根皮素通过靶向作用多聚磷酸激酶1降低鲍曼不动杆菌体内外毒力和持留性

吕红发 ,  李淑芳 ,  关键 ,  张鹏 ,  孔令聪 ,  马红霞 ,  李丹 ,  邓旭明 ,  牛效迪 ,  王建锋

Engineering ›› 2024, Vol. 43 ›› Issue (12) : 271 -285.

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Engineering ›› 2024, Vol. 43 ›› Issue (12) : 271 -285. DOI: 10.1016/j.eng.2024.09.002
研究论文

根皮素通过靶向作用多聚磷酸激酶1降低鲍曼不动杆菌体内外毒力和持留性

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Phloretin Targets Polyphosphate Kinase 1 to Attenuate Acinetobacter baumannii Virulence and Persistence In Vitro and In Vivo

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摘要

鲍曼不动杆菌因其毒力和持留性常造成严重性感染，特别是在医院的重症监护病房中。随着耐药菌的出现，如今迫切需要开发抗鲍曼不动杆菌感染的新策略和候选化合物。多聚磷酸激酶1（PPK1）参与维持细菌抗生素耐药性或耐受性、致病力和逆境生存，是细菌逆境生存所必需的。本研究通过鲍曼不动杆菌毒力和持久性相关的多项表型实验分析，发现根皮素能通过抑制PPK1活性降低鲍曼不动杆菌的毒力和持留性。根皮素降低鲍曼不动杆菌的运动能力，抑制生物被膜的形成，降低其对氨苄青霉素刺激、高温刺激和过氧化氢刺激的抗性。分子模拟和定点突变实验显示，根皮素与PPK1的结合位点是ARG-22、MET-622、ASN57和ARG-65。同时，根皮素处理导致鲍曼不动杆菌的毒力和持留性相关代谢途径发生变化，包括甘油磷脂代谢和脂肪酸生物合成。此外，在小鼠肺炎感染模型中，根皮素能降低鲍曼不动杆菌在肺部的菌载量以缓解小鼠肺炎损伤。这表明具有较高应用前景的根皮素能靶向作用PPK1来抗鲍曼不动杆菌感染。

Abstract

Acinetobacter baumannii (A. baumannii) is well known for its virulence and persistence, particularly in intensive care units. Therefore, new strategies and candidates to treat A. baumannii infection are urgently needed considering the emergence of drug-resistant bacteria. Polyphosphate kinase 1 (PPK1) is required for bacterial survival as it is involved in maintaining antibiotic resistance or tolerance, pathogenesis, and adversity resistance. Multiple phenotypic assays related to virulence and persistence were performed in this study, and phloretin was shown to attenuate A. baumannii virulence and persistence by inhibiting PPK1 activity. Phloretin hampered mobility, interfered with biofilm formation and decreased resistance to ampicillin, heat, and hydrogen peroxide stress in A. baumannii. The therapeutic effect was also examined in a mouse pneumonia infection model. Molecular simulation and site-directed mutagenesis revealed that ARG-22, MET-622, ASN-57, and ARG-65 were the sites of phloretin action against PPK1. Phloretin treatment led to changes in metabolic pathways associated with A. baumannii virulence and persistence, including glycerophospholipid metabolism and fatty acid biosynthesis. Furthermore, phloretin alleviated pneumonic injury in a mouse pneumonia infection model in vivo, indicating that phloretin is a promising compound for preventing A. baumannii infection resistance by targeting PPK1.

关键词

鲍曼不动杆菌 / 毒力 / 持留性 / 根皮素 / 多聚磷酸激酶

Key words

Acinetobacter baumannii / Virulence / Persistence / Phloretin / Polyphosphate kinase

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吕红发,李淑芳,关键,张鹏,孔令聪,马红霞,李丹,邓旭明,牛效迪,王建锋. 根皮素通过靶向作用多聚磷酸激酶1降低鲍曼不动杆菌体内外毒力和持留性[J]. 工程（英文）, 2024, 43(12): 271-285 DOI:10.1016/j.eng.2024.09.002

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1 引言

鲍曼不动杆菌常在医院中表现为多重耐药性，因此在2017年被世界卫生组织称为最危险的超级细菌。鲍曼不动杆菌通常与皮肤、尿路、呼吸道和导管相关性血流感染有关[1]，并且可以通过导尿管、呼吸道或开放性伤口感染基础疾病患者或免疫功能低下患者。此外，这种病原体在医院外也不容忽视，据报道，它所引起的感染占社区获得性肺炎（CAP）病例的85% [2]，其死亡率可达60%，部分CAP患者在确诊后8天内死亡[3]。此外，在兽医临床上，鲍曼不动杆菌可从猫、狗和牛等感染动物中分离。ST25型鲍曼不动杆菌分离株曾在土耳其、希腊和意大利的人类疫情暴发期间传播[4]。一株猪源的鲍曼不动杆菌ST195在欧洲人群感染事件中可被普遍检出[5]。综上所述，鲍曼不动杆菌在人类和兽医临床中已广泛存在，迫切需要采取新的措施以解决该棘手的问题。

鲍曼不动杆菌是一种机会性致病菌，对外界抵抗和存活能力也较强。细菌的运动性与致病性相关。在无脊椎动物感染模型中，具有高运动性的鲍曼不动杆菌菌株比运动缺陷型菌株表现出更大的毒力[6]。生物被膜的形成诱发了持续性的医学器械相关感染，特别是鲍曼不动杆菌能在皮肤或软组织中形成生物被膜，易导致对消毒剂产生抗性[7]。此外，在医院环境中存活的鲍曼不动杆菌可能表现出对抗生素和不良环境条件的耐药性[8]。如一些鲍曼不动杆菌分离株可以在干燥条件下存活近100天[9]。研究表明，在鲍曼不动杆菌中，ISAba1序列的插入导致katG的表达，可导致其对过氧化氢胁迫产生抗性，从而提高细菌存活率[10]。氯己定是一种常用于医院和其他医疗设施的消毒剂，用于杀灭革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。然而，不动杆菌氯己定外排蛋白AceI被证明可以从细菌细胞质中泵出氯己定来抵抗消毒剂胁迫[11]。这些重要的发现促使我们探索针对鲍曼不动杆菌毒力和持留性的新型抗感染策略以对抗鲍曼不动杆菌感染。

无机多聚磷酸盐（polyP）是由细菌和其他真核生物宿主产生的磷酸盐单体。PolyP参与细菌的能量代谢、毒力因子表达、应激耐受和耐药性[12]。细菌通过多聚磷酸激酶1（PPK1）和多聚磷酸激酶2（PPK2）来调节多聚磷酸盐平衡。PPK1主要催化三磷酸腺苷（ATP）形成polyP，而PPK2可以从鸟苷三磷酸（GTP）或ATP合成polyP或将其水解产生核苷酸三磷酸[13]。多聚磷酸激酶（PPKs）对于大肠杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa）的毒力和持留性至关重要[14]。此外，PPK1也存在于鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株中[15]。这些发现表明PPK1可能是降低鲍曼不动杆菌毒力和持留性的一个有前景的靶点。

本文探讨是否能通过抑制鲍曼不动杆菌PPK1酶活性作为一种抗毒力和抗持留性措施，来应对鲍曼不动杆菌感染。我们发现根皮素能作为PPK1抑制剂在体内外减弱鲍曼不动杆菌的毒力和持留性。此外，分子动力学模拟和定点突变实验进一步证实根皮素与PPK1的结合位点。总的来说，本文发现了一种新的化合物以应对鲍曼不动杆菌感染。

2 材料与方法

2.1 菌株、试剂及培养条件

鲍曼不动杆菌ATCC17978、PPK1缺失株（Δppk1::Apr）、PPK1回补株（Δppk1::Apr/PJL02-ppk1）以及鲍曼不动杆菌临床分离株17-X5和34Ab均由本实验室保存并按以往报道中的方法培养[16]。吗啉丙磺酸微量培养基（MOPS）购自Teknova公司。4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司。根皮素（纯度> 98%）购自上海源叶生物科技有限公司。胎牛血清购自内蒙古奥普赛生物科技有限公司。

2.2 PPK1的表达与纯化

以引物ppk1-BamHI-F/ppk1-NotI-R构建基于pET的原核表达载体。向表达PPK1的BL21（DE3）菌株中添加0.5 mmol∙L-1异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）并在16 ℃、200 r∙min-1条件下诱导16 h。次日，在4 ℃ 下以4000 r∙min-1离心样品30 min收集细胞沉淀，重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）后置于超声破碎仪中破碎。然后将上清液与镍基三乙酸（Ni-NTA）亲和层析柱料在4 ℃结合1 h。最后，用250 mmol∙L-1咪唑从Ni-NTA亲和柱中洗脱重组PPK1蛋白，并透析10 h（透析液含有150 mmol∙L-1 NaCl、20 mmol∙L-1咪唑和10%甘油）。此外，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）考染纯化的PPK1蛋白。本研究使用的引物列于附录A的表S1。

2.3 酶活性抑制实验

根据先前描述的方法[17]测定鲍曼不动杆菌polyP含量。用于PPK1酶活性抑制实验的反应混合液包括50 mmol∙L-1 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）（pH = 7.5）、50 mmol∙L-1硫酸铵、5 mmol∙L-1氯化镁和1 μg PPK1。以添加0.05 mol∙L-1乙二胺四乙酸（EDTA）的反应液作为阳性对照。然后添加不同浓度的根皮素（0 μg∙mL-1、4 μg∙mL-1、16 μg∙mL-1或64 μg∙mL-1）在室温下与PPK1蛋白孵育15 min，最后向混合液中加入1 mmol∙L-1 ATP和40 μmol∙L-1 DAPI。通过测定430 nm/550 nm（激发/发射）处的吸光度来量化polyP的生成。

2.4 生长曲线测定

将野生型（WT）鲍曼不动杆菌及其衍生菌株接种于Luria-Bertani（LB）培养基并置于220 r∙min-1、37 ℃的摇床中过夜培养。次日，以1∶100比例将菌液扩培到新鲜LB培养基中。当600 nm处的光密度（OD）达到0.3时，添加32 μg∙mL-1或64 μg∙mL-1的根皮素到混合物中。然后将混合物置于摇床中培养，每小时记录600 nm处的光密度值。

2.5 最低抑菌浓度（MIC）测定

依据微量稀释法测定根皮素或氨苄青霉素对鲍曼不动杆菌ATCC17978、17-X5和34Ab的MIC。简而言之，将鲍曼不动杆菌的过夜培养物用LB培养基稀释至5 × 105 CFU∙mL-1，并加入96孔板中。然后，根皮素或者氨苄青霉素以4~512 μg∙mL-1的浓度添加到96孔板中。混合均匀之后将培养板置于37 ℃、5% CO2培养箱中静置培养24 h。肉眼见无细菌生长的最低药物浓度被认为是MIC。

2.6 细菌polyP测定

参照Acosta-Cortés等[18]的方法测定胞内polyP含量，取2 mL对数生长期菌球重悬于等体积MOPS培养基中，37 ℃静置培养2 h。用50 mmol∙mL-1的HEPES缓冲液依次离心洗涤菌体3次。剩余沉淀重悬于2 mL HEPES缓冲液中，60 ℃加热10 min。所得混合物在10 000 r∙min-1下离心5 min后，重悬于2 mL DAPI检测缓冲液（150 mmol∙mL-1氯化钾溶于50 mmol∙mL-1 HEPES）中。在样品中加入10 µL的DAPI后，在室温下染色10 min。然后使用420 nm的激发波长和550 nm的发射波长测量polyP荧光的强度。此外，将样品滴在载玻片上，在荧光显微镜下进行polyP可视化分析。分别用405 nm/455 nm（激发/发射）和488 nm/550 nm（激发/发射）激发光和滤片观察DAPIDNA和DAPIpolyP。

2.7 鲍曼不动杆菌运动实验

根据先前的研究方法[19]，测定鲍曼不动杆菌、衍生菌株及临床菌株34Ab和17-X5在32 μg∙mL-1或64 μg∙mL-1根皮素处理下的细菌运动能力。简而言之，配置运动平板（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、0.5%氯化钠、0.5%葡萄糖和0.3%琼脂），并添加或不添加不同浓度的根皮素。将鲍曼不动杆菌悬液接种于平板后，37 ℃孵育15 h。最后，记录运动直径并且拍照。

2.8 透射电镜（TEM）检测

将鲍曼不动杆菌（WT、Δppk1::Apr和根皮素处理的WT）的表面运动性菌落搅拌溶解在100 μL的PBS中。然后，虹吸10 μL样品并滴到铜TEM网格上。样品经乙酸双氧铀染色后，在透射电子显微镜（日本日立公司）下观察。

2.9 生物被膜形成实验

按先前报道[20]进行鲍曼不动杆菌生物被膜形成实验。将WT、Δppk1::Apr和Δppk1::Apr/PJL02-ppk1菌株的过夜培养物用Mueller-Hinton肉汤（MHB）稀释至2 × 105 CFU∙mL-1，然后在24孔板的每孔中加入1 μL菌悬液。同时加入不同浓度的根皮素（0 μg∙mL-1、8 μg∙mL-1、16 μg∙mL-1、32 μg∙mL-1、48 μg∙mL-1、64 μg∙mL-1），探究根皮素对鲍曼不动杆菌生物被膜形成的影响。在30 ℃下培养24 h后，小心吸弃培养基。剩余的生物被膜用1 mL PBS洗涤，用500 µL 0.1%结晶紫染色1 h。染色后的生物被膜用1 mL PBS洗涤2次，并在37 ℃下干燥30 min。将菌体溶于33%乙酸中，测定光密度（OD570nm）。此外，采用稀释平板计数法对生物被膜进行定量。通过GraphPad Prism（美国）分析根皮素对生物膜形成的半数抑制浓度（IC50）。

2.10 共聚焦激光扫描显微镜观察生物膜

为了可视化根皮素对生物膜形成的抑制作用，使用SYTO 9绿色荧光染料（SYTO 9）和碘化丙啶（PI）荧光染料对生物被膜进行染色。细胞爬片提前置于24孔板中，将菌悬液接种到新鲜的含或不含不同浓度根皮素的MHB培养基中。30 ℃培养24 h后，用无菌PBS轻轻冲洗细胞爬片，以去除多余的细菌。生物被膜/细胞用SYTO 9/PI避光染色15 min。最后，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM; Olympus FV1200，日本）观察生物被膜的形成状况。

2.11 鲍曼不动杆菌持留实验

按先前报道[17]进行鲍曼不动杆菌持留实验。将过夜培养的WT、Δppk1::Apr、Δppk1::Apr/PJL02-ppk1和34Ab菌株按1∶100的比例接种于LB培养基中，进行扩大培养。当菌液600 nm处光密度为0.6时，分别加入相应浓度的根皮素或氨苄青霉素（Amp）（640 μg∙mL-1）。这些样品置于37 ℃和180 r∙min-1的摇床中继续培养。在相应的时间点通过离心（12 000 r∙min-1离心2 min）收集细菌，并用PBS洗涤1次，然后使用平板计数法对存活细菌进行定量。

此外，根据其说明书使用LIVE/DEAD Baclight细菌存活荧光探针（Molecular Probes，美国）通过荧光显微镜对持留菌进行可视化检测。

2.12 高温和过氧化氢刺激实验

探究WT、Δppk1::Apr、Δppk1::Apr/PJL02-ppk1菌株以及34Ab和17-X5菌株在64 μg∙mL-1根皮素处理前后持留存活能力。离心收集含或不含64 μg∙mL-1根皮素处理的对数期细菌，用1 mL PBS将细菌重悬于1.5 mL离心管中。然后将这些细菌样品在60 ℃加热7 min或用0.05 mol∙L-1 H2O2刺激30 min，之后通过平板计数法测定存活菌数。

2.13 分子模拟对接

使用AutoDock 4.0和Amber 18软件包对根皮素和蛋白质数据库中获取的PPK1结构进行标准分子模拟对接。分子模拟对接后，采用MMPBSA方法分析根皮素与PPK1之间的结合位点和结合自由能。此外，还通过分子动力学模拟确定突变蛋白（MET-622A、ASN-57A、ARG-22A、ARG-65A）与根皮素之间的相互作用，以进一步验证这些位点与根皮素的结合能力。

2.14 定点突变

根据分子模拟和对接结果，利用ppk1-pET-28a多位点突变试剂盒，通过表S1中的引物将目标氨基酸突变为Ala。基因测序后，利用Ni-NTA亲和层析柱纯化突变蛋白。为了验证分子模拟和对接的结果，我们也对根皮素对突变蛋白酶活性的抑制作用进行了测定。

2.15 荧光淬灭试验

将突变蛋白用PBS稀释至0.5 mg∙mL-1，并与不同浓度的根皮素在室温下孵育15 min。按照前人的方法[21]，根皮素与PPK1的结合常数（K A）通过荧光分光光度计在280 nm的激发波长和300~400 nm的发射波长下测定。

2.16 圆二色谱（CD）检测

将纯化的PPK1（0.5 mg∙mL-1）蛋白与32 μg∙mL-1根皮素在室温下孵育15 min，通过CD分光光度计（MOS-500；法国Bio-Logic公司）测量根皮素处理引起的蛋白质二级结构变化。此外，以煮沸的PPK1蛋白作为阳性对照。根据先前的报道[22]，使用β-折叠选择（BeStSel）方法（https://bestsel.elte.hu/index.php.）来区分不同处理下PPK1的光学变化。

2.17 傅里叶变换红外（FTIR）光谱

FTIR光谱也被用来证实根皮素诱导的蛋白质二级结构的变化[23]。将PPK1蛋白于冻干机中冻干。蛋白质样品研磨后与干燥的溴化钾（KBr）以1∶100的比例混合，通过扫描波长范围为400~4000 cm-1的FTIR光谱仪（布鲁克，德国）进行分析。

2.18 表面等离子体共振（SPR）分析

根皮素和PPK1或突变蛋白的SPR检测采用美国GE Healthcare公司的BioCare X100系统。以含5% DMSO的PBS为运行缓冲液，机器运行温度为25 ℃，流速为10 μL∙min-1，用乙酸钠缓冲液稀释PPK1及其突变蛋白至浓度为0.05 mg∙mL-1。不同浓度根皮素（12.5~200.0 μmol∙L-1）流经包被PPK1或突变蛋白的S系列传感器芯片CM5。最后，采用稳态亲和力拟合模型进行动力学分析。

2.19 代谢组学分析

将过夜培养的WT和Δppk1::Apr菌液分别以1∶100稀释于新鲜LB培养基中以扩大培养，同时添加或不添加32 µg∙mL-1根皮素于37 ℃、220 r∙min-1条件下培养至对数生长期。用PBS清洗3次后，样品用含有乙腈、甲醇和水（2∶1∶1）的500 µL提取液处理。样品在液氮中冷冻后进行超声处理。细菌代谢产物在12 000 r∙min-1离心15 min后收集，通过超高效液相色谱（UHPLC）系统和Q Exactive HFX质谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国）进行液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）分析。

2.20 逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

使用Thermo Fisher Scientific公司的RT-qPCR来定量与ppk1、rpoS、外切聚磷酸酶（ppx）和phoU相关的基因的相对表达水平。此外，在代谢组学分析结果的基础上，对WT、Δppk1::Apr和根皮素处理组相关基因进行RT-qPCR确证。采用2-ΔΔCT（cycle threshold value, CT）法和Student t检验确定这些基因的相对表达水平。本实验所用引物见表S1。

2.21 体内外安全性评价

为了评价根皮素对HeLa细胞系（HeLa）细胞和J774细胞的细胞毒性，细胞培养基中加入不同浓度的根皮素（4~128 μg∙mL-1）与细胞在温箱中孵育6 h。通过细胞毒性检测试剂盒（上海碧云天生物技术公司）检测乳酸脱氢酶（LDH）的释放来确定根皮素的细胞毒性。在体内动物毒性试验中，BALB/c小鼠分别灌胃0 mg∙kg-1、50 mg∙kg-1、150 mg∙kg-1和250 mg∙kg-1根皮素（溶于0.5%羧甲基纤维素钠），每天2次，连续7天。然后，每天记录小鼠的体重、摄食量和饮水量。第8天处死小鼠，取心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏进行大体观察和苏木精-伊红（HE）染色。此外，采集小鼠血液，用血细胞计数仪（KT-6610 VET；GenruI）或生化检测仪器（HR300V；HUAREN）进行全血细胞计数和生化分析。

2.22 小鼠肺炎感染模型

接种野生型鲍曼不动杆菌于37 ℃摇床中过夜培养至对数生长期。离心收集细胞，然后用无菌PBS洗涤并调整细胞浓度为2 × 1010 CFU∙mL-1。将6~8周龄BALB/c小鼠分为3组：WT组（感染组）、对照组（未感染组）和治疗组（50 mg∙kg-1根皮素治疗组）。WT组和治疗组经鼻接种（1 × 109 CFU∙只-1）建立肺炎模型，对照组接种PBS。治疗组小鼠按50 mg∙kg-1灌胃给予根皮素，每天2次。感染48 h后处死小鼠，取肺组织标本固定于4%多聚甲醛中，用于HE染色。此外，测定右肺组织匀浆中细胞因子含量和细菌载量。所有动物均按照吉林大学动物实验指导原则进行处理，实验方案经吉林大学动物实验伦理委员会批准（SY202309036）。

2.23 统计学分析

使用GraphPad Prism通过Student t检验进行数据差异分析。所有测定均进行三次，数据以平均值±标准差表示。“*”和“**”分别表示显著性差异和极显著性差异。

3 结果

3.1 根皮素通过靶向作用PPK1降低细胞内polyP含量

不同浓度根皮素（4~64 μg∙mL-1）处理PPK1的动力学曲线[图1（a）]表明，根皮素显著抑制PPK1的酶活性[图1（b）]。重要的是，64 μg∙mL-1根皮素的抑制作用与EDTA类似，可螯合金属离子，破坏酶促反应。此外，生长曲线显示64 μg∙mL-1根皮素对鲍曼不动杆菌的生长无抑制作用[图1（c）]，根皮素对鲍曼不动杆菌的MIC为256 μg∙mL-1。此外，为了探究根皮素对PPK1表达的影响，通过RT-qPCR检测了ppk1及其相关基因ppx、phoU和Rpos的表达。结果表明，32 μg∙mL-1或64 μg∙mL-1根皮素提高了phoU和ppx的相对表达量，与Δppk1::Apr菌株相似[图1（d）]。然而，Rpos和ppk1的表达水平不受根皮素处理的影响。鲍曼不动杆菌中polyP的形成是评价根皮素抑制PPK1活性的重要指标。在WT菌株中，与32 μg∙mL-1根皮素共培养后，polyP的荧光强度从(4259 ±  140)下降到(3731 ± 65)，如图1（e）所示。图1（f）为polyP荧光图像，绿色荧光代表细胞中的polyP，蓝色荧光代表DNA。根皮素处理后，根皮素组polyP荧光强度低于WT组。这些研究结果表明，根皮素可以通过靶向作用PPK1来降低细胞中polyP的含量。

3.2 根皮素可能通过干扰菌毛样结构的形成而抑制鲍曼不动杆菌的表面运动性

表面运动性测定结果表明，与无根皮素处理相比，32 μg∙mL-1根皮素抑制了WT菌株的表面运动能力[图2（a）]。在Δppk1::Apr/PJL02-ppk1菌株中也观察到了这种效应。经根皮素处理后，WT、Δppk1::Apr和Δppk1::Apr/PJL02-ppk1菌株的运动直径分别从(44.00 ± 2.16) mm、(27.00 ± 1.25) mm和(33.00 ± 2.50) mm降低至(23.00 ± 1.63) mm、(14.00 ± 0.82) mm和(19.00 ± 1.25) mm [图2（b）]。根皮素还降低了Δppk1::Apr的运动直径。与WT菌株相比，ppk1缺失导致运动直径下降38.64%。此外，用32 μg∙mL-1根皮素处理的Δppk1::Apr菌株的运动直径减少了68.18%。采用TEM观察细胞表面运动性受损的原因。Δppk1::Apr的表面运动性受损可能是由于菌毛样结构比WT菌株少，如图2（c）~（e）所示。这些结果表明，根皮素抑制菌毛样结构的形成，并可能减弱鲍曼不动杆菌的表面运动性。

3.3 根皮素抑制鲍曼不动杆菌生物被膜形成

生物被膜形成实验结果表明，根皮素以剂量依赖的方式抑制生物被膜的形成。结晶紫染色[图3（a）]显示，48 μg∙mL-1或64 μg∙mL-1根皮素处理的样品染色较弱，生物被膜形成减少。此外，64 μg∙mL-1根皮素处理减弱了互补菌株Δppk1::Apr/PJL02-ppk1的生物被膜形成能力。结晶紫染色和平板计数法也显示根皮素在浓度高于48 μg∙mL-1时显著降低生物被膜的形成[图3（b）和（c）]。量效曲线显示IC50为73.07 μg∙mL-1，如图3（d）所示。图3（e）~（g）中可视化的生物被膜显示64 μg∙mL-1处理下形成的生物被膜明显小于WT生物被膜。总的来说，根皮素通过抑制PPK1的活性降低鲍曼不动杆菌形成生物被膜的能力。

3.4 根皮素减弱了鲍曼不动杆菌在氨苄青霉素存在下的持留性

PPK1作为一种polyP合成酶，能够承受外界压力，从而保证细菌的存活。因此，使用氨苄青霉素、高温、过氧化氢等外界不良刺激，检测根皮素是否可以通过抑制PPK1的活性来降低鲍曼不动杆菌的持留性。时间-杀菌曲线结果表明，32 μg∙mL-1根皮素显著降低了640 μg∙mL-1氨苄青霉素处理下的细菌数量[图4（a）和（b）]。与WT菌株相比，PPK1缺失菌株表现出0.71 × lg单位的细菌细胞数量减少。此外，在32 μg∙mL-1根皮素处理下，Δppk1::Apr菌株的菌量为6.40 × lg单位，比PPK1缺失菌株的抑制效果更显著。BacLight染色法live/dead染色检测发现，WT组中呈现绿色荧光的活菌更多[图4（c）]。相反，在Δppk1::Apr组，呈现红色荧光的死亡细胞更多。这些发现表明PPK1缺陷菌株的持留性和存活性受到损害。与Δppk1::Apr菌株一样，在高浓度氨苄青霉素刺激下，32 μg∙mL-1根皮素减弱了鲍曼不动杆菌的持留性，导致细菌死亡，如图4（c）所示。综上所述，根皮素减弱了氨苄青霉素刺激下的鲍曼不动杆菌持留性，且效果强于PPK1缺失株。

3.5 根皮素减弱了鲍曼不动杆菌在高温和过氧化氢处理下的持留性

耐药性和环境持留性均有助于鲍曼不动杆菌的生长繁殖[24]。高温和过氧化氢刺激实验与抗生素胁迫实验的方法相同。在图4（d）左侧显示的LB平板上没有检测到细菌生长，Δppk1::Apr菌株对过氧化氢胁迫特别敏感。值得注意的是，64 μg∙mL-1根皮素处理显著减弱了鲍曼不动杆菌对过氧化氢胁迫的持留性，如图4（d）右侧显示的LB平板和图4（f）中显示的平板计数结果。此外，PPK1缺失菌株对高温胁迫的敏感性低于对过氧化氢胁迫的敏感性。如图4（e）和（g）中，与WT菌株相比，64 μg∙mL-1根皮素导致约1 × lg单位的细菌死亡。综上所述，根皮素减弱了鲍曼不动杆菌在氨苄青霉素胁迫以及高温和过氧化氢胁迫下的持留性。

3.6 根皮素降低临床鲍曼不动杆菌分离株的毒力和持留性

根皮素对17-X5和34Ab的MIC均为256 μg∙mL-1。以临床鲍曼不动杆菌菌株17-X5和34Ab为研究对象，探讨根皮素能否降低其毒力和持留性。在高温和过氧化氢胁迫实验中，根皮素在64 μg∙mL-1时显著降低了活菌数[图5（a）~（h）]。有趣的是，时间-杀菌实验结果表明根皮素也降低了34 Ab对Amp（640 μg∙mL-1）的抗性[图5（i）]。此外，17-X5和34Ab菌株中，在根皮素处理组也观察到比对照组更小的运动直径，如图5（j）和（k）所示。总之，我们的结果表明根皮素也能降低鲍曼不动杆菌临床分离株的毒力和持留性。

3.7 根皮素对PPK1的竞争性抑制作用

通过对PPK1-根皮素复合物体系进行常规分子动力学模拟，研究根皮素抑制PPK1的作用机制。PPK1-根皮素复合物的三维（3D）结构在200 ns的模拟过程中达到平衡[附录A中图S1（a）]。图6（a）显示了PPK1-根皮素复合物在最后50 ns达到平衡。PPK1-根皮素复合物的稳定结构表明根皮素结合在PPK1的催化口袋中。ARG-22、ILE-26、HIS-30、ASN-57、ARG-65和MET-622等残基可能是由于这些残基与根皮素在模拟（附录A表S2）过程中的距离较近，是其潜在的结合位点。

通过MM-PBSA方法计算PPK1-根皮素结合位点上残基的结合能分解，以确定根皮素的结合位点[图6（b）]。值得注意的是，ILE-26、ASN-57和ILE-574的总能量变化（ΔE total）值均小于-1.0 kcal∙mol-1，表明这3个残基与根皮素的结合亲和力最高。如图6（a）所示，PPK1-根皮素的3D稳定结构表明，ILE-26和ILE-574的侧链靠近根皮素的戊-2-酮部分，这种强疏水作用导致结合能增加。此外，由于HIS-30和ASN-57靠近根皮素且具有适当的取向，它们与根皮素的羟基形成了两个氢键，ΔE total小于-0.5 kcal∙mol-1。类似地，如图6（c）所示，PPK1的8个Ala突变体与根皮素的结合能均显著低于WT-PPK1与根皮素的结合能，表明ARG-22、ILE-26、HIS-30、ASN-57、ARG-65和MET-622在根皮素与PPK1的结合中起着至关重要的作用。模拟的均方根波动（RMSF）值[图6（d）~（f）]也表明，由于根皮素与PPK1的结合，apo形式在结合位点上表现出比复合物更大的灵活性。

由于氢键是蛋白质与配体之间最重要的相互作用模式之一，因此使用模拟轨迹进一步研究了根皮素与PPK1之间的氢键相互作用。图6（g）~（j）表明根皮素在模拟过程中与HIS-30和ASN-57形成了两个强氢键，分数值大于0.7，分值较高。对根皮素的两个羟基以及HIS-30和ASN-57的侧链进行径向分布函数（RDF）计算以获得更全面的理解。图6（k）为羟基质心（COM）的径向分布函数，峰值分别为2.05 Å和2.65 Å。距离表明羟基分别嵌入在HIS-30和ASN-57侧链形成的空腔中。结果表明，根皮素的羟基与HIS-30和ASN-57的侧链形成氢键的能力较强。在最后50 ns的模拟过程中对氢键的计算支持了上述结果[图6（l）]。

此外，200 ns常规分子动力学（cMD）模拟揭示了PPK1与其天然底物ATP的相互作用模式[图S1（a）]。从cMD模拟得到的PPK1-ATP的稳定结构显示，具有催化活性的位点是PHE-29、ILE-53、ARG-56、ASP-59和SER-384，它们与ATP有强烈的相互作用[附录A中图S1（b）和表S2]。结合能分解和丙氨酸扫描揭示了参与ATP与PPK1结合的关键残基[图S1（c）和（d）]；在这些残基中，ASN-57和ARG-65与根皮素和PPK的结合位点重合，尽管其亲和力最小。图S1（e）显示PPK1-根皮素和PPK1-ATP的3D结构完全重叠，表明根皮素的结合位点与天然底物ATP的结合位点完全一致。这种相互作用机制被称为基本竞争抑制。此外，由于根皮素与Mg2+离子之间的距离较远，根皮素不能与辅酶因子Mg2+形成较强的相互作用。另一方面，天然底物ATP和Mg2+离子由于它们的接近而强烈地相互作用[图S1（f）]。进一步证实根了皮素的竞争性结合导致PPK1活性丧失。

3.8 根皮素与PPK1直接相互作用

在分子动力学模拟结果的基础上，采用定点突变的方法确认根皮素与PPK1之间的直接相互作用。使用表S1中描述的引物，将ARG-22（PPK1-22）、ASN-57（PPK1-57）、ARG-65（PPK1-65）和MET-622（PPK1-622）突变为Ala，以破坏PPK1中的根皮素结合位点。可惜的是，氨基酸残基ILE-26（PPK1-26）和HIS-30（PPK1-30）未成功突变。如图7（a）所示，对突变蛋白的酶活性测定发现，16 μg∙mL-1根皮素显著降低了PPK1-22的酶活性，而仅有4 μg∙mL-1根皮素的PPK1-WT却表现出这种抑制作用，表明ARG-22参与了根皮素与PPK1的作用。此外，ASN-57、ARG-65和MET-622也影响PPK1与根皮素的相互作用。

CD光谱是在各种条件下测定蛋白质二级结构的最佳方法。如图7（b）~（d）所示，与32 μg∙mL-1根皮素孵育后，PPK1中Anti-1的百分比减少，而Anti-2、Anti-3和Turn的百分比增加。这些二级结构的变化也由图7（e）中200 nm处的特征尖锐峰进一步证实。

FTIR光谱也被广泛用于评估化合物-蛋白质二级结构相互作用[23]。图7（f）显示了在1872 cm-1、2187 cm-1、2993 cm-1、3068 cm-1和3184 cm-1处的特征峰变化。此外，为了详细探究根皮素与PPK1的相互作用，进行了荧光淬灭实验。PPK1蛋白（WT-PPK1、ASN-57、ARG-22、MET-622和ARG-65）与根皮素的K A分别为(8.37 ± 1.14) × 104 L∙mol-1、(1.00 ± 0.00) × 104 L∙mol-1、(1.19 ± 0.16) ×  104 L∙mol-1、(1.69 ± 0.15) × 104 L∙mol-1和(4.34 ± 0.76) ×  104 L∙mol-1。结果表明，突变体蛋白的K A低于根皮素处理的WT蛋白。综上所述，我们的研究结果表明根皮素与PPK1结合并改变其构象从而抑制其催化活性。

此外，通过SPR实验证实了PPK1与根皮素之间的结合。结果[图8（a）~（e）]表明，PPK1及其突变体蛋白的解离平衡常数（K D）值分别为(1.48 ± 0.24) ×  10-3 mol∙L-1、(2.70 ± 0.99) × 10-3 mol∙L-1、(1.80 ± 0.05) × 10-3 mol∙L-1、(2.14 ± 0.41 ) × 10-3 mol∙L-1和(1.56 ± 0.22) × 10-3 mol∙L-1，如图8（f）所示，这表明MET-622（PPK1-622）、ASN-57（PPK1-57）、ARG-22（PPK1-22）和ARG-65（PPK1-65）突变降低了根皮素与PPK1的结合亲和力。

再者，对四个突变体蛋白（MET-622A、ASN-57A、ARG-22A、ARG-65A）和根皮素的分子模拟结果表明，根皮素也可以与上述位点结合，如附录A中的图S2所示。然而，我们计算了野生型蛋白-根皮素复合物体系和四个突变体蛋白复合物体系（附录A表S3）中配体分子与蛋白之间的总结合自由能发现，虽然根皮素仍能与突变体蛋白的活性口袋区域结合，但结合亲和力明显低于野生型蛋白，与上述实验结果（图8）完全一致，进一步证实了PPK1的根皮素结合位点。因此，我们的结果表明根皮素可以直接与PPK1相互作用来抑制PPK1。

3.9 根皮素引起代谢途径的改变以减弱鲍曼不动杆菌的毒力和持留性

对鲍曼不动杆菌进行代谢组学分析，探究根皮素降低毒力和持留性的机制。如图9（a）所示，WT、根皮素和Δppk1::Apr组的得分图很好地聚类和分离。与未处理的WT菌株相比，共有39个差异丰度代谢物，其中有28个下调代谢物，11个上调代谢物[图9（b）]。如图9（c）所示，戊二酸下调，而脱氧腺苷上调。图9（d）显示了差异丰度代谢物的聚类分析。如热图中蓝色圆点所示，根皮素处理的鲍曼不动杆菌的代谢物水平低于野生型鲍曼不动杆菌。根据京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析，WT和根皮素处理组之间显著差异的通路是烟酸与烟酰胺代谢、甘油磷脂代谢、脂肪酸生物合成和色氨酸代谢[图9（e）]。qRT-PCR实验用于验证代谢组学分析的结果。PlsB、EutB和EutC是参与甘油磷脂代谢的关键基因，如图9（f）所示。此外，脂肪酸合成途径中的其他基因（ompA、lamb、fabG）在根皮素和Δppk1::Apr组中也较WT组下调。再者，色氨酸代谢对于维持毒力至关重要，我们的研究结果还揭示了参与色氨酸代谢的几个基因的差异调控，包括fadB、katG、Abal、epsA和pgaA。为了进一步确定根皮素引起的其他通路变化，我们还分析了Δppk1::Apr和根皮素处理的Δppk1::Apr之间的代谢变化。差异丰度代谢物的聚类分析结果如图9（g）所示，差异丰度代谢通路如图9（h）所示，提示烟酸和烟酰胺代谢很可能与根皮素介导的鲍曼不动杆菌毒力和持留性的减弱有关。综上所述，根皮素引起的代谢途径的改变可降低鲍曼不动杆菌的毒力和持留性。

3.10 根皮素在体外和体内均无毒性

在细胞毒性实验中，用低于128 μg∙mL-1的根皮素处理HeLa或J774细胞，均没有观察到细胞毒性[附录A中图S3（a）和（b）]。根皮素在小鼠体内的毒性结果表明，小鼠经口给予50 mg∙kg-1、150 mg∙kg-1或250 mg∙kg-1根皮素7天，其摄食量、饮水量和体重均无明显变化[附录A中图S3（c）~（e）]。与未处理组相比，实验组各器官大体观察及病理检查均未见明显病理改变[附录A中图S3（f）和（g）]。此外，根据仪器推荐的参考值，各处理组的平均血细胞计数和生化指标值均在正常范围内（表1和表2）。综上所述，这些结果表明根皮素在指定剂量下，在体外和体内均未表现出毒性。

3.11 根皮素在体内减轻鲍曼不动杆菌诱导的小鼠肺炎损伤

为了评估根皮素在体内对鲍曼不动杆菌的抗感染作用，建立了小鼠肺炎损伤模型。感染48 h后，通过HE染色观察到鲍曼不动杆菌感染组小鼠肺组织充血、出血，以及许多炎症细胞浸润肺部[图10（a）]。根皮素处理组比WT菌株感染组的小鼠具有更好的肺泡结构，呈现肺炎损伤减轻。此外，测定肺脏中的细菌载量发现，与WT感染组相比，根皮素显著降低了约0.5 × lg单位的细菌载量，如图10（b）所示。炎性因子水平测定结果显示，根皮素处理组IL-1和IL-6水平显著低于WT菌株感染组[图10（c）和（d）]。综上所述，根皮素减轻了鲍曼不动杆菌诱导的小鼠肺炎损伤。

4 讨论

鲍曼不动杆菌以其能够形成生物被膜、多重耐药和强环境适应性而被对大家所关注。耐药菌株的出现与传播对开发临床有效的抗感染方法提出了挑战。此外，在兽医临床中，鲍曼不动杆菌相关感染（特别是耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌引起的感染）也有报道。因此，寻找新的化合物、寻找有希望的药物靶点，是临床预防和治疗鲍曼不动杆菌感染至关重要的目标。鉴于PPK是一个新的治疗靶点，鉴定PPK的抑制剂来对抗鲍曼不动杆菌的致病性和持留性是一种可行的策略[14]。之前研究发现PPK1是鲍曼不动杆菌毒力和持久性所必需的[16]，因此在本研究中继续探索潜在的抑制剂。

前期研究表明，没食子素（gallein）或依托泊苷（etoposide）可靶向作用PPK降低肺炎克雷伯菌或鲍曼不动杆菌的毒力[15,25]。但这些研究存在一定的局限性。本研究中根皮素通过PPK1酶抑制实验被发现[图1（a）]。根皮素可通过抑制PPK1活性降低鲍曼不动杆菌表面运动性，抑制生物被膜形成（图2和图3）。有趣的是，根皮素也减弱了Δppk1::Apr的这些能力，如图2（a）所示，这表明根皮素在本实验中发挥了额外的作用。此外，在高温、过氧化氢和氨苄青霉素胁迫下，鲍曼不动杆菌的持留能力也有所降低，如图4（a）、（d）、（e）所示。根皮素在氨苄青霉素胁迫下也表现出比其他组更好的抗持留性。

前期研究发现，ppk1参与鲍曼不动杆菌甘油磷脂代谢和脂肪酸生物合成[16]。在本文中，根皮素还影响甘油磷脂和脂肪酸的生物合成[图9（e）]，下调甘油磷脂代谢和脂肪酸生物合成相关基因，包括PlsB、EutB、fabG和EutC。编码膜蛋白（ompa和lamb）的基因在根皮素处理后的鲍曼不动杆菌中的表达也下调。甘油磷脂作为细菌中重要的膜脂，具有多重生物学功能，如在信号转导、膜完整性、对抗生素的抗性和适应环境变化等方面具有重要作用[26‒27]。本研究结果证实根皮素通过调节甘油磷脂和脂肪酸的生物合成来减弱鲍曼不动杆菌的毒力和持留性。再者，在根皮素处理下，烟酸和烟酰胺代谢或色氨酸代谢也发生了变化，如图9（e）所示。在微生物中，色氨酸分解代谢途径，包括吲哚途径，可以调节真菌的形成和毒力[28]。再者，鲍曼不动杆菌利用群体感应和吲哚调节生物功能和毒力因子，如Ⅲ型分泌系统和生物被膜形成[29]。与我们的研究结果一致，根皮素下调了毒力相关基因AbaI、epsA和pgaA，表明根皮素引起的色氨酸代谢变化也可能降低毒力。此外，与ppk1缺陷菌株单独代谢相比，根皮素处理下ppk1缺陷菌株中烟酸和烟酰胺代谢发生改变[图9（g）和（h）]，这与细菌中的氨基酸代谢和能量代谢有关。另外，持留性细菌往往表现出低能量状态。因此，这可能是根皮素在氨苄青霉素胁迫下具有有效抗持留性作用的原因。

此外，分子动力学模拟被用于研究根皮素的作用位点。ARG-22（PPK1-22）、ASN-57（PPK1-57）、ARG-65（PPK1-65）和MET-622（PPK1-622）残基是根皮素的结合位点。CD光谱和FTIR光谱证实了根皮素与PPK1之间的相互作用。此外，在小鼠肺炎感染模型中发现根皮素治疗具有保护作用，可明显减轻肺损伤（图10）。根据这些发现，根皮素在体外和体内靶向作用PPK1来降低鲍曼不动杆菌的毒力和持留性。

据报道没食子素、依托泊苷和染料木素能够抑制PPK活性，从而降低鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌的毒力[15,30]。然而，在本研究中，根皮素能靶向作用PPK1降低鲍曼不动杆菌的毒力和持留性。而本研究仅针对PPK1，而根皮素对PPK2的抑制作用，以及PPK1与细菌持留性和毒力之间的调控网络还有待研究。综上所述，本研究结果证实，根皮素是一种具有一定前景的PPK1靶向化合物，可用于对抗鲍曼不动杆菌感染。

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