液滴微流控与质谱结合用于微蛋白质组学研究

李航 ,  马玉丹 ,  符荣鑫 ,  彭佳喜 ,  翟雁冰 ,  李金华 ,  徐伟 ,  胡思怡 ,  马汉彬 ,  Aaron R. Wheeler ,  张帅龙

工程（英文） ›› 2024, Vol. 43 ›› Issue (12) : 38 -56.

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工程（英文） ›› 2024, Vol. 43 ›› Issue (12) : 38 -56. DOI: 10.1016/j.eng.2024.08.018
研究论文

液滴微流控与质谱结合用于微蛋白质组学研究

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Droplet-Based Microfluidics with Mass Spectrometry for Microproteomics

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摘要

微蛋白质组学是一种通过组学分析研究小细胞群体或单细胞蛋白质表达的技术体系，对解析复杂生物系统的功能具有重要意义。然而，这一领域的研究长期面临样品损失及分析技术灵敏度不足等严峻挑战。微流控技术，尤其是液滴微流控技术，通过微型化、集成化的工作流程处理样品，为上述问题提供了理想解决方案。其优势包括样品损失少、试剂消耗低、反应时间短、操作通量高等特点。液滴微流控技术通过精确操控液体，生成独立的液滴反应单元，可在微型环境中实现复杂化学反应与生物实验流程。在此基础上，本文首先系统探讨了液滴微流控技术在芯片上的多种功能，包括细胞分选、细胞培养和样品处理。进一步，我们重点阐述了基于液滴微流控平台的单细胞质谱（MS）分析技术的最新进展，特别聚焦数字微流控（DMF）技术的创新应用。此外，本文回顾了集成式DMF-MS系统的发展现状，这些系统以高灵敏度实现了单细胞自动化、并行化的蛋白质组分析，为蛋白质研究开拓了全新技术路径。最后，本文对这一技术的应用潜力及其未来发展趋势进行了前瞻性分析。

Abstract

Microproteomics, the profiling of protein expressions in small cell populations or individual cells, is essential for understanding complex biological systems. However, sample loss and insufficient sensitivity of analytical techniques pose severe challenges to this field. Microfluidics, particularly droplet-based microfluidics, provides an ideal approach by enabling miniaturized and integrated workflows to process samples and offers several advantages, including reduced sample loss, low reagent consumption, faster reaction times, and improved throughput. Droplet-based microfluidics manipulates droplets of fluids to function as discrete reaction units, enabling complex chemical reactions and biological workflows in a miniaturized setting. This article discusses a variety of on-chip functions of droplet-based microfluidics, including cell sorting, cell culture, and sample processing. We then highlight recent advances in the mass spectrometry (MS)-based analysis of single cells using droplet-based microfluidic platforms, including digital microfluidics (DMF). Finally, we review the integrated DMF-MS systems that enable automated and parallel proteomic profiling of single cells with high sensitivity and discuss the applications of the technology and its future perspectives.

关键词

Key words

Droplet-based microfluidics / Mass spectrometry / Microproteomics

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李航,马玉丹,符荣鑫,彭佳喜,翟雁冰,李金华,徐伟,胡思怡,马汉彬,Aaron R. Wheeler,张帅龙. 液滴微流控与质谱结合用于微蛋白质组学研究[J]. 工程（英文）, 2024, 43(12): 38-56 DOI:10.1016/j.eng.2024.08.018

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1 引言

多细胞生物由具有不同功能和表型特征的多种细胞类型组成。细胞异质性决定了复杂生物系统的功能性和适应性。了解细胞异质性对于解释细胞亚群、细胞分化以及微环境的影响至关重要[1‒2]。随着基因扩增技术的最新进展，单细胞RNA测序已经能够对单细胞的基因表达进行分析[3‒5]。然而，越来越多的研究表明，RNA丰度与蛋白质水平的相关性较低，表明转录组图谱仅展示了细胞表型特征的部分图像[6‒7]。为了阐明基因翻译过程中的缺失推理，同时全面了解蛋白质水平的细胞异质性，单细胞蛋白质组学分析是近年研究的热门课题。由于扩增方法不适用于蛋白质，因此蛋白质组学测量在很大程度上依赖于仪器的灵敏度和技术工作流程。目前，单细胞蛋白质组分析通常采用基于标记抗体的靶向方法来解析分子[8‒9]，如质谱流式细胞术[10‒11]、单细胞条码芯片[12‒13]以及单细胞蛋白质印迹法[14‒16]。这类方法仅能对目标蛋白质进行有限的定性及定量检测（通常识别蛋白质种类< 100），但质谱（MS）技术的革新正逐步突破这一数量限制，显著提升检测范围。

质谱是一种强大的蛋白质分析工具，具有高灵敏度、高特异性和高准确性[17‒18]。然而，由于处理步骤中大量的样品损失，传统的蛋白质组学方法在分析小细胞群体时遇到了挑战。研究人员致力于通过减少非特异性吸附、开发小型化采样平台及简化操作流程，持续探索降低样本损耗的策略[19‒20]。微流控技术因其微型反应体系特性，为上述目标提供了理想解决方案，其不仅能有效减少样本损失，更显著提升了样品前处理的集成度与自动化程度[21]。

微流控技术依托微机电系统（MEMS）的技术革新，历经数十年发展已涵盖多种工艺路径，旨在精密构建微尺度流体通道与复杂结构。MEMS中的光刻技术采用紫外线掩膜曝光工艺，通过将精确图案蚀刻于基底，为微流控器件的高精度几何结构提供基础。软光刻技术利用弹性树脂材料[如聚二甲基硅氧烷（PDMS）]复刻图案，显著简化了功能化器件的制备流程。其他制造方法包括热压印和注塑成型，这些方法适用于规模化生产。此外，三维（3D）打印技术针对复杂三维流道与特殊拓扑结构，其快速成型特性助力科研与工程中的原型开发。上述技术推动了微流控系统与电子、机械模块的多功能集成，从而赋能生物分子检测、化学合成等跨领域前沿应用的技术需求[22]。

微流控技术提供了精确的流体操控能力，并能够在单个芯片上集成多个分析步骤。微流控的技术优势包括减少样品和试剂消耗、加快反应时间，以及提高通量[23]。微型化反应体系显著降低样品与试剂消耗量，进而减小样本与容器接触面以降低非特异性表面吸附，实现反应效率提升。此外，在单个芯片上连续操作消除了在容器之间转移样品的需求，从而降低了过程中样品损失的可能性。另外，并行操作为单细胞级的高通量分析处理提供了技术基础，并系统性提升分析效率。液滴微流控技术作为一项核心技术，能够在微尺度腔室内操控从几飞升到几微升的离散液滴[23‒24]。通过精密控制液滴生成的尺寸、空间定位及内容物组分，该技术构建了研究复杂化学生物反应的理想实验平台，其中液滴作为独立反应单元，高度适配小体积、高复用率的实验需求[24‒26]。液滴微流控技术在蛋白质组学领域有着广泛的应用，包括单细胞中的分析物提取、蛋白质富集、免疫置换、免疫富集、蛋白质样本流程化处理等。尤其是，液滴微流控与质谱技术的成功集成已应用于单细胞蛋白质组学（SCP）研究[27‒28]。

本文（图1）首先系统介绍了液滴微流控技术及其在生物分析中的功能，包括细胞培养、单细胞分离、细胞操作以及样品预处理和富集。进一步，本文重点阐述了基于质谱的单细胞蛋白质组分析的最新进展，介绍了液滴微流控技术的发展，特别聚焦数字微流控（DMF）的创新应用。本文回顾了集成式DMF-MS系统的发展现状，这些系统以高灵敏度实现了单细胞自动化、并行化的蛋白质组分析，为蛋白质研究开拓了全新技术路径。最后，本文总结了微蛋白质组学在生物学研究中的应用，并前瞻性展望了集成微流控-质谱技术在生物学研究和临床应用中的应用潜力和发展趋势。

2 液滴微流控技术及其在生物分析中的作用

2.1 微流控中的液滴生成及主要平台

在液滴微流控技术中，液滴的形成通常依赖于对液-液界面施加剪切力，该力可通过流体动力学的被动调控或外部电源的主动控制实现[29]。如图2（a）~（d）所示[30‒31]，采用被动驱动方法时，两种互不相溶的流体在微通道交汇处相遇，其几何结构的限制作用确保了液滴从连续相中的分离。在此过程中，流体表面张力与通道壁的润湿性共同调控液滴形成：离散相因薄层连续相的隔离不直接接触通道壁，而连续相（常作为载流体）优先润湿通道表面[30]。被动分液的驱动力通过特定微通道结构产生，包括T型接头[32‒33]、Y型接头[34]、共流模式[35]、流聚焦[36‒37]以及交叉聚焦流[38]等经典方案。流体行为由无量纲参数主导，这些参数与流体物性、流动条件及设备几何结构密切相关[26]。例如，Zhu等[39]开发的顺序操作液滴阵列（SODA）系统是一种经典的液滴微流控平台，它使用毛细探针进行精确的液体计量和处理，使用微液滴阵列芯片进行系统的液滴加载，并使用复杂的控制单元进行精准定位。该系统能够灵活地操纵从纳升到皮升范围的液滴，从而简化复杂的液滴管理任务，而这些任务对于单细胞分析和高通量药物筛选至关重要。基于SODA系统，已成功开发了几种用于SCP的纳升级液滴微流控系统。典型的方法包括用于痕量样品处理的一锅法纳升级液滴处理（nanoPOTS）平台[40]。该系统能够在纳升级液滴内处理和制备痕量生物样品，显著增强了质谱分析中低丰度生物分子的检测能力。

在主动驱动的微流控技术[如基于介电材料上电润湿（EWOD）效应的DMF技术[41‒43]，见图2（e）和（f）]的背景下，外力直接激活或辅助生成液滴[31]。根据能量来源，液滴微流控系统可分为电动[31,44‒45]、热动[46‒47]、磁动[48]和机械激活方法[49]。此外，液滴可以通过使用多相结构的多重乳液产生（如圆柱形玻璃毛细管和方形玻璃管），它们共同作用以形成液滴[50]。液滴可以作为单独的微反应器用于生化分析，并且需要在生成后进行精确操控。这些操控包括分选、捕获、混合、分裂和合并，便于实现所需的芯片实验室应用。例如，分选涉及快速评估封装在液滴中的内容物，并触发流动扰动以引导感兴趣的液滴远离主流。介电泳、声学和机械分选器广泛用于控制液滴运动和分选液滴。此外，研究人员还开发了各种功能组件，如液滴捕获器[51]、同步器、稀释器[52]和混合器[53]，这些组件在各种实验工作流程中发挥重要作用。随着微加工技术的进步，具有多种集成功能的紧凑型液滴微流控芯片显示出探测复杂生物系统的巨大潜力，提供包括细胞培养、细胞分选和样品制备的功能选项，这些将在后续章节中详细介绍。特别是，DMF已成为一种创新技术，可以在皮升至纳升范围内精确且灵活地操纵液滴或颗粒[54‒57]。通过使用电极阵列，DMF实现了对单个液滴的可编程控制[58]。

DMF和基于流动的液滴微流控技术都是灵活操控微米级到纳米级流体液滴的方法。DMF基于EWOD原理运行，可以处理微升到纳升规模的相对较大的液滴，为复杂的多步测定提供精确控制，其通量由电极阵列配置决定。相比之下，基于流动的系统通过被动控制（如T形接头和流动聚焦的机制的流体动力学流动），在高频率下产生范围从纳升到皮升的更小、高度均匀的液滴。由于液滴流动的线性特性，它们通常支持更简单的测定。因此，在DMF和基于流动的液滴微流控技术之间的选择取决于测定复杂性和通量之间所需的平衡。

2.2 细胞培养

体外细胞培养方法通常会维持大量细胞，这可能掩盖微环境因素的影响以及细胞自身多样性。常规的体外细胞培养需要在培养瓶中进行烦琐的、经验依赖性的且单调的液体处理，以提供细胞生长所需的营养物质。新兴的微流控系统通过自动化处理过程（如以受控速率精确进料，这是使用传统方法很难实现的）彻底改变了传统方案。在液滴微流控系统中，细胞被封装在单独的液滴隔室中，而营养物质和生长因子通过连续相的培养基供应。这种方法有效地减少了细胞污染的可能，并促进了空气和营养物质的交换。细胞和微生物都可以在液滴微流控芯片中培养，其活力和状态易于监测和评估[30,59‒61]。这种方法的优势还有试剂使用量低，以及能够高通量筛选异源细胞。例如，Mazutis等[62]开发了一种用于高通量细胞筛选的模块化液滴微流控系统，如图3（a）所示。将单个细胞与试剂一起封装在皮升液滴中，在芯片外孵育，然后重新注入以进行下游分选和分析。再如，通过与珠粒共包封以触发荧光信号来筛选杂交瘤细胞的抗体分泌。微流控方法为培养和分选单细胞提供了高效灵活的液体处理。然而，研究表明，在小液滴中培养的细胞往往表现出延迟的细胞周期进展、缓慢的增殖和改变的形态[63]。因此，人们已经研究了各种方法来改善液滴生物相容性并增强细胞活力。

水凝胶液滴能够提供了仿生的天然三维环境，可模拟细胞的细胞外基质[64]。Tiemeijer等[65]将可热逆转的聚异氰酸酯水凝胶集成到液滴微流控系统中，以实现单个贴壁免疫细胞的高通量培养和分析，如图3（b）所示。水凝胶液滴允许温和地包封细胞，同时提供在受控条件下黏附和生长的三维基质。聚异氰酸酯的热响应凝胶化有助于液滴形成和细胞回收，以用于下游检测。此外，使用功能化凝胶已显示出改善细胞活力和增强抗炎极化的作用。利用上述平台分析巨噬细胞极化揭示了不同细胞表型的子集和持续的促炎性极化异质性，这些异质性在大量培养物中仍然是隐藏状态。此外，Lin等[66]报道了一种用于单个癌细胞的高通量3D培养以选择性扩增结肠直肠癌干细胞（CSC）的微流体系统，如图3（c）所示。该系统将细胞封装在单分散海藻酸盐水凝胶微液滴中。水凝胶为细胞增殖提供了三维基质，同时防止了细胞聚集。非黏附性水凝胶模拟饥饿状态以诱导非CSC细胞的凋亡。随后通过海藻酸盐液化进行脱囊后回收活球或CSC，用于下游检测（如RNA测序）。该平台成功地将高通量单细胞三维培养与可控微环境相结合，实现选择性CSC扩增和药物发现。总体而言，水凝胶液滴微流控方法提供了具有天然生物相容性和灵活相位控制的仿生三维培养基质，使其成为研究细胞功能的有前景的平台。

2.3 细胞分选与操控

除细胞培养之外，在微尺度上分离和操控单细胞的能力是液滴微流控技术在生物分析领域的另一个优势。微结构捕获技术，如流体动力学液滴和微孔系统，利用微流控结构的固有特性来限制和固定目标细胞。这些方法通过精确控制流体流动和通道几何形状来促进有效的细胞捕获和分离。相比之下，介电泳、光镊和声镊等利用外力来捕获和操纵细胞。这些方法通过控制细胞的运动和位置大大提高了细胞分选的效率[67‒68]。例如，Khajvand等[69]创建了一种集成微芯片，用于单细胞水平的多重细胞蛋白分泌测定。该装置产生静态液滴以捕获单细胞进行抗体测定，并识别来自细胞的特定分泌蛋白。它主要由一个微流控芯片和一个玻璃基板组成，芯片上有一排液滴室，玻璃基板上有四种不同的抗体来捕获蛋白质。图4（a）展示了上述芯片的工作流程，首先使用压缩空气捕获单个细胞并将其封装到液滴中，随后液滴中的细胞分泌被抗体捕获的蛋白质，最终通过基于荧光的酶联免疫吸附测定（ELISA）进行分析。

此外，Hu等[70]提出了一种基于薄膜晶体管技术[71‒72]的有源矩阵（AM）-DMF平台，可利用皮升级液滴操纵单细胞。薄膜晶体管技术可制造大规模的、可单独寻址的小型电极阵列，能够同时操纵大量从纳升级到皮升级的液滴。这种独特的功能使得系统可以使用液滴作为陷阱和容器来自动分选和移动单细胞。如图4（b）所示，该系统可以在10 s内产生多个包裹有单细胞的液滴，无需预先制造物理微结构。更重要的是，液滴内的单细胞保持活力，并成功在芯片上培养。

此外，还存在其他类型的液滴微流控方法，用于芯片上的细胞封装、细胞转移和细胞提取[67,73]。例如，Samlali等[74]开发了一种由液滴生成器和液滴阵列组成的混合微流控装置。该装置允许通过电极和皮升液滴内的单细胞封装来操纵细胞。如图4（c）所示，实现了原位液滴生成和细胞操纵，这对于单克隆细胞系的开发非常有用。此外，Jing等[75]报道了使用液滴喷射生成器将单个癌细胞封装在皮升级液滴中，并使用基于尺寸的确定性横向位移（DLD）通道对液滴进行分选。然后使用单细胞蛋白酶测定来分析包封在液滴中的单细胞，以测量异源性基质金属蛋白酶的分泌。该平台的单细胞包封率高达78%，可直接进行单细胞酶活性分析，无需免疫染色和主动分选，这对于精准医学和肿瘤治疗的研究非常有用。总体而言，液滴微流控芯片对于细胞分离和操纵具有重要价值，能够实现高通量细胞分析、实时监测以及以高灵敏度和分辨率探索动态细胞功能[73,76]。

2.4 样品预处理与富集

生物样品的处理方式直接影响分析结果。目前，迫切需要自动化、高精度和高通量的样品处理系统。液滴微流控在样品预处理和富集中发挥着重要作用，能够实现自动化样品制备，减少生物分子分析的样品损失[77‒79]。例如，有研究报道了用于处理和提取雌二醇样品的数字微流控平台[80]。如图5（a）所示，该芯片包含五个储液电极，其中四个专用于原始样品、裂解溶剂、极性提取溶剂和非极性提取溶剂。第五个电极储液槽作为处理后样品的收集点。通过在特定电极上施加偏置电压来精确调控单个液滴的移动和传输。使用该芯片可以提高样品提取的重复性和准确性。此外，在图5（b）所示的集成微流控芯片中[81]，使用喷墨细胞打印技术将单细胞封装在液滴中，然后将其转移到介电泳通道中。捕获的单细胞被操控到液滴内的受限区域，然后通过Y型结构分离以去除干扰的培养基。由此产生的较小液滴，每个液滴含有一个单细胞，被运输到接口并被合并用于质谱分析，从而实现自动化的单细胞封装和分析。

各种液滴微流控装置已证明其在生物分析中的实用性。然而，仍需要一个能够适应不同应用的多功能平台。Zhu等[39]介绍了SODA系统，该系统实现了纳升级到皮升级液滴的自动化和灵活操控。如图5（c）所示，SODA系统包括毛细探针、微液滴阵列芯片和移动控制单元。通过吸取-沉积-移动（ADM）的联合操作，SODA系统能够执行复杂的液滴处理任务，如组装、融合、转移、寻址和捕获。在单细胞逆转录定量聚合酶链反应（PCR）测试中，SODA系统有效地执行了包括单细胞封装、热裂解、逆转录和检测在内的连续样品处理步骤。对于药物筛选，SODA系统可以配置成专用于酶测定的高密度纳升级液滴阵列。这种设置实现了酶抑制测定所需的多个步骤的自动化，如添加酶溶液、进行孵育和引入底物。因此，它显著减少了样品和试剂的消耗。SODA系统的强大功能为超低样品处理和小体积样品的精确分析开辟了新的途径[82‒83]。

3 液滴微流控与质谱的结合

3.1 质谱技术在微蛋白质组学中的进展

自从SCP技术在Nature Methods上发表以来[84]，该新兴领域的新技术发展迅速。这些方法大致可以分为两大主要策略：①通过减少样品损失或提高仪器灵敏度来增强单个细胞的蛋白质覆盖率；②通过利用并行化、自动化和先进的微流控技术提高通量，以有效地并行分析数千个单个细胞。

为减少样品损失，人们已经开发了一系列蛋白质组学平台用于表征来自小样品的蛋白质（如< 1000个细胞），通过将细胞裂解、消化或去污剂处理整合在一个紧凑和小型化的装置中，来减少转移过程中样品的损失。典型的系统包括集成蛋白质组分析设备（iPAD）-100 [85]、单锅固相增强样品制备（SP3）[86]、微型过滤辅助样品制备[87]、倾斜形状尖端反应器[88]、简单集成的基于自旋尖端的蛋白质组学技术[89]，以及用于痕量样品的单锅自动制备（autoPOTS）[90]。同时引入了油包水滴消化（WinO）方法，通过最小化表面接触和增强消化，来处理悬浮在乙酸乙酯油中的水滴中的细胞。与传统的溶液消化法相比，上述方法可将蛋白质和肽的回收率提高约10倍[91]。

蛋白质组学分析的仪器灵敏度由分离步骤和质量分析仪共同决定。Zhu等[92]证明，使用窄纳米柱进行低流速洗脱的液相色谱（LC）分离可以显著增强信号，从而提高蛋白质组覆盖率。离子淌度分离的耦合提供了碰撞截面的额外结构信息，有助于蛋白质鉴定[93]。优化质谱参数的策略，如增加自动增益控制（AGC）和延长离子注入时间，也可以改善最终结果[94]。此外，两种先进技术的集成，即捕获离子淌度谱-飞行时间（TIMS-TOF）[95]和高场非对称波形离子淌度谱（FAIMS）[96]，通过结合超高分辨率分离提高了揭示细胞异质性的识别能力。新的数据采集策略，如数据非依赖性采集、基于深度学习的保留时间预测和仅MS 1采集[97]，也已被报道用于数量有限的小样本快速和深入的蛋白质组学分析。基于如超灵敏MS的真SCP（T-SCP）工作流程，结合微型样品制备、极低流速色谱法的具有高灵敏度的新型集成型捕获离子淌度质谱仪平台，能够对每个单细胞超过1000种蛋白质进行稳定定量，并能通过分析超过400个单细胞来分析对药物扰动的生物反应。由此产生的蛋白质组学数据显示，尽管受到干扰，跨细胞的“核心蛋白质组”仍然保持稳定，这与单细胞转录组中观察到的较大变化形成鲜明对比[95]。

提高蛋白质组学通量的典型方法包括多重单细胞蛋白质组学（SCoPE）法[98‒101]。Budnik等[98]和Petelski等[100]开发了一种策略，使用串联质谱标签（TMT）标记来自单细胞的肽，同时使用更大的“载体”蛋白质组来提高鉴定率。然后将这些标记的肽合并后通过LC-MS/MS分析。载体蛋白质组提高了肽鉴定率，而TMT实现了单细胞间蛋白质的相对定量。合并多个样本进一步降低了检测过程中样本丢失的风险。基于这些先进的特点，这种TMT载体方法已成功应用于单个细胞中磷蛋白和N-糖肽的定量[94,102]。

3.2 基于独立分配技术的液滴微流控

独立分配技术是指使用自动化模块化单元（如注射泵、液滴微流控和声学液滴喷射）来精确分配从纳升到微升体积的流体的方法。这些技术可实现准确且无污染的液体处理，这对于许多科学和工业应用至关重要。液滴微流控技术在小型化和集成化方面具有竞争力，以高度并行的方式促进对来自单个细胞的有限输入样品进行蛋白质组学分析。近年来，液滴微流控技术通过高精度和高通量操纵细胞封装的液滴而开辟了新的发展方向。这种创新方法可以对反应条件进行卓越控制，提高了灵敏度并减少了样品损失。一个典型的例子是nanoPOTS [40]及其多功能版本。通过将采样体积减小到小于200 nL，可以最大限度地减少表面吸附引起的样品损失，并提高酶消化速率。该系统与LC-MS结合，能够通过Match Between Runs算法，从约10个细胞中一致地鉴定出3000多种蛋白质，如图6（a）和（b）所示。此外，Zhu等[103]使用荧光激活细胞分选（FACS）将细胞放入定制的nanoPOTS芯片中，并使用nanoLC-MS平均从单个HeLa细胞中鉴定出670个蛋白质组。该方法还能够根据蛋白质组表达对人肺原代细胞进行分型鉴别。

nanoPOTS的多功能版本之一是蛋白质定量平台，该平台基于nanoPOTS的改进增强，以放大具有同位素标记的信号（iBASIL）策略[94]，如图6（c）所示。该策略可精确定量FACS分选的单细胞中的1500个蛋白质组，并支持100的增强样本（B/S）比，从而实现用iBASIL进行单细胞蛋白质组分析。较高的B/S比可导致蛋白质组覆盖率的增强，但会增加可量化蛋白质的损失，如图6（d）所示。此外，Dou等[104]将微流控纳米液滴与TMT同位素标记相结合，探测单细胞的蛋白质组。通过多重分析获得了更高的通量，该策略可以在两天内从72个独立的小鼠细胞中鉴定出超过2300种蛋白质。另一种类型的nanoPOTS是一种自动化蛋白质组学成像平台[105]，集成了激光捕获显微切割（LCM）、自动化样品运输装置和nanoPOTS，图6（e）展示了其典型的工作流程。如图6（f）所示，在小鼠子宫组织切片中，以100 µm的空间分辨率定量绘制了超过2000种蛋白质。该系统可以可视化细胞类型特异性蛋白质组的改变，从而深入了解子宫蛋白质的空间分布和异质性。

此外，Woo等[106]还提出了用于高通量和流线型SCP的嵌套nanoPOTS（N2）芯片。N2芯片将采样体积减小至小于30 nL，将芯片容量提高至240个细胞，并简化了TMT标记步骤。图6（g-i）显示了用于TMT的具有嵌套结构和由亲水环环绕的九个纳米孔的芯片结构。SCP工作流程如图6（g-ii）所示。该平台已被证明对于定量来自三种不同细胞系的约1500种蛋白质组具有良好的灵敏度，并在图6（g-iii）展示了所鉴定蛋白质的分布。该平台在探测肿瘤异质性和细胞分化方面显示出巨大潜力。此外，最近开发的双柱纳流液相色谱（nanoflow LC）系统能够使用nanoPOTS工作流程，每天分析超过200个癌细胞[107]。该系统在两个并行子系统之间多路复用样品加载、在线分离和柱再生。使用优化的设置和基于MS1的特征映射，该平台在15 min的循环内识别出每个细胞约660种蛋白质，在30 min的循环内识别出每个细胞约990种蛋白质。该平台展示了每天分析数百个单细胞的潜力，具有广泛的蛋白质组覆盖范围。

另一种基于SODA的微流控装置是纳升级液滴三明治型微芯片——油-气-液滴（OAD）芯片[108]，该芯片提供了用于多步预处理的原位微反应器。首先引入空气以将液滴与覆盖的油隔离，随后油层形成封闭的腔室以保护样品液滴免于蒸发。捕获的细胞被裂解，然后释放的蛋白质在液滴中被还原、烷基化和消化，如图7（a）~（c）所示。通过与LC-MS集成，该系统能够最大限度地减少样品损失和提高效率并对小细胞群体进行蛋白质组分析。从单个小鼠卵母细胞中已鉴定出超过355个蛋白质组。

这些液滴微流控平台结合MS已经显著推进了SCP。尽管蛋白质是生物系统的基石，但翻译后修饰和代谢产物在调控分子功能和信号通路中也起着至关重要的作用。最近，有研究报道了一种基于微孔芯片的策略[109]，用于同时表征蛋白质和代谢物，如图7（d）所示。对微孔内表面进行改性以依次提取代谢物和蛋白质。通过采用数据独立采集（DIA）-MS方法，该平台能够识别超过1200种蛋白质、超过130种注释的代谢物和大规模磷酸化数据集。总体而言，液滴微流控平台便于在单个微芯片中进行多步样品制备并减少采样体积，从而减少样品损失、提高灵敏度并提高蛋白质组学深度分析的通量。

3.3 DMF

多功能DMF平台已经实现多种应用，包括快速化学反应监测[110]、蛋白质提取和纯化[77]以及用于MS的蛋白质组学样品制备[111‒112]。例如，Jebrail等[113]通过将DMF与微通道纳米电喷雾电离（nanoESI）结合来对干血斑提取的氨基酸进行定量分析。他们研究了离线和在线DMF与MS的集成，为生物学研究的进一步发展奠定了基础[114‒116]

近年来，DMF已被用于使用少量输入样本制备基于MS的蛋白质组学样本。例如，Leipert等[117]展示了首个用于蛋白质组样品制备的DMF策略，并建立了标准工作流程。如图8（a）所示，引入SP3步骤以通过磁珠去除聚合物去污剂来进行蛋白质清理。然后优化去污剂-缓冲液系统，使其完全兼容DMF芯片以及下游消化和LC-MS分析，如图8（b）所示[117]。DMF-SP3方法与MS结合，可从100个Jurkat T细胞中鉴定出约1200种蛋白质，在分析有限的生物材料时表现出良好的灵敏度。此外，Chan等[118]还报道了一种用于分析组织活检的DMF微量蛋白质组工作流程，表明了DMF在临床应用中的潜在用途。

此外，人们还研究了DMF-SP3-MS的定量能力。研究人员为了实现用于多重定量的同量异位肽标记，测试了各种去污剂，最终确定基于麦芽糖苷的去污剂3-十二烷氧丙基-1-β-D-麦芽吡喃糖苷（DDOPM）是最理想的，它能够促进液滴移动和TMT标记，同时最大限度地减少对肽段检测的干扰，如图8（c）所示[119]。这是首种基于芯片的同位素标记定量蛋白质组学方法，能够鉴定药物治疗后表达的差异蛋白质。另一种定量蛋白质组分析方法是将DMF-MS与FAIMS耦合，如图8（d）中的DMF工作流程所示[120]。该系统能够定量单个秀丽隐杆线虫细胞中的蛋白质。此外，最近有人提出了一种基于DMF-SP3的简便一锅法样品制备策略。通过使用40%甲酸（FA）洗脱完整的蛋白质组，对单个秀丽隐杆线虫进行自上而下的蛋白质组学分析，分化的线虫蛋白质的定量结果与自下而上的方法的结果没有区别，如图8（e）所示[121]。

鉴于DMF具有精确液滴操控、高通量和微型化的优势，数字微流控单细胞组学分离（DISCO）平台也基于此而被开发出来[122]。该平台集成了DMF、激光细胞裂解和基于人工智能的图像分割与识别，用于选择感兴趣的细胞，然后采用不同的策略进行多组学分析。该DMF平台如图9（a）~（d）所示，能够支持多种处理步骤，如细胞裂解和细胞内容物收集。结合LC-MS，该平台从五个U87细胞中鉴定出了约699种蛋白质，并从单个U87细胞中鉴定出了约427种蛋白质，这些结果与当时报道的SCP方法的结果相当。最近，AM-DMF已用于MS的集成样品处理，从单个HeLa细胞中鉴定出了超过2200种蛋白质，从而为微蛋白质组学提供了一个自动化和高灵敏度的平台[123]。

因此，DMF设备为小细胞群体的高灵敏度蛋白质组学分析提供了一个自动化平台，深化了我们对细胞异质性的理解，并为复杂生物系统的分析提供了新见解。

4 集成式液滴微流控-质谱分析系统

将优化的微流控工作流程与高灵敏的MS仪器集成在一起，对于充分发挥微流控技术在蛋白质组学中的潜力至关重要。这种集成的核心是液滴内样品的区室化，液滴充当单独的微反应器，随后使用电喷雾电离等方法将其引入质谱仪。这不仅减少了处理过程中的样品损失，防止了样品间的交叉污染，还通过允许同时处理多个样品而实现高通量分析。近年来，研究人员致力于开发集成的DMF-MS系统，并且已经出现了几种具有卓越性能的先进平台。

一个典型的例子是Peng等[124]提出的一体化DMF流程。如图10（a）和（b）所示，该系统具有端到端的自动化功能，不仅能够完成整个样品处理步骤，包括蛋白质烷基化、还原和消化，还集成了直接连接到LC系统的自动化采样接口。通过二甲基标记实现痕量样品的定量。如图10（c）所示，用不同的同位素标签标记两种模型乳腺癌细胞系，从细胞中共鉴定出973种蛋白质。蛋白质组图谱还对应于癌细胞中与激素反应和细胞形态相关的几种已知蛋白质和途径。该平台在自动化采样和蛋白质组学分析方面展示出良好的能力。

最近开发的一种在线DMF-MS系统，将DMF与MS通过芯片上微喷射孔（DMF-ISHMS）偶联[125]，如图10（d）所示。这种独特的静电喷雾电离可以使小部分液滴通过微孔，相应的质谱显示化学成分。这种系统因为起始物质和产物被分别喷射以进行追踪，而有助于对化学反应进行时间依赖性监测。图10（e）展示了使用DMF-µSH-MS分析的细胞色素c及其胰蛋白酶消化产物的质谱图。集成的DMF-MS平台避免了样品转移，减少了样品损失或污染，并能够直接分析液滴样品，为痕量样品的蛋白质组学分析以及研究快速化学反应开辟了新的可能性。

此外，Williams等[126]报道了一种nanoPOTS自动进样器，该自动进样器能够自动将纳升级液滴直接注射到LC-MS系统。这一进步使SCP的全自动高通量LC-MS分析成为可能，这有助于对细胞进行详细的定量研究，包括急性髓性白血病细胞。此外，Ctortecka等[127]最近开发了一种集成微流控平台proteoCHIP，用于自动化和高通量制备单细胞蛋白质组样品，以进行多重定量分析。该微芯片利用机器人皮升级液体分配处理器，并行处理多达592个细胞。细胞直接在芯片上消化，用TMT进行多重标记，并与LC-MS自动进样器无缝集成，从而无需手动转移。该系统为深入的单细胞蛋白质组分析提供了一种高效且自动化的方法。替代的样品处理系统还包括iProChip和SciProChip，这是两种高度适用于不同细胞数量的蛋白质组学分析的平台[128]。

因此，多功能微流体装置已经证明了在MS之前进行样品预处理和富集的能力。通过将优化的微流控技术与质谱集成，研究人员可以深入了解单细胞水平上细胞异质性和相关生物过程的复杂性。集成的微流控-质谱系统极大地促进了有限样品的快速、灵敏且深入的蛋白质组学分析，为细胞生物学研究开启了新的可能性。

5 讨论

基于微流控和质谱平台的最新进展，微蛋白质组学在生物学和临床研究中表现出广泛的应用，如探测细胞差异、绘制组织蛋白质的空间分布，以及鉴定疾病诊断的生物标志物[129‒130]。这些成果不仅拓展了我们在分子水平上对细胞异质性的理解，也为精准医疗中更精确、更实用方法的建立铺平了道路。

5.1 细胞异质性

新兴的微蛋白质组学平台为在细胞水平上的组织异质性的相关研究提供了强大的工具。例如，Zhu等[40]应用nanoPOTS分析临床组织样本中分离的单个人类胰岛切片，比较来自健康供体的胰岛与来自I型糖尿病供体的胰岛。对18个单个胰岛切片的蛋白质组学分析定量了2000多种蛋白质，并揭示了304种蛋白质在糖尿病和非糖尿病胰岛的丰度存在显著差异。与I型糖尿病病理相关的关键蛋白质，如PCSK1和β-2-微球蛋白，在两个供体组之间显示出显著的丰度变化，证实了糖尿病中β细胞和免疫激活的丧失。此外，Peng等[124]应用集成的一体化DMF蛋白质组学工作流程分析了两种具有不同侵袭能力的乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231。他们使用二甲基标记对细胞系进行了定量蛋白质组学分析，差异蛋白质表达分析揭示了细胞系之间与激素反应、代谢和形态相关的差异。这些发现与以前的报道一致，通路分析进一步支持了这些功能差异。这证明了集成DMF平台对珍贵临床标本的癌症亚型分型的实用性。其他研究已经揭示了分化胚胎干细胞[98]、原代人肺细胞亚型[103]和转基因小鼠卵母细胞[131]之间存在不同的蛋白质组学谱。这些研究为组织异质性的分子基础提供了有价值的见解，并将促进未来的生物学和治疗研究。

5.2 空间蛋白质组学

空间分辨蛋白质组学通过将蛋白质组谱与细胞形态和位置相关联来保留解剖信息，揭示批量分析中模糊的关键生理信息。基于微流控的微蛋白质组学方法已经证明了它们能以更高的分辨率表征组织切片中蛋白质分布。虽然微流体起着至关重要的作用，但LCM对于详细检查组织中的蛋白质表达至关重要。LCM是一种精确的技术，在显微镜下利用激光束从异质样品中分离特定的细胞或组织区域。这种激光束通过切割靶细胞周围来切除靶细胞；或者激活黏附在细胞上的转移膜，从而促进细胞的去除。这种特异性对于获取未受污染的细胞群进行下游分子分析至关重要，可保证所得数据准确反映靶细胞，不受邻近组织的干扰[132]。例如，Zhu等[133]将LCM与nanoPOTS集成，绘制不同大鼠大脑区域的蛋白质组图谱。先将冠状切片微切割成孤立的特定目标区域，包括大脑皮层、胼胝体和尾壳核，然后将组织切片放入充满二甲基亚砜的纳米孔中。从组织切片中鉴定和定量了1000多种蛋白质，其空间分辨率低至直径为100 µm，相当于10~18个细胞。统计分析清楚地区分了三个区域上不同的蛋白质组表达。每个区域都显示出高度富集的蛋白质的特定子集，反映了特定的神经功能。这种LCM-nanoPOTS集成通过在单细胞水平上提高空间分辨率，同时实现广泛的蛋白质组覆盖，显著推进了空间分辨组织蛋白质组学。最近，LCM-nanoPOTS已被定制来表征不同组织切片内区域的蛋白质组，如乳腺癌[42]、小鼠肝脏和子宫[105,134]以及植物组织[135‒136]。

另外，Xu等[137]将最近开发的基于自旋尖端的蛋白质组学技术（SISPROT）[89]与LCM相结合，用于临床肿瘤样本的细胞类型特异性蛋白质组分析。利用这种方法，作者从0.1~5 mm2的结肠癌组织切片（厚度为10 μm）中分析了四种细胞类型的蛋白质组，包括癌细胞、肠细胞、淋巴细胞和平滑肌细胞。每种细胞类型鉴定出约500~5000种蛋白质。他们还通过在连续的10 μm间隔的切片上分析细胞类型来分析垂直蛋白质组分布，结果表明大多数蛋白质都是一致表达的，但有些蛋白质在空间距离上有波动。上述LCM-SISPROT方法能够从微小的临床标本中对肿瘤微环境进行空间细胞类型蛋白质组分析。组织蛋白质组的空间分析使得能够以二维（2D）和3D方式详细研究分子景观。进一步将空间蛋白质组学与多组学分析相结合，如转录物[138]和代谢物[139‒140]，将有可能提供组织功能的多模态、系统水平视图。

5.3 生物标志物发现

微蛋白质组学的进步已经使人们能够发现可能反映细胞状态的分子，揭示临床预后指标，并确定治疗靶点。例如，Stutzmann等[130]最近回顾了用于分离和表征免疫肽的微流控-质谱方法的进展。已建立的PeptiCHIP和CHIP-IP系统可以识别来自膀胱和肾细胞肿瘤的人类白细胞抗原（HLA）相关肽[141‒142]。他们还设想，微蛋白质组学平台（如nanoPOTS和一体式DMF），可以适用于HLA肽的定量研究。随着肿瘤特异性抗原在癌症免疫治疗中变得越来越重要，基于微流控的微蛋白质组学有可能通过深入表征HLA肽来做出贡献。这项新兴技术对于未来个性化癌症治疗（如嵌合抗原受体T细胞疗法）的发展有很大的助力。

6 结论与未来展望

液滴微流控技术已成为一种强大的微蛋白质组学技术，它能够实现微型化、集成化的工作流程，对反应条件进行出色的控制，并将样品损失降至最低。近年来，在开发液滴微流控装置（如nanoPOTS和DMF平台）方面已经取得了显著进展，有助于实现蛋白质组学分析中的单个细胞的自动化、并行处理。这些微流控系统与灵敏的高分辨率质谱的无缝集成提供了一种引人注目的方法，可实现小细胞群体和单细胞的深度定量蛋白质组分析。液滴微流控技术与质谱的集成（表1）已显示出多种生物和临床应用，涵盖描绘组织中的细胞异质性和空间分布到精准医疗的生物标志物发现等多个领域。

展望未来，微流控和质谱技术的进一步发展将有助于SCP的进步。通过优化微流控工作流程和提高仪器设备分析灵敏度，可以发现起关键信号作用的低丰度蛋白质和翻译后修饰。使用同位素标记的多重策略可以在单次实验中对数千个单细胞进行谱分析。应用先进的质谱检测技术，如DIA与并行累积串联碎片（DIA-PASEF）和所有理论质谱的扫描顺序窗口采集（SWATH），可提高蛋白质组学鉴定的覆盖率和通量[143‒144]。机器学习工具可以从覆盖众多单细胞的庞大蛋白质组数据集中提取更深层次的信息。此外，新兴的制造技术，如连续流体辅助蚀刻，已经实现了与玻璃微芯片集成的单片纳米喷雾电离发射器的开发，建立了用于化学监测和有效分析的强大微流控芯片-质谱平台[145]。响应面方法优化的芯片上衍生化，结合固相萃取单元，也为微流控芯片与质谱的集成提供了一种有效的策略[146]。此外，将优化的微流控工作流程转化为临床环境也为基于单细胞蛋白质组学的诊断和治疗提供了巨大的希望[147]。例如，Chen等[89]开发了一种微柱阵列微流控装置，该装置利用精巧的制造技术，在单细胞水平上有效地从少量细胞中提取和分析蛋白质。该装置在低样品浓度下实现了高灵敏度检测，使其适用于临床环境中的大规模筛查和监测。此外，Wang等[148]设计了一种能够在癌细胞中进行多重定量蛋白质测定的微芯片，提高了诊断准确性并支持个性化治疗策略。再者，Mou等[149]开发了一种分层结构的微芯片，可以自主执行整个免疫测定过程。这些创新成功地将微流体技术与临床需求相结合，显著提高了临床诊断和治疗的效率和准确性。

尽管液滴微流控结合质谱具有很广阔的前景，但仍面临一些挑战，包括需要一种新型接口以实现高效的样品转移和电离，这是质谱中产生可靠信号的关键因素。这些过程的效率可能会受到表面化学和离子抑制等因素的影响。此外，微流体的高通量潜力可能会被微蛋白质组学中经常出现的时间密集型分离步骤所削减。为缓解这一问题，可以采用先进的分离技术，如离子迁移分离，以促进多个样品的同时处理。液滴微流控-质谱系统的持续发展和优化对于克服上述技术障碍至关重要，以释放其在生物和临床科学中广泛应用的巨大潜力。

总之，我们对液滴微流控技术，特别是DMF，与高分辨率质谱结合用于微蛋白质组学分析进行了全面综述。鉴于全球研究人员在推进这项技术方面的共同努力，我们相信这一新兴领域将持续发展，并继续为解析生物系统的复杂性提供宝贵的助力。

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