低强度振动诱导肿瘤抑制细胞生成并调节骨微环境

Engineering ›› 2024, Vol. 43 ›› Issue (12) : 210 -224. DOI: 10.1016/j.eng.2024.08.025

研究论文

熊雪 ^a^,^b^,^c ,
霍庆吉 ^a^,^b ,
崔昌鹏 ^a^,^b ,
Uma K. Aryal ^d ,
BonHeon Ku ^e ,
Chin-Suk Hong ^f ,
HeeChang Lim ^e ,
刘静 ^c^,^g ,
Andy Chen ^h ,
William R. Thompson ^g^,ⁱ^,^j ,
李柏岩 ^a ,
李雪连 ^a^,^k ,
Hiroki Yokota ^b^,^g^,ⁱ^,^l

作者信息 +

^a. Department of Pharmacology, College of Pharmacy, Harbin Medical University, Harbin 150081, China

^b. Department of Biomedical Engineering, Purdue University in Indianapolis, Indianapolis, IN 46202, USA

^c. Department of Physics and Astronomy, Purdue University, West Lafayette, IN 47907, USA

^d. Department of Comparative Pathobiology, Purdue University, West Lafayette, IN 47907, USA

^e. School of Mechanical Engineering, Pusan National University, Busan 46241, Republic of Korea

^f. Department of Mechanical Engineering, Ulsan College, Ulsan 44022, Republic of Korea

^g. Indiana University Simon Comprehensive Cancer Center, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, IN 46202, USA

^h. Department of Medical Genetics, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, IN 46202, USA

^i. Indiana Center for Musculoskeletal Health, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, IN 46202, USA

^j. Department of Physical Therapy, Indiana University, Indianapolis, IN 46202, USA

^k. Department of Breast Surgery, Harbin Medical University Cancer Hospital, Harbin Medical University, Harbin 150086, China

^l. Department of Anatomy, Cell Biology and Physiology, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, IN 46202, USA

收起

Therapeutic Insights into Low-intensity Vibration for Generating Induced Tumor-Suppressive Cells and Modulating the Bone Microenvironment

Xue Xiong ^a^,^b^,^c ,
Qingji Huo ^a^,^b ,
Changpeng Cui ^a^,^b ,
Uma K. Aryal ^d ,
BonHeon Ku ^e ,
Chin-Suk Hong ^f ,
HeeChang Lim ^e ,
Jing Liu ^c^,^g ,
Andy Chen ^h ,
William R. Thompson ^g^,ⁱ ,
Bai-Yan Li ^a ,
Xue-Lian Li ^a^,^* ,
Hiroki Yokota ^b^,^g^,ⁱ^,^* ,

Author information +

^aDepartment of Pharmacology, College of Pharmacy, Harbin Medical University, Harbin 150081, China

^bDepartment of Biomedical Engineering, Purdue University in Indianapolis, Indianapolis, IN 46202, USA

^cDepartment of Physics and Astronomy, Purdue University, West Lafayette, IN 47907, USA

^dDepartment of Comparative Pathobiology, Purdue University, West Lafayette, IN 47907, USA

^eSchool of Mechanical Engineering, Pusan National University, Busan 46241, Republic of Korea

^fDepartment of Mechanical Engineering, Ulsan College, Ulsan 44022, Republic of Korea

^gIndiana University Simon Comprehensive Cancer Center, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, IN 46202, USA

^hDepartment of Medical Genetics, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, IN 46202, USA

ⁱIndiana Center for Musculoskeletal Health, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, IN 46202, USA

^jDepartment of Physical Therapy, Indiana University, Indianapolis, IN 46202, USA

^kDepartment of Breast Surgery, Harbin Medical University Cancer Hospital, Harbin Medical University, Harbin 150086, China

^lDepartment of Anatomy, Cell Biology and Physiology, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, IN 46202, USA

E⁃mail addresses: lixuelian@hrbmu.edu.cn (X.-L. Li)

hyokota@purdue.edu (H. Yokota).

Show less

文章历史 +

Received	Accepted	Published
2024-04-29	2024-08-23
Issue Date
2024-11-18

PDF (8636K)

摘要

骨骼是乳腺癌和前列腺癌的常见转移部位。鉴于低强度振动（LIV）对促进骨骼健康和降低癌症风险的潜在能力，本文就低强度振动对癌细胞及淋巴细胞、外周血单核细胞（PBMC）等非癌细胞的影响进行研究。结果显示，低强度振动不仅抑制了癌细胞迁移，还触发了诱导肿瘤抑制（iTS）细胞生成。对PBMC进行低强度振动后，获取的条件培养基（CM）可使新鲜分离的乳腺癌和前列腺癌组织缩小。且当CM与化疗药物联用时，能观察到额外的抗肿瘤效果。值得注意的是，iTS细胞来源CM抑制了核因子κB受体活化因子配体（RANKL）刺激的骨吸收破骨细胞成熟，同时促进了骨形成的成骨细胞分化。有趣的是，只需将含有细胞的试管置于普通试管振荡器中振荡，即可重现低强度振动诱导的抗癌效果。通过基于质谱的蛋白质组学分析，本研究发现低强度振动诱导CM中烯醇化酶1、膜突蛋白（MSN）和醛缩酶A（ALDOA）等肿瘤抑制蛋白富集，这些蛋白常见于癌基因激活的iTS细胞中。作为核骨架与细胞骨架连接体（LINC）复合体的核心成分，含Sad1和UNC-84结构域的蛋白质（SUN1）蛋白表达升高，显著增强了淋巴细胞对低强度振动的反应。体外骨癌模型进一步证明了淋巴细胞来源CM的强大抗癌效果。总之，本研究强调肿瘤微环境中，低强度振动在预防骨质流失方面的关键作用。

Abstract

Bone frequently serves as a metastatic site for breast and prostate cancers. Given the potential of low-intensity vibration (LIV) to increase bone health and reduce cancer risk, this study investigated the impact of LIV on cancer cells, as well as noncancer cells such as lymphocytes and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The results revealed that LIV exposure not only suppressed cancer cell migration but also triggered the generation of induced tumor-suppressing (iTS) cells. Conditioned medium (CM) derived from LIV-treated PBMCs shrank freshly isolated breast and prostate cancer tissues, and when CM was combined with a chemotherapeutic agent, additional antitumor effects were observed. Notably, iTS cell-derived CM hindered the maturation of the receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANKL)-stimulated bone-resorbing osteoclasts while promoting the differentiation of bone-forming osteoblasts. Intriguingly, the anticancer effects induced by LIV were replicated by simply shaking a cell-containing tube with a regular tube shaker. Using mass spectrometry-based proteomics, this study revealed enrichment of tumor-suppressing proteins, including enolase 1, moesin (MSN), and aldolase A (ALDOA), which are commonly found in oncogene-activated iTS cells, in LIV-induced CM. Sad1 and UNC-84 domain containing 1 (SUN1), a core component of the linker of the nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex, exhibited heightened expression, notably enhancing the response of lymphocytes to LIV. An ex vivo bone cancer model further demonstrated the potent anticancer effects of lymphocyte-derived CM. In conclusion, this study underscores the pivotal role of LIV in preventing bone loss in the tumor microenvironment.

关键词

低强度振动 / 诱导肿瘤抑制细胞 / 淋巴细胞 / 乳腺癌 / 骨转移

Key words

Low-intensity vibrations / Induced tumor-suppressing cells / Lymphocytes / Breast cancer / Bone metastasis

引用本文

引用格式 ▾

熊雪,霍庆吉,崔昌鹏,Uma K. Aryal,BonHeon Ku,Chin-Suk Hong,HeeChang Lim,刘静,Andy Chen,William R. Thompson,李柏岩,李雪连,Hiroki Yokota. 低强度振动诱导肿瘤抑制细胞生成并调节骨微环境[J]. 工程（英文）, 2024, 43(12): 210-224 DOI:10.1016/j.eng.2024.08.025

登录浏览全文

4963

注册一个新账户忘记密码

1 引言

骨稳态协调着骨形成和骨吸收间的微妙平衡，对维持骨密度、骨强度和整体骨骼完整性至关重要[1]。此外，骨骼对一系列机械刺激具有敏感性[2]。在这些刺激中，低强度振动（LIV）作为有效治疗手段，能刺激骨重建，促进骨细胞、成骨细胞、破骨细胞和间充质干细胞（MSC）的细胞反应[3‒4]。虽然已有广泛研究证实低强度振动对骨骼健康的益处，但其对癌症进展和骨转移的影响是多方面的，尚未全部明确[5‒7]。其中一项挑战在于，了解肿瘤细胞和非肿瘤细胞对低强度振动的不同反应。振动可能直接阻碍肿瘤细胞生长，同时间接损害非肿瘤细胞并降低其肿瘤抑制能力。

本研究重点是探索低强度振动诱导非肿瘤细胞转化为肿瘤抑制细胞的潜在能力。过往研究表明，通过激活各类信号通路，如Wnt、磷酸肌醇3-激酶（PI3K）和蛋白激酶A（PKA）通路，可将肿瘤和非肿瘤细胞（包括成骨细胞、骨细胞、破骨细胞和MSC）转化为诱导肿瘤抑制（iTS）细胞[8-10]。利用之前通过基因工程和化学处理生成iTS细胞的成功经验，本实验旨在沿用上述方法，对低强度振动将淋巴细胞转化为iTS细胞的功效进行研究。

作为免疫应答的核心，淋巴细胞在对抗疾病中的发挥着关键作用[11‒12]。T淋巴细胞是恶性肿瘤免疫治疗反应的主要调节者[13]。与黏附于基层的成骨细胞和骨细胞等不同，淋巴细胞通常以悬浮状态生长。T细胞完全处于生物力学环境下，调节细胞发育[14]。在此，本研究提出一个有趣的问题：低强度振动能否将淋巴细胞和外周血单核细胞（PBMC）等悬浮细胞重编程为iTS细胞？这种生物物理效应可能意味着，免疫细胞以类似旁分泌信号方式间接调控肿瘤进展[15]。iTS细胞疗法有望完善增强癌症免疫治疗法，如嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法，在攻克与浸润性实体瘤（如乳腺癌）相关的挑战方面前景光明[16‒17]。低强度振动可扩大基于淋巴细胞的治疗干预范围，为对抗癌症提供新途径，具有深远的临床意义。

除了探索低强度振动，本文还研究了通过振荡方式机械刺激能否有效诱导淋巴细胞转化为iTS细胞。与定制振动台不同，试管振荡器是标准医学实验室的常见工具。在如此熟悉的实验室环境中利用低强度振动进行免疫细胞重编程，有助于从实验室到临床应用的无缝转化。我们的目标是通过从淋巴细胞和PBMC产生iTS细胞这一间接机制，来阻止癌细胞（尤其是乳腺癌）的进展。

为确定低强度振动驱动iTS细胞产生背后的机制，本文研究了位于核膜内、含Sad1和UNC-84结构域的蛋白质（SUN1）参与情况。SUN蛋白是核骨架与细胞骨架的连接体（LINC）复合体连接的一部分，LINC通过连接细胞核至细胞骨架实现细胞内力的传递[18‒19]。虽然，SUN1在iTS生成中的作用未被广泛认可，但基于质谱的蛋白质组学分析中可见各类肿瘤抑制蛋白无论以何种方式生成均发生富集[8,20]。这些发现对iTS细胞相关癌症治疗具有重要意义，为利用机械信号增强机体抗肿瘤能力提供了新思路。后续将通过进一步研究和临床试验证实和完善该疗法，通过提供非传统治疗途径，来助力乳腺癌骨转移患者应对挑战。

2 材料与方法

2.1 细胞培养

MDA-MB-231乳腺癌细胞（ATCC，美国）、MDA-MB-436乳腺癌细胞（ATCC）、4T1.2小鼠乳腺肿瘤细胞（澳大利亚Peter MacCallum癌症中心R. Anderson博士提供）、MC3T3-E1成骨细胞（Sigma，美国）和从C57BL/6小鼠骨髓中分离的小鼠MSC，均以DMEM为培养基。TRAMP-C2ras前列腺癌细胞（ATCC）以DMEM/F-12为培养基。PC-3人前列腺癌细胞（ATCC）、Jurkat T淋巴细胞（ATCC）和PBMC（Lonza，瑞士）以RPMI1640（Gibco，美国）为培养基。RAW264.7破骨细胞（ATCC）以αMEM为培养基。以上培养基添加10%胎牛血清（FBS）和双抗（100单位∙mL^-1青霉素和100 μg∙mL^-1链霉素；Life Technologies，美国）。所有细胞均在37 °C和5% CO₂标准条件下培养。

2.2 化学试剂和质粒转染

以顺铂（#2251; Tocris Bioscience，英国）作为阳性对照化疗药，使用甲基纤维素（#428430500; Thermo Fisher Scientific，美国）增加培养基黏度。通过质粒（#115907、#125851、#17758、#159554; Addgene，美国）实现低密度脂蛋白受体相关蛋白5（Lrp5）、SUN1、细胞原癌基因c-Myc（cMyc）及Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（K-Ras）过表达，以空质粒（FLAG-HA-pcDNA3.1; Addgene）为对照组，按厂商使用说明，经由K4转染系统（Biontex Laboratories，德国）进行转染。

2.3 低强度振动和振荡应用

贴壁细胞和悬浮细胞都在培养皿（35 mm × 10 mm）中生长，使用定制振动台进行低强度振动。主要振动条件为90 Hz，强度为0.7g（其中1g = 9.8 m∙s^-2）。将对照组细胞至于振动台上，不施加任何振动。体外实验分析中，对细胞每天进行两次低强度振动，每次20 min，间隔3 h，持续3天。值得注意的是，贴壁细胞在低强度振动后收缩，但约3 h内恢复形状。使用标准试管振荡器（ThermoMixer R; Eppendorf，德国）以800 r∙min^-1振荡悬浮细胞（Jurkat T淋巴细胞）20 min，每日2次，间隔3 h，持续3天。与标准振动台流程相比，振荡流程产生更大加速度（1.3g）。添加甲基纤维素调节培养基黏度至10 cP（黏度单位），对照组培养基黏度为0.8 cP。

2.4 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）检测和克隆形成实验

用MTT法检测细胞代谢活性，使用96孔板（Corning美国），每孔加入约2000个细胞，孵育2天后测试CM反应。测量570 nm处噻唑蓝溴化四唑（#M5655；Sigma）吸光度，对代谢活性进行量化分析。EdU检测实验中，使用96孔板，每孔加入约1000个细胞。2天后用荧光法细胞增殖检测试剂盒（Click-iT EdU Alexa Fluor 488细胞增殖成像试剂盒；Thermo Fisher Scientific）检测CM对细胞增殖的影响。对荧光标记细胞计数，计算标记细胞和总细胞之比。对于克隆生成实验，在每个35 mm培养皿（Corning）中接种约1000个细胞。细胞生长2周形成集落，之后固定集落，用Giemsa染色（#4201457; RICCA Chemical，美国），并由ImageJ（美国国立卫生研究院）进行集落定量分析。

2.5 二维运动划痕实验和Transwell侵袭实验

通过二维运动划痕实验检测细胞二维迁移行为。使用12孔板，每孔接种约4 × 10⁵个细胞。细胞附着后，使用塑料移液器吸头在细胞层内生成划痕。去除脱落细胞，注入CM。在0 h捕获无细胞划痕区图像。随后，在产生划痕后24 h测量细胞新占据的区域，用ImageJ进行量化分析。对于Transwell侵袭实验，将约5 × 10⁴个细胞悬浮在200 μL无血清DMEM中，置于上层基质胶包被细胞小室（Thermo Fisher Scientific），在下室注入800 μL CM。2天后，加入结晶紫对穿透滤膜底面的细胞进行染色。随机抓取至少5张图像，计算染色细胞平均数。

2.6 破骨细胞和成骨细胞分化实验

使用12孔板进行RAW264.7前破骨细胞分化实验。将前破骨细胞置于含40 ng∙mL^-1核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的培养基中培养6天，期间每4天更换培养基。之后，固定贴壁细胞，按厂商说明书使用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）试剂盒（Sigma）进行染色。TRAP染色阳性且细胞核数目大于3个的细胞被认为是成熟的破骨细胞，对其进行计数。以成骨细胞培养基（加入50 μg∙mL^-1抗坏血酸、10 mmol∙L^-1 β-甘油磷酸钠、10%胎牛血清和双抗）培养MC3T3成骨细胞，检测CM对成骨细胞分化的影响。每3天更换培养基，4周后固定细胞，并用茜素红染色以观察钙沉积物。

2.7 免疫印迹分析

在放射免疫沉淀法缓冲液中裂解细胞，用10%~15%十二烷基硫酸钠（SDS）凝胶分离蛋白质，再转入聚偏二氟乙烯膜（Millipore，美国）。将膜与一抗孵育过夜，再与辣根过氧化物酶标二抗（Cell Signaling，美国）孵育。使用抗体包括蜗牛家族转录抑制因子1（Snail）、p-Src、Src、醛缩酶A（ALDOA）、cleaved caspase 3、caspase 3、碱性磷酸酶（ALP）、RANKL、Lrp5、c-Myc、K-Ras、磷酸化Akt（p-Akt）、烯醇化酶1（Eno1）、膜突蛋白（MSN）、Hsp90ab1（Cell Signaling）和SUN1（Proteintech，美国），以β-肌动蛋白（Sigma）为对照组。用SuperSignal West Femto最高灵敏度化学发光底物（Thermo Fisher Scientific）对蛋白质水平进行量化分析，之后用荧光成像系统（LAS-3000；日本）分析信号强度。

2.8 离体实验

经印第安纳大学机构审查委员会批准（#1911155674），从Simon癌症中心组织采购中心获取人乳腺癌和前列腺癌组织。用手术刀将每份组织样本（约1 g）手动切成小块（长0.5~0.8 mm）。将这些切片置于DMEM（补充10%胎牛血清和双抗）中培养1天，之后补充CM培养4天，监测和记录至少4个切片的大小变化。

在离体小鼠骨骼测定中，取雌性BALB/c小鼠（10周龄）的股骨，并清除周围结缔组织。将每条股骨在骨干中部一分为二，用25号针穿孔。将悬浮于10 μL培养基的2.5 × 10⁵个4T1.2小鼠乳腺肿瘤细胞注入骨髓腔。然后，将骨骼置于2.5mL DMEM（补充10%FBS和1%双抗）培养基中并在37 °C、5% CO₂环境下培养，每天更换一半新鲜培养基。每日振动，持续两周后，对骨骼内生长的细胞进行免疫印迹分析。

2.9 基于质谱的蛋白质组学分析

按前述流程进行基于质谱的蛋白质组学分析[10]。三组Jurkat细胞来源CM，每组含三个样本，分别为对照组CM、经CW008处理的阳性对照组CM和经低强度振动处理的CM。CW008可激活PKA信号通路。保留有两个或以上串联质谱（MS/MS）匹配数且非标记定量（LFQ）大于0的蛋白质，用于下游生物信息学分析。本文采用MS/MS计数对蛋白质水平进行量化分析，并将相对丰度与未生成iTS细胞的CM对照组进行对比。

2.10 基因集富集分析（GSEA）

为了解CM下游的生物机制，本文对MS/MS结果进行了通路分析。首先，使用分位数归一化对MS/MS计数进行归一化。随后，使用线性模型确定PKA组和对照组、低强度振动组和对照组之间的相对差异蛋白质丰度。本实验采用R语言（v4.1.1）的fgsea（v1.20.0）和取自MSigDB的特征基因集进行GSEA。按排序且对数转换后log₁₀ p值进行分析，并排除平均计数小于15的蛋白质。用Benjamini-Hochberg多重比较法校正p值。由通路分析可见PKA组和低强度振动组中的几条重要通路，包括与Myc信号传导和K-Ras下调相关的基因。

2.11 有限元模态分析

为估算经低强度振动淋巴细胞的固有频率和变形模式，本实验采用前述有限元法进行模态分析[21]。借助COMSOL Multiphysics软件（v6.2; Altsoft，美国），利用无限域边界条件，假设悬浮的球形细胞建模为外部流体。我们评估了改变细胞大小（半径为5~15 μm）和杨氏模量所产生的影响。无限域假定发生振动的细胞培养基向各个方向无限延伸。

2.12 伦理声明

动物实验程序已获印第安纳大学动物护理与使用委员会批准（SC345R），且符合美国生理学会认可的《动物护理与使用指导原则》以及《欧盟动物实验指令》。人体组织使用已获印第安纳大学机构审查委员会批准（#1911155674），并遵循世界医学协会伦理准则（《赫尔辛基宣言》）。

2.13 统计分析

本研究对细胞类实验已进行3~4次独立实验，数据以平均值±标准差（SD）表示。对离体实验已进行2~3次独立实验。通过单因素方差分析（ANOVA）进行统计显著性检验。用Bonferroni校正法与对照组进行事后统计比较，p < 0.05表示具有统计学显著性差异。图中单、双星号和井号分别表示p < 0.05和p < 0.01。

3 实验结果

3.1 贴壁细胞和悬浮细胞低强度振动对比

本研究探讨了低强度振动在各种细胞类型上的应用，包括贴壁细胞（如乳腺癌和前列腺癌细胞）及悬浮细胞（如淋巴细胞和PBMC）。主要问题是，这些不同类型细胞在低强度振动条件下是否会表现出不同反应。过往涉及贴壁细胞的研究采用了10~100 Hz的振动频率，与其固有频率相似。悬浮细胞的有限元分析揭示了其独特模态，以及对杨氏模量和细胞大小的依赖[图1（a）、（b）]。半径为7.5 μm的典型淋巴细胞，固有频率范围为10~100 Hz，杨氏模量为0.001 kPa。当预期杨氏模量达1 kPa，则固有频率范围达1000~10 000 Hz。本研究初步评估了30~150 Hz频率范围内低强度振动的抑制作用[附录A图S1（a）]。MTT代谢活性检测结果显示，MDA-MB-436对90 Hz低强度振动最敏感。本研究主要采用90 Hz频率，它有效抑制了贴壁癌细胞的运动。该频率与淋巴细胞固有频率明显不同。

3.2 低强度振动对乳腺癌和前列腺癌细胞活性和迁移的影响

随后，本文研究了低强度振动对乳腺癌细胞系（MDA-MB-231和MDA-MB-436）及前列腺癌细胞系（PC-3和TRAMP）致瘤行为的影响。以90 Hz频率和0.7g强度（振幅为约7 m∙s^-2）进行低强度振动，MTT检测显示细胞活性在3天内呈降低趋势[图1（c）~（f）]。除MDA-MB-231细胞系，低强度振动对所有三种细胞系均有明显肿瘤抑制作用。细胞运动划痕分析显示，低强度振动的肿瘤抑制作用在这些细胞系中均明显体现[图1（g）、（h）；附录A图S1（b）、（c）]。此外，低强度振动使MDA-MB-436和PC-3细胞中的致癌蛋白p-Src和Snail下调，这两种蛋白会促进肿瘤细胞转移和侵袭[图1（i）、（j）]。低强度振动还诱导程序性细胞死亡的关键标志物（cleaved caspase 3）的激活。本文还探索了不同低强度振动条件对肿瘤细胞的影响。MTT检测结果显示，细胞活性抑制取决于振幅和频率[附录A图S2（a）、（d）]。有趣的是，0.7g、90 Hz低强度振动对MSC活性影响不大[附录A图S2（e）]。

3.3 经低强度振动Jurkat CM对致瘤行为的抑制作用

先前研究表明，低强度振动可将MSC转化为iTS细胞[21]。在此基础上，本文研究了经低强度振动Jurkat细胞生成iTS细胞的可行性。对Jurkat细胞进行低强度振动，每日2次，每次20 min，间隔3 h。第3天更换培养基，于24 h后收集。未经机械刺激的Jurkat来源CM未表现抗肿瘤特性，但经低强度振动的Jurkat来源CM表现出显著的肿瘤抑制能力。具体而言，经低强度振动的Jurkat来源CM的应用降低了MDA-MB-231乳腺癌细胞[图2（a）、（b）]、MDA-MB-436乳腺癌细胞[图2（c）、（d）]、PC-3前列腺癌细胞[图2（e）、（f）]和TRAMP前列腺癌细胞[图2（g）、（h）]的细胞活性（MTT检测）和迁移能力（划痕实验）。此外，经低强度振动的Jurkat CM显著降低了细胞增殖和集落形成能力（EdU检测），并抑制了MDA-MB-436和PC-3细胞的Transwell侵袭[图3（a）~（f）]。实验还检测了经低强度振动的癌细胞CM是否会影响非癌细胞。值得注意的是，MTT法检测显示经低强度振动的Jurkat细胞CM不会降低MSC存活率[图S2（f）]。

3.4 对人癌组织碎片生长的抑制作用

证明了低强度振动诱导Jurkat CM的抗肿瘤能力后，为进一步评价其抗肿瘤功效，本研究将其应用于新鲜获得的人乳腺癌组织切片（三阴性乳腺癌）和前列腺癌组织切片。在离体组织测定中，与标准培养基或未经低强度振动的CM对照组相比，经低强度振动的Jurkat CM在培养48 h和96 h后，组织碎片明显缩小[图3（g）、（h）]。

3.5 化疗药物对破骨细胞和成骨细胞分化的影响

随后，本文研究了低强度振动CM与顺铂（一种广泛用于临床治疗的化疗药物[22]）联合给药的效果。结果显示，经低强度振动的Jurkat细胞CM与顺铂联合给药时，可降低MDA-MB-231和MDA-MB-436乳腺癌细胞以及PC-3和TRAMP前列腺癌细胞的活性（MTT法检测）[图4（a）~（d）]。

鉴于乳腺癌和前列腺癌常发生骨转移，我们进一步检测了经低强度振动细胞CM对骨稳态的影响。结果发现，注入经低强度振动Jurkat细胞CM可显著抑制RANKL刺激的破骨细胞分化，造成多核（含三个以上细胞核）TRAP阳性破骨细胞数量减少[图4（e）]。此外，经低强度振动细胞CM培养MC3T3成骨细胞时，矿化钙沉积检测法（茜素红染色）显示，四周内染色强度（即矿化能力）增加[图4（f）]。有趣的是，未经低强度振动Jurkat细胞CM培养的MC3T3成骨细胞茜素红染色也明显增强，提示淋巴细胞分泌组可能无需机械刺激，即可促进成骨细胞分化。

3.6 人PBMS CM对人癌组织碎片的抑制作用

证实了低强度振动诱导Jurkat CM的抗肿瘤潜在作用后，本实验利用人外周血单核细胞（h-PBMC）来研究制备抗肿瘤CM的可能性。经低强度振动的h-PBMC CM可抑制MDA-MB-436乳腺癌细胞和PC-3前列腺癌细胞活性（MTT法）和迁移（划痕实验）[图5（a）~（d）]。随后，利用人乳腺癌（三阴性乳腺癌）和前列腺癌组织碎片评估其抗肿瘤功效。体外形态测量显示，在经低强度振动的h-PBMC CM中培养48 h和96 h后，乳腺癌组织碎片和前列腺癌组织碎片均明显缩小[图5（e）、（f）]。

3.7 通过振荡高黏度培养基生成iTS细胞

为推动机械刺激在标准实验室中的应用，本研究探索了以常规试管振荡器代替定制振动台的可能性。我们采用甲基纤维素增加CM黏度[23]。有趣的是，对悬浮于高黏度CM（10 cP）中的Jurkat细胞试管进行振荡，会产生与经低强度振动细胞CM相同的抗肿瘤效应。尽管黏度调节对MDA-MB-436细胞生长无影响[图6（a）]，但提高黏度是生成iTS细胞的必要条件。iTS细胞可产生强大的抗肿瘤活性CM，从而抵抗MDA-MB-436细胞[图6（b）、（c）]、PC-3细胞[图6（d）~（f）]及4T1.2乳腺癌细胞（附录A图S3）。

3.8 经低强度振动CM在小鼠体外模型中的肿瘤抑制效应

为进一步探究低强度振动对骨肿瘤微环境的影响，本研究进行了离体骨骼实验。取免疫功能正常的雌鼠双侧股骨，将4T1.2乳腺肿瘤细胞接种至骨髓腔。每日对骨骼进行或不进行低强度振动，持续2周。结果显示，低强度振动可降低Src磷酸化水平及Snail蛋白表达量。而骨骼内培养细胞的细胞毒性标志物cleaved caspase 3（c-Cas）水平升高。此外，碱性磷酸酶[24]表达增加，而RANKL受体[25]表达降低，说明低强度振动具有骨骼保护作用[图7（a）]。实验发现，低强度振动Jurkat细胞CM作用于MDA-MB-436乳腺癌细胞和PC-3前列腺癌细胞后，p-Src和Snail水平升高，c-Cas水平降低[图7（b）、（c）]，与前述一致。

3.9 SUN1和Lrp5对Jurkat iTS细胞CM肿瘤抑制能力的影响差异

SUNI是LINC复合体的组成部分，本实验探索了其在经低强度振动驱动生成iTS细胞中的功能。同时我们评估了Wnt信号通路受体Lrp5（流体剪切力诱导机械信号传导的对照调控因子）[图7（d）]。MTT法细胞活性分析结果显示，SUN1过表达可增强CM抗癌能力，而Lrp5过表达则无此作用[图7（e）、（f）]。针对MDA-MB-436细胞的EdU细胞增殖检测结果也支持SUN1参与低强度振动应答[图7（g）]。

3.10 基于质谱的CM蛋白质组学分析

以PKA激活为对照，本研究对低强度振动的淋巴细胞来源CM进行了基于质谱的蛋白质组学分析。为明确各类iTS细胞CM的共性，实验纳入了先前在Wnt信号[8]、PI3K信号[9]和Oct4过表达[10]中获得的蛋白质组学结果。值得注意的是，结果显示五种不同iTS细胞CM中共同富集的蛋白质数量与Wnt、PI3K、PKA、Oct4和低强度振动相关[图8（a）；附录A图S4（a）、（b）]。其中，九种蛋白质在五种CM中均高度富集，包括EEF2、PKM、PPIA、ENO1、PGAM1、MSN、FLNA、HSPA8和HSP90AB1 [图8（b）]。除经低强度振动的CM外，16种蛋白质在三种CM（PKA、PI3K和Oct4）中富集，而另一组中14种蛋白质在三种CM（Wnt、PI3K和Oct4）中表达上调[图8（c）~（e）]。上述在三至四种不同CM中共同富集的蛋白质中，已证实ENO1、MSN、HSP90AB1、ARHGDIA、ALDOA和MYH9是细胞外肿瘤抑制蛋白[9‒10,16,20]。

3.11 Myc和K-Ras可能是PKA和低强度振动的下游信号通路

我们利用全球蛋白质组学数据激活PKA并加载低强度振动，通过GSEA预测在肿瘤抑制蛋白分泌过程中活跃的信号通路（附录A图S5）。Myc信号通路的富集得分最高（低强度振动和PKA均为1.5），而K-Ras信号通路下调富集得分最低，分别为-1.81（低强度振动）和-1.88（PKA）[图9（a）]。这些预测与前述研究一致，即MSC可经由c-Myc和K-Ras过表达转化为iTS细胞[10]。

如基因集富集分析所示，与c-Myc和K-Ras的预期作用一致，低强度振动处理使Jurkat细胞中c-Myc、K-Ras和SUN1的表达水平升高[图9（b）]。此外，c-Myc和K-Ras上调使p-Akt（PI3K信号通路中的关键酶）水平升高[图9（c）]。值得注意的是，c-Myc和K-Ras过表达可诱导Jurkat细胞来源CM中Eno1、MSN、ALDOA和Hsp90ab1等肿瘤抑制蛋白水平升高[图9（d）]。最后，MTT法细胞活性检测和划痕实验检测细胞迁移的结果表明，含过表达c-Myc和K-Ras的Jurkat细胞来源CM具有肿瘤抑制潜力[图9（e）、（f）；附录A图S6]。

4 讨论

本研究提出以生物物理方式，如低强度振动和振荡，将淋巴细胞和PBMC转化为iTS细胞的方法[图9（d）]。iTS细胞来源CM表现出多方面抗癌特性，包括抑制乳腺癌和前列腺癌细胞的活性、增殖、迁移及侵袭能力，缩小人癌组织碎片，并具有显著的骨骼保护作用。值得注意的是，增加培养基黏度是通过振动实现高效转化的必要条件。LINC复合体作为核膜机械传感器，其组成蛋白SUN1在iTS细胞生成中发挥了关键作用。通过对iTS细胞CM的质谱蛋白质组学进行分析，发现无论以何种方法，包括应用低强度振动、激活PKA信号通路或上调致癌信号（c-Myc和K-Ras等），生成iTS细胞，EENO1、MSN、Hsp90ab1和ALDOA等肿瘤抑制蛋白均出现富集。

最初，iTS细胞通过激活致癌信号通路这一非常规流程实现开发[8]。因此，在五种不同iTS细胞生成法中，两条与c-Myc和K-Ras相关的信号通路成为核心要素。此外，iTS细胞可从MSC和淋巴细胞中获取，表现出其显著的多样性和共通性。尽管来自不同细胞类型，iTS细胞在Wnt、PI3K、PKA和Oct4等信号通路中体现出共性。普遍认为，增殖信号可增强细胞功能，赋予其抗癌能力。这一共同特征在五种不同iTS细胞生成法，以及MSC和淋巴细胞CM的分泌组中均有体现。

合适的低强度振动条件因预期应用而异[3,26‒27]。尽管低强度振动可有效抑制癌细胞进展，但其功效在不同细胞系中存在差异[6‒7,28]。虽然细胞活力下降并非普遍现象，但振动对细胞迁移的抑制往往表现一致。本文将低强度振动应用于淋巴细胞等非肿瘤细胞，可生成iTS细胞。值得注意的是，乳腺癌细胞等实体肿瘤细胞通常贴壁生长，而淋巴细胞则保持悬浮状态。本研究采用90 Hz低强度振动，处于贴壁细胞自然频率范围[21]；而淋巴细胞自然频率可因细胞大小和杨氏模量的不同，在10 Pa~1 kPa范围内呈显著变化[29]，这增加了确定适合淋巴细胞频率的挑战性。此外，3天低强度振动组实验效果明显高于单日低强度振动组，可能是CM中肿瘤抑制蛋白积累所致。另外，当细胞处于悬浮状态，培养基促进了低强度振动响应的附加质量，而黏度则是关键因素。后续研究将进一步说明振动频率依赖性，并确定淋巴细胞生成iTS细胞的合适频率。

制定骨转移（尤其是乳腺癌相关骨转移）治疗方案时，必须针对几个目标，包括阻止肿瘤进展和预防骨丢失[30]。淋巴细胞来源CM有三个关键功能：抗癌活性、抗骨吸收特性以及促进骨形成。其功能多样性使iTS细胞成为颇有前景的治疗干预候选细胞，尤其适用于乳腺癌相关的骨转移。

另一项极具前景的应用领域为CAR T细胞免疫治疗。CAR T细胞是经基因工程改造的抗原，精准靶向作用特定癌细胞[31‒32]。经证实，CAR T细胞疗法对治疗血液系统恶性肿瘤疗效显著。然而，其在实体肿瘤中疗效仍有局限性，主要原因在于难以筛选合适的CAR，以及对实体瘤组织实现充分浸润存在挑战[33‒35]。利用iTS细胞特性可增强CAR T细胞疗法的效果。例如，iTS细胞活性物质的全身性抗癌效果，可与CAR T细胞的靶向治疗方式产生协同作用。值得注意的是，iTS细胞可分泌肿瘤抑制蛋白，无需直接接触肿瘤细胞，这是CAR T细胞不具备的特性。此外，iTS细胞具有抗骨吸收和促进骨形成能力，也是区别于CAR T细胞的独有特征。

研究表明，细胞核是一个重要的机械感受细胞器[36]。低强度振动信号传导需要细胞核与细胞骨架之间的连接，而这一过程由LINC复合体推动[36‒37]。在LINC复合体中，SUN蛋白建立肌动蛋白细胞骨架与细胞核的连接[38]。有研究显示，LINC复合体参与调控癌细胞对低强度振动的响应；SUN1和SUN2缺失会削弱低强度振动对细胞硬度的影响[6]。因siRNA介导的SUN1和SUN2缺失而干扰LINC复合体功能后，非肿瘤细胞[39]和乳腺癌细胞[6]的机械反应性均有所降低。本文对SUN1作为机械信号放大器生成振动诱导iTS细胞进行评估。然而，影响流体剪切应力反应的膜受体蛋白Lrp5并未充当介质。

本研究存在若干局限性：人体骨骼细胞所处的力学环境极为复杂，包括淋巴细胞、MSC、成骨细胞和骨细胞等不同细胞类型，可能对生物物理刺激产生不同反应[40‒42]；此外，骨微环境复杂，由胶原基质和羟基磷灰石基质构成，可能影响细胞对低强度振动的响应；但值得注意的是，淋巴细胞向振动诱导iTS细胞转化，在标准实验室条件下即可完成。综上所述，获取乳腺癌或前列腺癌患者的淋巴细胞和PBMC有助于癌症治疗应用。淋巴细胞向iTS细胞的转化及其功能多样性，为提升当前乳腺癌骨转移治疗效果提供了广阔前景。此外，这一突破有望增强CAR T细胞免疫治疗效果，体现了癌症治疗方案的重大进步。这些发展标志着攻克癌症新手段的出现，为更有效、更精准的治疗干预带来了新的希望。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

[1]	Courpron P, Meunier P, Vignon G. Dynamics of bone remodeling explained by Harold Frost. Theory of the B. M.U. Nouv Presse Med 1975;4(6):421‒4.

[2]	Wang L, You X, Zhang L, Zhang C, Zou W. Mechanical regulation of bone remodeling. Bone Res 2022;10(1):16. . 10.1038/s41413-022-00190-4

[3]	Lau E, Al-Dujaili S, Guenther A, Liu D, Wang L, You L. Effect of low-magnitude, high-frequency vibration on osteocytes in the regulation of osteoclasts. Bone 2010;46(6):1508‒15. . 10.1016/j.bone.2010.02.031

[4]	Sun Y, Wan B, Wang R, Zhang B, Luo P, Wang D, et al. Mechanical stimulation on mesenchymal stem cells and surrounding microenvironments in bone regeneration: regulations and applications. Front Cell Dev Biol 2022;10:808303. . 10.3389/fcell.2022.808303

[5]	Patton DM, Bigelow EMR, Schlecht SH, Kohn DH, Bredbenner TL, Jepsen KJ. The relationship between whole bone stiffness and strength is age and sex dependent. J Biomech 2019;83:125‒33. . 10.1016/j.jbiomech.2018.11.030

[6]	Yi X, Wright LE, Pagnotti GM, Uzer G, Powell KM, Wallace JM, et al. Mechanical suppression of breast cancer cell invasion and paracrine signaling to osteoclasts requires nucleo-cytoskeletal connectivity. Bone Res 2020;8(1):40. . 10.1038/s41413-020-00111-3

[7]	Song X, Lin CY, Mei X, Wang L, You L. Reduction of breast cancer extravasation via vibration activated osteocyte regulation. Science 2022;25(12):105500. . 10.1016/j.isci.2022.105500

[8]	Liu S, Sun X, Li K, Zha R, Feng Y, Sano T, et al. Generation of the tumor-suppressive secretome from tumor cells. Theranostics 2021;11(17):8517‒34. . 10.7150/thno.61006

[9]	Sun X, Li K, Aryal UK, Li BY, Yokota H. PI3K-activated MSC proteomes inhibit mammary tumors via Hsp90ab1 and Myh9. Mol Ther Oncolytics 2022;26:360‒71. . 10.1016/j.omto.2022.08.003

[10]	Li K, Sun X, Zha R, Liu S, Feng Y, Sano T, et al. Counterintuitive production of tumor-suppressive secretomes from Oct4- and c-Myc-overexpressing tumor cells and MSCs. Theranostics 2022;12(7):3084‒103. . 10.7150/thno.70549

[11]	Waldman AD, Fritz JM, Lenardo MJ. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nat Rev Immunol 2020;20(11):651‒68. . 10.1038/s41577-020-0306-5

[12]	Decker WK, da Silva RF, Sanabria MH, Angelo LS, Guimaraes F, Burt BM, et al. Cancer immunotherapy: historical perspective of a clinical revolution and emerging preclinical animal models. Front Immunol 2017;8:829. . 10.3389/fimmu.2017.00829

[13]	Leko V, Rosenberg SA. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell 2020;38(4):454‒72. . 10.1016/j.ccell.2020.07.013

[14]	Lei K, Kurum A, Tang L. Mechanical immunoengineering of T cells for therapeutic applications. Acc Chem Res 2020;53(12):2777‒90. . 10.1021/acs.accounts.0c00486

[15]	Huse M. Mechanical forces in the immune system. Nat Rev Immunol 2017;17(11):679‒90. . 10.1038/nri.2017.74

[16]	Li K, Sun X, Li H, Ma H, Zhou M, Minami K, et al. Suppression of osteosarcoma progression by engineered lymphocyte-derived proteomes. Genes Dis 2023;10(4):1641‒56. . 10.1016/j.gendis.2022.08.007

[17]	Li K, Sun X, Minami K, Tamari K, Ogawa K, Li H, et al. Proteomes from AMPK-inhibited peripheral blood mononuclear cells suppress the progression of breast cancer and bone metastasis. Theranostics 2023;13(4):1247‒63. . 10.7150/thno.80294

[18]	Lombardi ML, Lammerding J. Keeping the LINC: the importance of nucleocytoskeletal coupling in intracellular force transmission and cellular function. Biochem Soc Trans 2011;39(6):1729‒34. . 10.1042/bst20110686

[19]	Liu Q, Pante N, Misteli T, Elsagga M, Crisp M, Hodzic D, et al. Functional association of Sun1 with nuclear pore complexes. J Cell Biol 2007;178(5):785‒98. . 10.1083/jcb.200704108

[20]	Sun X, Li K, Zha R, Liu S, Fan Y, Wu D, et al. Preventing tumor progression to the bone by induced tumor-suppressing MSCs. Theranostics 2021;11(11):5143‒59. . 10.7150/thno.58779

[21]	Xiong X, Huo Q, Li K, Cui C, Chang C, Park C, et al. Enhancing anti-tumor potential: low-intensity vibration suppresses osteosarcoma progression and augments MSCs’ tumor-suppressive abilities. Theranostics 2024;14(4):1430‒49. . 10.7150/thno.90945

[22]	Dasari S, Njiki S, Mbemi A, Yedjou CG, Tchounwou PB. Pharmacological effects of cisplatin combination with natural products in cancer chemotherapy. Int J Mol Sci 2022;23(3):1532. . 10.3390/ijms23031532

[23]	Tao F, Kitamura K, Hanada S, Sugimoto K, Furihata T, Kojima N. Rapid and stable formation method of human astrocyte spheroid in a high viscous methylcellulose medium and its functional advantages. Bioengineering 2023;10(3):349. . 10.3390/bioengineering10030349

[24]	Vimalraj S. Alkaline phosphatase: structure, expression and its function in bone mineralization. Gene 2020;754:144855. . 10.1016/j.gene.2020.144855

[25]	Boyce BF, Xing L. Biology of RANK, RANKL, and osteoprotegerin. Arthritis Res Ther 2007;9():S1. . 10.1186/ar2165

[26]	Pagnotti GM, Adler BJ, Green DE, Chan ME, Frechette DM, Shroyer KR, et al. Low magnitude mechanical signals mitigate osteopenia without compromising longevity in an aged murine model of spontaneous granulosa cell ovarian cancer. Bone 2012;51(3):570‒7. . 10.1016/j.bone.2012.05.004

[27]	Pagnotti GM, Chan ME, Adler BJ, Shroyer KR, Rubin J, Bain SD, et al. Low intensity vibration mitigates tumor progression and protects bone quantity and quality in a murine model of myeloma. Bone 2016;90:69‒79. . 10.1016/j.bone.2016.05.014

[28]	Olcum M, Ozcivici E. Daily application of low magnitude mechanical stimulus inhibits the growth of MDA-MB-231 breast cancer cells in vitro . Cancer Cell Int 2014;14(1):102. . 10.1186/s12935-014-0102-z

[29]	Bufi N, Saitakis M, Dogniaux S, Buschinger O, Bohineust A, Richert A, et al. Human primary immune cells exhibit distinct mechanical properties that are modified by inflammation. Biophys J 2015;108(9):2181‒90. . 10.1016/j.bpj.2015.03.047

[30]	Irshad I, Varamini P. Different targeting strategies for treating breast cancer bone metastases. Curr Pharm Des 2018;24(28):3320‒31. . 10.2174/1381612824666180619165728

[31]

Eshhar Z, Waks T, Gross G, Schindler DG. Specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-binding domains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and T-cell receptors. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90(2):720‒4. . 10.1073/pnas.90.2.720

[32]	Marofi F, Motavalli R, Safonov VA, Thangavelu L, Yumashev AV, Alexander M, et al. CAR T cells in solid tumors: challenges and opportunities. Stem Cell Res Ther 2021;12(1):81. . 10.1186/s13287-020-02128-1

[33]	Gumber D, Wang LD. Improving CAR-T immunotherapy: overcoming the challenges of T cell exhaustion. EBioMedicine 2022;77:103941. . 10.1016/j.ebiom.2022.103941

[34]	Majzner RG, Mackall CL. Clinical lessons learned from the first leg of the CAR T cell journey. Nat Med 2019;25(9):1341‒55. . 10.1038/s41591-019-0564-6

[35]	Louis CU, Savoldo B, Dotti G, Pule M, Yvon E, Myers GD, et al. Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma. Blood 2011;118(23):6050‒6. . 10.1182/blood-2011-05-354449

[36]	Simon DN, Wilson KL. The nucleoskeleton as a genome-associated dynamic ‘network of networks’. Nat Rev Mol Cell Biol 2011;12(11):695‒708. . 10.1038/nrm3207

[37]	Uzer G, Bas G, Sen B, Xie Z, Birks S, Olcum M, et al. Sun-mediated mechanical LINC between nucleus and cytoskeleton regulates betacatenin nuclear access. J Biomech 2018;74:32‒40. . 10.1016/j.jbiomech.2018.04.013

[38]	Crisp M, Liu Q, Roux K, Rattner JB, Shanahan C, Burke B, et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. J Cell Biol 2006;172(1):41‒53. . 10.1083/jcb.200509124

[39]	Uzer G, Thompson WR, Sen B, Xie Z, Yen SS, Miller S, et al. Cell mechanosensitivity to extremely low-magnitude signals is enabled by a LINCed nucleus. Stem Cells 2015;33(6):2063‒76. . 10.1002/stem.2004

[40]	Li YJ, Batra NN, You L, Meier SC, Coe IA, Yellowley CE, et al. Oscillatory fluid flow affects human marrow stromal cell proliferation and differentiation. J Orthop Res 2004;22(6):1283‒9. . 10.1016/j.orthres.2004.04.002

[41]	Ma C, Geng B, Zhang X, Li R, Yang X, Xia Y. Fluid shear stress suppresses osteoclast differentiation in RAW264.7 cells through extracellular signal-regulated kinase 5 (ERK5) signaling pathway. Med Sci Monit 2020;26: e918370. . 10.12659/msm.918370