后用2%的乙酸铀和柠檬酸铅染色10 min。将切片置于透射电子显微镜（TEM；Hitachi, H-7650, Japan）下进行观察。

2.8 免疫荧光染色

将组织切片置于柠檬酸盐修复液中（ZL1-9064, ORIGEN；pH = 6.0）进行抗原修复，在含1% Triton X-100 的PBS溶液（T8200, Solarbio）中浸泡15 min。然后用10%山羊血清（C01-03001, Bioss）封闭切片1 h。4 °C下一抗过夜孵育，随后在室温下二抗避光孵育1 h（抗体信息见附录A表S2）。之后，切片用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）工作液（C0065, Solarbio）染色10 min，并用抗荧光淬灭封片液（P0126, Beyotime）在盖玻片下密封。随后，使用激光共聚焦显微镜（LSM 900/Axio Observer 7, ZEISS, Germany）对样品进行观察和拍照。

2.9 细胞培养

原代AT2细胞在添加了生长因子的完全培养基（CM-M003, Procell）中培养。培养这些细胞的容器均涂有5 μg∙cm-2的鼠尾胶原（354236, Corning, USA），以提高细胞的黏附性。A549和NIH3T3细胞系购自武汉普诺赛生物技术有限公司，两种细胞系分别在Ham's F-12K培养基（PM150910, Procell）和DMEM培养基（PM150210, Procell）中培养。WI-38细胞株购自中国典型培养物保藏中心细胞库，在基础培养基MEM（PM150410, Procell）中培养。

2.10 细胞衰老模型

按照我们最近发表的文章[38]中概述的方法，为A549细胞和AT2细胞构建了细胞衰老模型。将细胞以每孔1.5 × 105个的密度接种到六孔培养板中，培养24 h以确保细胞贴壁和增殖。随后更换为2 mL含有30 g∙L-1 D-半乳糖的培养基，培养48 h以诱导细胞衰老。

2.11 共同培养和条件培养模式

条件培养：用30 g∙L-1 D-半乳糖处理A549或原代AT2细胞，建立细胞衰老模型。同时，将NIH3T3细胞以2 × 105 个∙孔-1的密度接种到六孔培养板中，并在含0.4%血清的培养基中饥饿培养24 h。然后，将从A549或原代AT2细胞中收集的条件培养基用来培养NIH3T3细胞，48 h后提取细胞总蛋白。

Transwell共培养：在Transwell系统的上室培养A549细胞，并用30 g∙L-1 D-半乳糖建立细胞衰老模型。NIH3T3 或WI-38细胞以2 × 105 个∙孔-1的密度接种到Transwell系统的下室，并在含0.4%血清的培养基中饥饿培养24 h。共培养48 h后提取细胞的总蛋白。

2.12 纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1）对成纤维细胞的刺激

将NIH3T3细胞以1.5 × 105个∙孔-1的密度接种到六孔培养板中，培养至80% 融合。在含0.4%血清的饥饿培养基中过夜培养后，将NIH3T3细胞暴露于不同浓度的PAI-1（HY-P71133, MCE）中继续培养48 h，随后提取并分析总蛋白。

2.13 小干扰RNA 转染

将NIH3T3细胞以3 × 104个∙孔-1的密度接种在24孔培养板中，培养至60%~70% 融合。将25 pmol的小干扰 RNA（siRNA）和1 µL的KEL-R转染试剂（KC127, GENCEFE）分别稀释在50 µL的Opti-MEM培养基（31985070, Gibco, USA）中并孵育5 min。将两种溶液轻轻混合共同孵育20 min，制成转染载体混合物。转染8 h后，将NIH3T3细胞置于含有2 μg∙mL-1 PAI-1（HY-P71133, MCE）和0.4%血清的培养基中。用脒基荧光素（FAM）绿色荧光评估转染效率。培养48 h后提取细胞总蛋白进行后续分析。所用引物的siRNA序列见附录A表S3。

2.14 抑制剂处理

将NIH3T3细胞以1.5 × 105个∙孔-1的密度接种到六孔培养板中，培养至80%融合。用含0.4%血清的培养基使细胞饥饿过夜，用10 μmol∙L-1 SB431542预处理细胞45 min，随后用2 μg∙mL-1 PAI-1（HY-P71133, MCE）和10 μmol∙L-1 SB431542处理细胞。48 h后，提取细胞总蛋白，并检测TGF-β通路相关蛋白。

2.15 原代AT2细胞提取

实验前，将780 U的I型胶原酶（17100017, Gibco, 260 U∙mg-1）、40 U的弹性蛋白酶（LS002294, Worthington; ≥ 3 U∙mg-1）和20 U的分散酶II（4942078001, Roach; 0.9 U∙mg-1）混合在10 mL含Ca2+和Mg2+的PBS溶液（FB13356, FEIMOBIO）中，配制成消化酶液。

将小鼠麻醉后，用生理盐水灌注以清除肺组织中的血液，通过气管插管注入1.0 mL 的消化酶液。然后用0.6 mL 1%低熔点琼脂糖封闭气管。解剖肺组织，并在37 °C下用消化酶液消化约40 min，以形成细胞悬浮液。经过过滤、离心和红细胞裂解后，将细胞重悬于完全培养基（Procell, CM-M003）中，培养45 min以去除贴壁的成纤维细胞。最后，将培养液中的AT2细胞接种到涂有鼠尾胶原（354236, Corning; 5 μg∙cm-2）的培养瓶中继续培养。

2.16 AT2细胞的RNA测序分析

按照我们最近发表的方法[38]，使用流式细胞术从3月龄和24月龄的小鼠肺组织中分离出高纯度的AT2细胞。从AT2细胞中提取总RNA并进行质量评估。符合质量标准的RNA用于构建文库。按照ABclonal mRNA-seq Lib Prep Kit（ABclonal）提供的说明制备配对末端（PE）文库。使用oligo(dT)磁珠纯化1 μg总RNA中的mRNA，然后在ABclonal第一链合成反应缓冲液中进行mRNA片段化。随后，以mRNA片段为模板合成互补DNA（cDNA）双链。之后，将合成的双链cDNA片段与适配序列连接，进行聚合酶链反应（PCR）扩增，得到最终的cDNA文库。PCR产物经过纯化，其文库质量由Agilent Bioanalyzer 4150（USA）进行评估。转录组测序分析通过上海中科新生命生物科技有限公司使用Illumina NovaSeq 6000平台（测序模式：PE150）进行。

2.17 RNA提取和反转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

用预冷的TRNzol试剂（DP424, TIANGEN）裂解肺组织样本30 min，以提取RNA。使用cDNA反转录（RT）试剂盒（G592, Abm，中国）进行cDNA合成。在实时PCR系统（QuantStudioTM 5, Thermo Scientific Fisher, Singapore）上使用RT-qPCR进行基因表达分析。以GAPDH为参照基因进行归一化处理，用ΔΔCT法计算基因的相对表达水平。引物序列见附录A表S4。

2.18 免疫印迹

在对肺组织样本进行免疫印迹时，20 mg新鲜肺组织用250 µL的裂解缓冲液（R0010, Solarbio）在冰上裂解30 min，然后匀浆并离心。对于六孔培养板中的贴壁细胞，则加入100 μL裂解缓冲液以收集蛋白上清液。使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离高分子量蛋白质，然后将其转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。接着用针对所需蛋白质的特异性抗体（抗体详细信息见附录A表S5）孵育该膜，最后检测并观察结合的抗体。

2.19 单细胞RNA测序公共数据库分析

为了比较正常供体和特发性肺纤维化（IPF）患者之间的基因表达差异，我们分析了美国国家生物技术信息中心（NCBI）基因表达总库（GEO）平台上的三个公共数据库（登录号分别为GSE135893、GSE136831和GSE122960）。将原始数据进行数据转换、质量控制和过滤后，使用DESeq2软件包（v.1.40.2）进行组间差异基因表达分析，阈值设定为|log2(Fold Change)| > 1和调整后p值（Padj）< 0.01，以筛选差异表达基因（DEGs）。使用Seurat 软件包（5.0 版）中的平均表达函数进一步分析已确定的DEGs的平均基因表达量，随后使用ggplot2软件包（3.4.4 版）将其可视化。利用典型相关性分析（CCA）和基因富集分析（GSEA）对正常供体和IPF患者的DEGs与炎症或SASP进行相关性分析。

为了比较年轻和老年肺组织样本中SERPINE1基因的表达，我们分析了两个公共数据库（GSE227136和GSE122960）中正常供体的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据。样本按年龄分为年轻组（< 40岁）和老年组（> 50岁）。来自21岁（GSM3489197）、22岁（GSM3489193）、25岁（GSM7103283）、27岁（GSM7135600）、29岁（GSM7135601和GSM3489187）和34岁（GSM7135584）年轻供体的7个数据集，以及来自55岁（GSM7135599和GSM3489185）、57岁（GSM3489189）、58岁（GSM7103281）、60岁（GSM7103319）、63岁（GSM3489182）和71岁（GSM7135596）老年供体的7个数据集符合基因表达分析的纳入标准。使用Seurat (v. 5.0)中的SCTransform对每个样本数据进行归一化处理，并结合CCA和Integration功能进行批量校正。对细胞进行筛选，保留检测到的超过250个基因（nFeature_RNA）且线粒体基因含量低于30%（%.mt）的细胞。此外，基因必须至少在三个细胞中表达才能保留。使用DoubletFinder识别并移除双细胞。随后进行降维、聚类分析、细胞类型注释和目标基因表达分析。数据分析脚本使用R语言（New Zealand）进行编写。采用皮尔逊相关系数分析SERPINE1与ECM相关基因之间的相关性。

2.20 统计分析

本文首先通过scRNA-seq数据库分析了正常供体（n = 45）和纤维化患者（n = 51）肺组织中衰老与PF之间的相关性。随后，在动物水平（n ≥ 3）和细胞水平（n = 3）上进行了探索。最后，利用人体肺组织scRNA-seq数据库（n = 7）和样本（n ≥ 4）对研究结果进行了验证。使用IBM SPSS Statistics 26.0软件进行统计分析。两组间比较采用双尾t检验计算P值（* P < 0.05和** P < 0.01表示差异显著，“ns”表示不显著）。对于多组比较，在单因素方差分析（ANOVA）中通过邓肯检验进行事后多重比较，小写字母表示组间差异（P < 0.05）。使用Prism 9.0 软件（USA）进行数据可视化。

3 结果

3.1 衰老是导致PF的主要因素

为了确定PF的主要驱使因素，我们分析了NCBI GEO平台上的三个公共数据库（登录号分别为GSE135893、GSE136831和GSE122960），这些数据库包含来自45名正常供体和51名IPF患者肺组织的scRNA-seq数据。对年龄分布的分析表明，IPF主要发生在50岁及以上的人群中。其中，60~70岁年龄组的病例数最多（62.7%）[图1（a）]，这表明PF与高龄之间存在密切的相关性。健康供体与IPF患者的基因表达谱存在明显差异。随后对两组患者进行了差异基因表达的筛选，发现IPF患者肺组织与正常供体肺组织中的DEGs有593个上调和171个下调[图1（b）]。通过对比这些DEGs的CCA结果，我们观察到这些DEGs与SASP因子的相关性强于炎症因子[图1（c）]。GSEA结果进一步表明，DEGs中存在明显的SASP富集（P < 0.01），45个基因中有17个重叠，比例为6.7 [图1（d）]。这些研究结果表明，衰老可能是PF发生的主要催化剂。

3.2 衰老小鼠的肺功能下降且组织结构重塑

为了进一步研究衰老对PF形成的影响，我们利用自然衰老的小鼠模型进行了全面深入的研究。首先，我们通过WBP系统阐明了衰老小鼠肺功能的相关变化，并检测了典型的肺功能参数，如图2（a）~（i）所示。随着小鼠年龄的增长，它们的呼吸频率（F）逐渐下降[图2（b）]，因此需要更大的潮气量（TVb）来维持足够的每分钟通气量[图2（c）]。结果表明，随着年龄的增长，小鼠的呼吸模式会过渡到更深和更慢的呼吸。与年龄相关的呼气中期流速（EF50）的明显下降[图2（d）]和松弛时间（Tr）的增加[图2（e）]表明衰老小鼠出现通气障碍和气体交换阻力增加。此外，我们还观察到吸气时间（Ti）和呼气时间（Te）随着年龄的增长而延长[图2（f）和（g）]，同时吸气流量峰值（PIFb）和呼气流量峰值（PEFb）下降[图2（h）和（i）]。这些结果表明，在自然衰老过程中，小鼠的呼吸肌力减弱、肺顺应性降低、出现阻塞性通气障碍，从而导致整体肺功能下降。

肺功能是由完整的肺部结构赋予的，因此，我们分离了小鼠的肺，并对其组织结构进行了观察。我们发现，3月龄和6月龄幼年小鼠的肺组织呈淡粉色、质地柔软、肺叶完整、表面光滑、富有弹性和光泽。然而，12月龄中年小鼠的肺组织失去光泽。18月龄小鼠的肺门部出现充血现象。24月龄的小鼠充血现象进一步加重，由肺近端向肺远端漫延，部分肺叶出现硬化现象。28月龄小鼠的肺组织呈灰褐色，硬化现象严重，出现明显的裂痕，甚至发生肿瘤[图2（j）]。

通过H&E染色进一步对肺远端和肺近端的肺泡结构进行病理学观察[图2（k）]。其中，肺近端是指更靠近肺门的区域。我们发现，3月龄和6月龄幼鼠的肺泡数量较多，形态良好，支气管壁层结构清晰。然而，在12月龄小鼠中，肺泡的数量开始减少。到18月龄时，观察到肺泡塌陷紊乱，出现局部出血和炎症细胞（如淋巴细胞和巨噬细胞）浸润的现象。24月龄时，老龄小鼠的肺泡发生变形和紊乱，组织结构遭受严重破坏，炎性细胞、上皮细胞碎片和纤维样渗出物聚集成团状，造成肺泡腔堵塞和气管的袖套样结构，弥漫性出血部位明显。28月龄时，病变加重，导致肺组织结构明显重塑。此外，肺远端的结构变化主要表现为与年龄相关的肺泡扩张和塌陷，在24月龄时伴有炎症发生。

3.3 在肺增龄过程中，PF的发生伴随着胶原纤维亚型的动态变化

肺组织形态学观察显示，肺叶随着年龄的增长而逐渐硬化，这是PF的临床表现。为了评估不同年龄小鼠肺组织的纤维化情况，我们量化了α-平滑肌肌动蛋白（SMA）的蛋白质和mRNA的表达，α-SMA是评估纤维化程度的关键标志物。我们的结果显示，不同年龄组小鼠肺组织中α-SMA [图3（a）]和Acta2 [图3（b）]表达量的增加与年龄有关，这表明衰老会导致肺组织纤维化的增加。此外，我们还观察到3月龄和28月龄小鼠肺组织中胶原纤维超微结构的明显差异[图3（c）]。具体来说，3月龄小鼠的胶原纤维交联疏松、排列整齐、呈束状分布，而28月龄小鼠的胶原纤维交联致密、呈弥散状分布。我们进一步进行了Masson染色，以评估肺组织中胶原纤维的整体含量。镜检显示蓝染区域为胶原纤维，红染区域为肌纤维。如图3（d）所示，结果显示3月龄和6月龄小鼠的肺组织出现大片的蓝染区域，其主要分布在大气管和支气管周围，呈片状或斑状分布。然而，中年组（12月龄）仅有少量的蓝染区域，表明胶原纤维比年轻组明显减少。而18月龄中老年组蓝染区域稍有增多。24月龄和28月龄的小鼠肺组织中，胶原纤维明显增加，镜下可见大片连续蓝染区域，呈网格状包绕肺泡。因此，在增龄过程中小鼠肺组织中胶原纤维的总量呈现先减少后增加的动态趋势。以上结果表明，肺组织中的胶原纤维亚型可能会随着年龄的增长而发生动态变化。

随后，我们利用天狼星红染色法鉴定了增龄过程中肺组织中胶原纤维亚型的变化。如图3（e）所示，肺间质中主要存在I型胶原纤维（Col I）和III型胶原纤维（Col III），随着年龄的增长，红色染色的Col I逐渐增加，绿色染色的Col III逐渐减少。Col I与Col III的比例呈显著的上升趋势。这些结果表明，衰老会改变Col I和Col III的数量、空间排列以及Col III/Col I的比值。为了证实这一发现，我们进一步定量分析了肺组织中Col1a1和Col3a1的表达。结果发现，老年小鼠肺中Col1a1的表达水平约为年轻小鼠的两倍[图3（f）]。Col I决定肺的僵硬度，而Col III决定肺的顺应性。因此，肺组织中Col I的增加显著加速了肺纤维化的发展。

18月龄中年时期是纤维化发展的关键时间点。肺组织中的Col I增加，而没有表现出明显的炎症，这表明衰老而非炎症是导致Col I表达上调的主要因素。因此，我们的研究重点是阐明衰老导致肺组织中Col I表达上调的机制。

3.4 衰老的AT2细胞促进Col I合成

Col I是纤维化肺组织间质的主要成分。它由两条Col1a1链和一条Col1a2链构成[图 4（a）]，而Col III则由三条Col3a1链构成。我们通过条件培养和Transwell共培养的方法进一步阐明了衰老的AT2细胞对成纤维细胞分泌胶原蛋白的影响，并对特定胶原蛋白链进行了定量分析[图4（b）]。老龄小鼠原代AT2细胞的数量和存活率有限，为获取足够的细胞以进行后续实验带来了巨大挑战。为了解决这个问题，我们选择在后续研究中使用4周龄小鼠的原代AT2细胞以及A549细胞系。

首先，我们从4周龄的小鼠肺部提取原代AT2细胞，并使用30 g∙L-1的D-半乳糖诱导细胞衰老。我们观察到衰老相关蛋白p-21的表达增加了1.44倍，DNA损伤标记物组蛋白家族成员X Ser-139位点磷酸化形式（γ-H2AX）的表达增加了0.79倍，而细胞周期相关蛋白Cyclin B1和p-Histone H3的水平分别下降至60%和50% [图 4（c）]，这表明衰老模型的成功建立。随后，用衰老的AT2细胞条件培养基培养成纤维细胞NIH3T3，如图4（d）所示，我们观察到NIH3T3细胞中的α-SMA、Col1a1和Col1a2蛋白水平表达升高，而Col3a1表达降低。进一步对胶原合成相关蛋白进行分析发现，磷酸丝氨酸转氨酶1（PSAT1）、磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）和热休克蛋白47（Hsp47）的表达水平升高，这表明相对于Col III的降解，Col I的合成明显增加。Col I的过度沉积可能会导致PF的形成。因此，衰老AT2细胞的分泌物可能主要通过促进成纤维细胞合成Col I来加速纤维化的形成。

为了验证这一想法，我们进一步使用AT2细胞的典型替代细胞系A549细胞建立了衰老模型，并用A549细胞的条件培养基培养NIH3T3细胞。同样，我们观察到α-SMA和Col1a1以及胶原合成相关蛋白PSAT1、P5CS和Hsp47的表达明显上升，而Col3a1的表达下降[图4（e）]。接下来，为了进一步证明衰老AT2细胞条件培养基的促纤维化作用，我们将衰老的A549细胞与两种成纤维细胞[NIH3T3细胞（鼠源）和WI-38细胞（人源）]进行了Transwell共培养。如附录A图S1（a）和（b）所示，我们在这两种细胞中观察到了相似的结果。因此，我们证实了衰老AT2细胞的分泌物可刺激成纤维细胞合成Col I，从而促使衰老肺组织的纤维化病变。

3.5 衰老AT2细胞分泌PAI-1因子促进Col I合成

为了探究SASP对纤维化形成的影响，我们首先进行了广泛的文献筛选，以寻找与SASP相关的关键促纤维化因子，并量化了它们在肺组织和原代AT2细胞中的表达水平[图5（a）]。根据RT-qPCR结果，与3月龄小鼠相比，28月龄小鼠肺组织中Serpine1、Tnf、Fn1、Tnc、Csf3和Mmp3的mRNA水平明显上调[图5（b）]。其中，Serpine1在28月龄肺组织中的平均表达量最高，是3月龄肺组织的1.67倍。此外，对3月龄和24月龄小鼠原代AT2细胞的RNA-seq数据进行分析后发现，两个年龄组中促纤维化因子的表达模式不同，随着年龄的增长，Mmp2、Edn1、Vegfa、Jag2、Serpine1和Fn1的表达明显增加[图5（c）]。值得注意的是，在衰老的肺组织和A549细胞中，Serpine1的表达（PAI-1，一种关键的SASP因子）明显增加[图5（d）]。因此，PAI-1可能是衰老AT2细胞分泌物中关键的促纤维因子。为了验证这一假设，我们用不同浓度（0、0.5 μg∙mL-1、1.0 μg∙mL-1和2.0 μg∙mL-1）的PAI-1刺激成纤维细胞48 h。结果显示，随着PAI-1作用浓度的增加，α-SMA和Col1a1的表达呈剂量依赖性上升[图5（e）和（f）]。与此同时，胶原合成相关蛋白的水平也有所升高，尤其是PSAT1、P5CS和Hsp47。这些结果表明PAI-1在促进成纤维细胞合成Col I并触发纤维形成过程中具有重要作用。

3.6 PAI-1主要通过TGF-β通路促进成纤维细胞中Col I的合成

为了进一步阐明PAI-1促进Col I合成的机制，我们筛查了调控Col1a1的转录因子。Smad2/3是能与Col1a1启动子区域结合并调控Col1a1基因表达的关键调控因子[39‒40]。通过靶向作用该转录因子并进行细胞水平检测，我们发现在PAI-1刺激48 h后，成纤维细胞中Smad2/3和p-Smad2/3的表达显著上调[图5（g）和（h）]。Smad2/3是TGF-β通路中重要的调节蛋白[41]，进一步检测TGF-β通路受体p-TβRI发现其表达增加，表明TGF-β通路被显著激活。因此，PAI-1可能主要通过TGF-β/Smad通路调节成纤维细胞中Col I的合成。

我们进一步使用抑制剂阻断和siRNA基因沉默两种方法来验证我们的假设。结果表明，用SB431542阻断TGF-β通路可显著降低PAI-1诱导的Col1a1表达[图5（i）]，证实了PAI-1主要通过TGF-β通路促进Col1a1合成。此外，使用靶向作用Smad2/3的siRNA能有效抑制PAI-1诱导的Col1a1表达[图5（j）]，这表明PAI-1是通过转录因子Smad2/3促进I型胶原蛋白合成的关键调节因子。总之，衰老AT2细胞的PAI-1主要通过TGF-β/Smad2/3通路来调控Col I的合成和纤维化的发生。

3.7 老年人肺组织显示出Col I沉积和AT2细胞分泌的PAI-1高表达

为了验证PAI-1在老龄人群中的表达及其与肺纤维化的关系，我们分析了从NCBI GEO数据库（登录号为GSE227136和GSE122960）获得的正常供体的scRNA-seq数据集。观察到年轻人和老年人肺组织的基因表达谱存在显著差异，这表明衰老会导致肺部基因的表达发生变化[图6（a）]。Serpine1在老年小鼠肺组织中高表达，这与老年人肺组织样本中观察到的结果相似，其SERPINE1在老年人肺组织中mRNA表达水平是年轻人的近6倍[图6（b）和（c）]。我们进一步注释了肺组织中的不同细胞类型[图6（d）]，并对AT2细胞进行了分组，发现与年轻人肺组织相比，老年人肺组织中AT2细胞的数量明显减少[图6（e）]。重要的是，老年人AT2细胞中SERPINE1的表达水平是年轻人AT2细胞的5倍以上[图6（f）]。这些结果表明，SERPINE1在老年肺组织和AT2细胞中的表达量显著增加。皮尔逊相关性分析显示SERPINE1与ECM相关基因之间存在相关性[图6（g）]，这进一步证明了PAI-1在增龄过程中的表达增加与PF的形成存在密切联系。

为了进一步验证上述发现，我们收集了不同年龄段肺癌人群的癌旁组织，其中年轻样本为15岁、17岁、31岁、39岁和40岁，老年样本为60岁、63岁、64岁、66岁和71岁，并进行了组织学分析。H&E染色显示，年轻人的肺泡结构完整，形态规则，数量较多，而老年人的肺组织主要表现为肺泡破坏和塌陷，并伴有炎症浸润现象[图7（a）]。Masson染色显示，老年人肺组织中的蓝染区域明显增多，呈斑块状分布在支气管周围[图7（b）]。

此外，我们还使用天狼星红染色评估了人体肺组织中胶原纤维类型的变化。结果显示，年轻人的肺组织主要由绿色的Col III组成，而老年人的肺组织主要由红色的Col I组成[图7（c）]，这与衰老小鼠模型观察到的结果相一致。随后，免疫印迹结果显示，与40岁以下的年轻人相比，50岁以上老年人的肺组织中蛋白的表达水平明显更高[图7（d）]。最后，我们进行了免疫荧光染色，以评估人体肺组织中AT2细胞和PAI-1蛋白的共定位情况。结果显示，随着年龄的增长，AT2细胞分泌的PAI-1水平明显升高[图7（e）]。这些发现与前面的动物实验结果一致。

4 讨论

PF是一种与年龄相关的肺部疾病，其发生风险随着年龄的增长而显著增加[42]，这一点在我们对衰老小鼠模型的实验和对老年人群的研究中得到了证实。此外，先前的研究表明，在PF小鼠模型中，Col I和Col III水平呈上升趋势[43‒44]。然而，我们的研究发现，在衰老诱导的PF过程中，胶原纤维的数量和类型发生了动态变化，这与之前的报道有所不同。值得注意的是，18月龄是小鼠PF的关键起始点，伴随着Col I的显著增加和Col III的明显下降。Col I呈束状分布，抗张力强；而Col III交联疏松，具有良好的弹性。维持Col I和Col III两者的适当平衡对于维护肺组织的结构完整性和功能性至关重要。我们的研究表明，在增龄过程中，Col I和 Col III的数量、空间排列和比例发生了变化。这些变化导致肺组织硬度增加，严重影响了细胞间的信号传递和力的传导，从而损害了肺组织的收缩和舒张。在增龄过程中，肺部的胶原代谢会受到严重干扰，导致胶原网络的重塑。Col I与Col III的比例对于早期检测和评估肺泡损伤至关重要。

Col I是ECM的主要成分，其含量在纤维化形成过程中起着主导作用。然而，目前关于增龄过程中Col I合成调节机制的研究十分有限。一般认为，衰老导致的AT2细胞持续损伤和功能衰退会导致成纤维细胞修复功能紊乱和致病性激活，成为PF发生的内在机制[27]。在PF的发生和发展过程中，受损的AT2细胞会分泌大量与衰老相关的分泌型SASP蛋白和细胞因子，如PDGF、TGF、TNF-α、PAI-1、前列腺素和凝血因子[25,45]。这些因子构成了肺组织内的微环境，共同调节成纤维细胞的行为。然而，参与这一过程的关键调节因子及其与Col I合成有关的作用机制仍不清楚。在这里，我们研究了AT2细胞与成纤维细胞之间的直接交流。通过因子筛选和细胞验证，我们发现PAI-1是衰老AT2细胞分泌的一种重要的促纤维化因子，能显著增强α-SMA和Col1a1的表达。现有研究表明PAI-1与多个器官（包括肺、肝脏和肾脏）的纤维化过程有关[46]，这进一步证实了我们的发现。

先前的研究[47‒48]已经报道，在野生型和衰老模型小鼠以及患有年龄相关疾病（包括PF）的人类中，PAI-1的表达随着年龄的增长而增加。与之一致，我们也在自然衰老小鼠的肺组织中观察到PAI-1水平与年龄相关的增加。此外，PAI-1在老年人肺组织中的表达明显超过年轻人，显示出与纤维化相关蛋白表达同步的趋势。以往的报道表明，PAI-1主要抑制纤溶酶原的蛋白酶活化。PAI-1表达上调会破坏体内纤溶系统的平衡，阻碍ECM降解，导致纤维蛋白积聚，从而推动了PF的发展[49]。我们的研究表明，PAI-1不仅是一种SASP因子，也是一种重要的促纤维化因子，可通过参与Col1a1的合成促进PF的发展。此外，我们还发现AT2细胞是纤维化肺组织中PAI-1的重要来源，这一结论得到了以往研究[45,50]的支持。既往研究[51]对PF的组织学分析显示，93.4%的PAI-1阳性细胞为表面活性蛋白C（SP-C）阳性，而54.7%的SP-C阳性细胞为PAI-1阳性。更具体地说，靶向诱导AT2细胞损伤会显著增加肺组织中PAI-1的表达[45,52]。这一发现表明，衰老的AT2细胞可通过PAI-1与成纤维细胞建立直接联系。

TGF-β通路是控制成纤维细胞胶原分泌的重要信号通路[33]。早期研究[53]表明，纤维化组织中TGF-β/Smad通路的激活可上调下游基因PAI-1的表达。然而，我们的研究发现，PAI-1不仅是TGF-β的下游效应因子，也是TGF-β诱导纤维化活性的上游调节因子。具体来说，PAI-1可激活转录因子Smad2/3的磷酸化，然后转位到细胞核中，与靶基因Col1a1的启动子区域结合，调节Col1a1基因的转录，从而促进Col I的沉积（图8）。而纤维化程度的增强，会通过TGF-β通路进一步上调PAI-1的表达，从而建立起自我调节的正反馈回路。

我们的研究阐明了衰老AT2细胞与成纤维细胞之间的直接交流，系统地解释了AT2细胞分泌的PAI-1与Col I合成之间错综复杂的密切联系。这些发现为上皮功能障碍对PF的发生和发展所起的作用提供了重要证据。衰老的AT2细胞是PF的近端驱动因素和治疗靶点，未来可通过早期特异性递送抗衰老药物，靶向抑制衰老相关通路并消融衰老AT2细胞；或在肺部反复递送靶向作用PAI-1的siRNA和小分子抑制剂，以抑制Col1a1的过度合成，从而延缓或阻止PF的进展。

5 结论

肺衰老是PF的主要驱动因素。我们的研究表明，在增龄过程中，肺组织中Col I与Col III的比例呈上升趋势。Col I是ECM的重要组成部分，Col I水平的升高会显著促进PF的形成。此外，衰老的AT2细胞可通过与成纤维细胞的细胞间通信促进Col I的合成。我们的研究发现，衰老AT2细胞分泌的一种重要因子PAI-1在促进成纤维细胞合成Col1a1方面发挥着关键作用，其可通过介导TGF-β/Smad2/3通路导致Col I沉积并推动PF的发展。人类肺组织的单细胞数据库分析和组织学分析进一步证实了PAI-1与衰老过程中PF之间的密切关系。本研究提供了与年龄相关的上皮功能障碍对PF进展影响的关键证据，为临床干预提供了新的治疗靶点。

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