TRPML1抑制剂ZEB1-AS1诱发衰老小鼠溶酶体功能障碍和心脏损伤

刘亨 , 张海莹 , 娄涵 , , 郝胜心 , 陈慧 , 陈晨 , 王磊 , 李慧敏 , 孟子裕 , 赵文杰 , 赵桐 , 林园 , 杜志敏 , 刘鑫 , 杨宝峰 , 张勇

Engineering ›› 2024, Vol. 43 ›› Issue (12) : 190 -209.

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Engineering ›› 2024, Vol. 43 ›› Issue (12) : 190 -209. DOI: 10.1016/j.eng.2024.09.020
研究论文

TRPML1抑制剂ZEB1-AS1诱发衰老小鼠溶酶体功能障碍和心脏损伤

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ZEB1-AS1 as a TRPML1 Inhibitor to Cause Lysosome Dysfunction and Cardiac Damage in Aged Mice

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摘要

随着全球人口老龄化加剧，心血管疾病（cardiovascular diseases, CVDs）的发病率显著上升。长链非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs）作为多种病理生理过程中的新型调控因子，近年来备受关注。本文通过RNA测序发现lncRNA锌指E-box结合同源盒1的反义链1（zinc finger E-box binding homeobox 1 opposite strand 1, Zeb1os1）在衰老小鼠心脏、衰老心肌细胞及老年人血液中显著上调。其在人类中的同源物为ZEB1-AS1。研究结果表明，ZEB1-AS1在老年人血液中的水平与年龄呈正相关，但与心脏舒张功能指标E/A比值（peak E to peak A，E/A）呈负相关。沉默Zeb1os1能够显著改善衰老小鼠的心脏舒张功能障碍及心脏衰老表型。相反，过表达Zeb1os1则导致类似衰老的心脏功能障碍。进一步研究表明，Zeb1os1通过与瞬时受体电位黏蛋白1（transient receptor potential mucolipin 1, TRPML1）相互作用，促进TRPML1的泛素化降解，进而抑制溶酶体中的钙离子外流，导致溶酶体功能障碍。此外，Zeb1os1保守的功能片段是其在心肌细胞中促衰老效应的关键核苷酸。综上所述，本研究证明Zeb1os1是溶酶体功能障碍及衰老相关心脏损伤的潜在治疗靶点。

Abstract

The prevalence of cardiovascular diseases (CVDs) has increased markedly as the world population has aged. Long non-coding RNAs (lncRNAs) have been reported as novel regulators in diverse pathophysiological conditions. Here, we performed RNA sequencing (RNA-seq) and observed that the lncRNA Zeb1os1 (zinc finger E-box binding homeobox 1, opposite strand 1), which is known as ZEB1-AS1 (zinc finger E-box binding homeobox 1 antisense 1) in humans, was upregulated in the aged mice hearts, senescent cardiomyocytes, and human blood from elderly individuals. The human blood ZEB1-AS1 level was positively relevant to human age but negatively relevant to peak E to peak A (E/A). Silencing Zeb1os1 ameliorated diastolic dysfunction and cardiac senescence in aged mice. On the other hand, Zeb1os1 overexpression triggered cardiac dysfunction resembling that observed in aged mice. Mechanistically, we provide compelling evidence that Zeb1os1 interacts with the transient receptor potential mucolipin 1 (TRPML1) for ubiquitination (UB)-mediated degradation. This process inhibits lysosomal Ca2+ efflux, impairing lysosome function. In addition, the functional domain of Zeb1os1, which contains the key nucleotides responsible for the pro-senescence property of full-length Zeb1os1 in cardiomyocytes. Together, these data suggest that Zeb1os1 is a potential target for ameliorating lysosomal dysfunction and aging-related cardiac impairment.

关键词

心脏衰老 / 心肌细胞衰老 / ZEB1-AS1 / TRPML1 / 溶酶体

Key words

Heart aging / Cardiomyocytes senescence / ZEB1-AS1 / TRPML1 / Lysosome

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刘亨,张海莹,娄涵,Jennifer Wang,郝胜心,陈慧,陈晨,王磊,李慧敏,孟子裕,赵文杰,赵桐,林园,杜志敏,刘鑫,杨宝峰,张勇. TRPML1抑制剂ZEB1-AS1诱发衰老小鼠溶酶体功能障碍和心脏损伤[J]. 工程（英文）, 2024, 43(12): 190-209 DOI:10.1016/j.eng.2024.09.020

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1 引言

随着全球人口老龄化的加剧，心力衰竭的患病风险显著增加[1]。在65岁及以上人群中，心力衰竭的发生率约为8.4%，而在45~54岁人群中则仅为0.7% [2]。心脏衰老的特征包括结构和功能异常，如左室壁厚度增加、舒张充盈模式改变、舒张期功能下降、舒张期延长和间质纤维化等[3]。在细胞层面，衰老的心肌细胞表现出衰老相关表型，如细胞体积增大、细胞器功能障碍、衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase, SA-β-Gal）活性增强、细胞周期阻滞、炎症反应和氧化应激增加，导致衰老相关心脏功能障碍发生[4]。清除或减少衰老心肌细胞是治疗衰老相关疾病的有效手段[5]。目前尚无有效的药物改善衰老相关心脏功能障碍。因此，探索心脏衰老的分子机制，并根据病理机制寻找新的靶向治疗药物是十分必要的。

溶酶体是细胞内的一种膜性细胞器，主要负责细胞内代谢调控[6]。溶酶体中含有多种水解酶，能够在胞吞和自噬过程中降解细胞外和细胞内的生物大分子[7]。近年来的研究表明，溶酶体不仅在分解代谢中起关键作用，还作为细胞信号转导中心，调控溶酶体生成和功能，在维持细胞和机体稳态中起着重要作用[8]。在衰老相关疾病中，溶酶体功能失调与细胞生长密切相关[9‒10]。瞬时受体电位黏蛋白1（transient receptor potential mucolipin 1, TRPML1）是由黏脂蛋白1（mucolipin 1）基因（MCOLN1）编码的一种钙离子通道，胞质内的N端和C端主要位于溶酶体膜上，具有六个跨膜螺旋结构[11]。TRPML1通过调控溶酶体内钙离子转运及转录因子EB（transcription factor EB，TFEB）的活性，控制自噬及溶酶体的生成[12]。TRPML1的缺失导致底物运输障碍和溶酶体降解功能异常，进而影响溶酶体通过胞吐进入质膜[13]。此外，TRPML1介导的钙离子释放异常会抑制自噬与溶酶体的结合[14]。TRPML1对溶酶体功能及自噬过程具有重要的调节作用，但衰老对TRPML1表达及其对细胞生长调控的影响仍不明确。

长链非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNAs）是一类长度超过200个核苷酸的RNA分子，能够通过多种机制调控基因表达[15]。LncRNA参与了细胞分化、发育和代谢等多种生物过程[16]。本研究团队以往的研究表明，lncRNA是多种心血管疾病（cardiovascular diseases, CVDs）的调节因子，包括心脏衰老、心肌梗死、心律失常和动脉粥样硬化[17‒19]。此外，lncRNA在衰老相关疾病中的作用也得到了越来越多的关注。例如，研究表明沉默lncRNA Zeb2-NAT有助于衰老成纤维细胞的重编程；另一项研究则发现lncRNA能够抑制衰老诱导的心肌肥大[20‒21]。然而，lncRNA在心脏衰老中的具体功能及调控机制仍不清楚。通过RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）分析，我们发现了一种在衰老小鼠心脏中显著上调的lncRNA——锌指E-box结合同源盒1的反义链1（zinc finger E-box binding homeobox 1 opposite strand 1, Zeb1os1，在人类中称为ZEB1-AS1）。已有研究表明，ZEB1-AS1在肝癌、胰腺癌、口腔鳞状细胞癌和结直肠癌中具有致病作用[22‒25]。尽管有研究发现其可减轻糖尿病小鼠的心肌纤维化，但ZEB1-AS1在心脏衰老中的作用尚不明确[26]。

本研究揭示了Zeb1os1作为心脏衰老的关键调节因子和潜在生物标志物的作用。通过进一步研究，我们发现Zeb1os1作为TRPML1的抑制剂，诱导溶酶体功能障碍，并加剧心脏衰老。这为心脏衰老的治疗提供了新的靶点。

2 材料与方法

2.1 临床样本

本研究从哈尔滨医科大学第二附属医院的120名患者中筛选志愿者，进行了体检和超声心动图检查。排除标准包括：高血压（收缩压大于140 mmHg或舒张压大于90 mmHg）、糖尿病或空腹血糖水平大于126 mg∙dL-1、心脑血管疾病、体重指数（body mass index, BMI）大于25 kg∙m-2或慢性阻塞性肺疾病等。最终49名志愿者被纳入研究。本研究已获得哈尔滨医科大学伦理委员会批准，并严格遵循《赫尔辛基宣言》的伦理要求（批准号：IRB5041721）。志愿者的详细临床信息见附录A表S1。

2.2 动物衰老模型及腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）的构建

本研究中使用的雄性C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验严格遵循欧盟2010/63/EU关于动物实验的相关规定。所有实验操作均获得哈尔滨医科大学伦理委员会批准（批准号：IRB5041721）。

（1）AAV有多种血清型，其中AAV9在心脏组织的感染效率最高。因此，我们选择AAV9血清型设计Zeb1os1敲减和过表达载体。采用耐氨苄西林双链腺相关病毒（double-stranded adeno-associated virus, dsAAV）质粒，分别插入60 bp的shZeblosl序列和717 bp的EGFP序列，构建Zeb1os1干扰质粒（shZeb1os1）。重组质粒启动子为结合巨细胞病毒早期增强子元件、肌动蛋白启动子和珠蛋白内含子的合成启动子（a synthetic promoter combining the cytomegalovirus early enhancer element, chicken actin promoter, and globin intron, CAG）和H1 RNA聚合酶III启动子（H1 RNA polymerase III promoter, H1），在亚克隆位点下游有一个牛生长激素（bovine growth hormone, BGH）的A序列。以AAV质粒为载体，将Zeb1os1全长序列和EGFP序列插入巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）启动子下游的亚克隆位点，构建腺相关病毒Zeb1os1过表达质粒。这些病毒载体在-80 ℃条件保存，并测序验证以确保准确性。

（2）实验动物为2月龄和18月龄的C57BL/6小鼠。衰老小鼠经尾静脉注射Zeb1os1敲减腺相关病毒（AAV-shZeb1os1），年轻小鼠经尾静脉注射Zeb1os1过表达腺相关病毒（AAV-Zeb1os1），每2个月注射一次，滴度为2 × 1011 GC（GC为含基因组颗粒，病毒溶于生理盐水，注射量为150 µL∙只-1），共注射三次，第一次注射后六个月进行检测。对照组小鼠给予相同剂量的生理盐水，阴性对照组小鼠注射阴性对照shRNA序列（AAV-shNC）或空质粒腺相关病毒（AAV-NC），每组6只小鼠。实验小鼠通过腹腔注射阿氟汀（0.2 g∙kg-1）进行麻醉[27]，后续通过放血法实施安乐死，相关操作流程遵循《美国兽医协会动物安乐死指南》。阿氟汀对心功能和心率的影响相对较小，与异氟烷或氯胺酮复合麻醉剂相比有明显优势[28‒29]，因此在动物心血管稳态实验研究中是首选麻醉剂[30]。

2.3 RNA-seq分析

（1）RNA提取：按照制造商指南（Bohao）使用RNeasy Mini Kit（Cat#74106; QIAGEN，德国）提取心肌样品（年轻组和老年组）RNA并用Agilent生物分析仪2100（Agilent technologies，美国）进行评估。为了进一步纯化RNA，我们使用RNA Clean XP Kit（Cat#A63987; Beckman Coulter，美国）和RNase-Free DNase Set（Cat#79254; QIAGEN, GmBH, 德国）。使用NanoDrop ND-2000（Thermo Scientific，美国）进行定量。

（2）转录组深度测序：每个样本组构建RNA文库，进行RNA高通量测序。主要步骤包括去除核糖体RNA、总RNA片段化、逆转录、第二链互补DNA合成、末端修复、dA尾部添加和接头连接。最终互补DNA（complementary DNA, cDNA）文库通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增和纯化，在Illumina HiSeq2500平台（Illumina，美国）上进行测序。

（3）差异lncRNA筛选：使用EdgeR软件分析差异表达lncRNA [31]。归一化后，采用Benjamini-Hochberg方法进行多假设检验调整。筛选出|logFC|大于3且调整后p值小于0.05的差异表达lncRNA，并通过热图展示这些差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）的表达模式。

2.4 超声心动图评价心脏功能

使用VisualSonics Vevo 2100超声仪和30 MHz高频换能器（VisualSonics，加拿大）获得超声心动图来评估心脏功能。小鼠通过腹腔注射0.2 g·kg-1的阿氟汀进行麻醉（Sigma，美国）。成像采用胸骨旁长轴（parasternal long axis, PLAX）、短轴（short axis, SAX）和心尖四腔（apical four chambers, A4C）三种视角，并使用B-模式、M-模式和P-模式进行拍摄。在严格控制的时间框架内完成各项程序，以确保测量的准确性。评估的指标包括舒张早期二尖瓣流速（E）/舒张晚期二尖瓣流速（A）比和E峰二尖瓣血流速度（mitral flow velocity at E peak，MV E peak）。此外，还测量了左室射血分数（ejection fraction, EF）、缩短分数（fractional shortening, FS）、等容舒张时间（isovolumic relaxation time, IVRT）、左室后壁直径（left ventricular posterior wall diameter, LVPWD）和左室质量（left ventricular mass, LV mass）。在成像过程中避免对胸部施加过大的压力，并确保小鼠的心率维持在每分钟400~500次之间。

2.5 组织处理及病理学评价

心脏组织固定于10%福尔马林溶液中，然后脱水处理并包埋于石蜡中。将包埋后的组织切成4 µm厚的切片用于显微镜检查。通过苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色观察心脏组织的结构变化，马松三色染色用于评估心脏胶原的分布情况。

2.6 免疫组织化学检测

免疫组织化学用于检测心肌组织中TRPML1的表达。石蜡切片经脱蜡处理后，首先在室温下用山羊血清（Cat#AR0009；博斯特）孵育30 min。随后，将切片置于4 ℃条件下与兔源抗小鼠TRPML1抗体（Cat#ACC-081；Alomone Labs，以色列）孵育。经过一抗孵育后，使用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记的山羊抗兔二抗（1∶200, Cat#A0216；碧云天生物技术公司）在室温下孵育30 min。通过3,3'-二氨基联苯胺（3,3'-diaminobenzidine, DAB）显色，并用苏木精进行复染。TRPML1阳性细胞在光镜下呈现棕色或黄棕色颗粒。

2.7 原代心肌细胞和心脏成纤维细胞培养

从1~3日龄的新生小鼠分离原代心肌细胞和心脏成纤维细胞。在无菌条件下采集心脏，切碎并清洗后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞。消化后的细胞经离心后重新悬浮于含有10%胎牛血清、100 U∙mL-1青霉素和100 μg∙mL-1链霉素的Dulbecco改良培养基（Dulbecco's modified eagle medium, DMEM）中。细胞混合物在培养瓶中于37 ℃孵育1.5 h，以便成纤维细胞贴壁，未贴壁的心肌细胞单独培养。为去除成纤维细胞，在心肌细胞培养基中添加10 nmol∙L-1的5-溴-2-脱氧尿苷（5-Bromo-2-deoxyUridine, 5-BrdU, Cat#B5002; Sigma）。细胞在含有5% CO2的湿润环境中，于37 ℃孵育48 h，用于后续实验。

2.8 永生化细胞系

AC16人类心肌细胞系（Cat#SCC109, Millipore Sigma，美国）具有典型心肌细胞的生化和形态特征。AC16细胞在DMEM: F12（Cat#SH30023.01; HyClone，美国）培养基中培养，培养基中添加10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1%抗真菌剂（Cat#C0222；碧云天）。细胞在37 ℃、5% CO2和95%空气的湿润环境中培养以维持生长。

2.9 细胞转染

Zeb1os1特异性siRNA（siZeb1os1）和对照siRNA（siNC）由Ribobio合成。将100 nmol∙L-1的siRNA转染到细胞中以敲减Zeb1os1。同时，将Zeb1os1的cDNA克隆至巨细胞病毒DNA3.1质粒载体（OE-Zeb1os1），用于过表达实验。对照组则使用空载体（OE-NC）。质粒的转染浓度为2.5 mg∙L-1。转染过程按照制造商说明，使用X-treme GENE转染试剂（Cat#10810500; Roche，瑞士）进行。转染48 h后，收集心肌细胞用于RNA提取或蛋白质提取。siZeb1os1的序列如下：正义链5'-CGGAUGAACUGUUAAUAAACC-3'，反义链5'-UUUAUUAACAGUUCAUCCGGU-3'。

2.10 SA-β-gal染色

按照试剂盒说明，使用β-半乳糖苷酶染色试剂盒（Cell Signaling Technology，美国）进行操作。首先，将细胞或心脏组织的冰冻切片在室温下固定10~15 min，然后用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline, PBS）清洗两次。随后，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色溶液，在37 ℃、无二氧化碳的条件下孵育12 h。孵育结束后，使用光学显微镜（Carl Zeiss Microscopy，德国）观察样本。

2.11 实时定量PCR（Quantitative real-time PCR, qRT-PCR）

为了检测Zeb1os1的表达，首先使用TRIzol试剂（Invitrogen，美国）提取总RNA。接着，使用SYBR Green实时PCR主混合液试剂盒（Toyobo，美国）进行qRT-PCR反应。PCR反应体系为20 µL，其中包含1 µL的正向和反向引物、1 μL的cDNA、10 µL SYBR Green PCR主混合液，剩余体积用无核酸酶水补足。按照规定的循环参数进行反应，每个基因重复三次。使用2-ΔΔCT方法（CT代表循环阈值，而ΔΔCT表示目标基因与参照基因之间CT值的标准化差异）计算相对基因表达量，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）作为内参。通过熔解曲线分析来评估扩增的特异性和质量。RT-PCR所用引物详见附录A表S1。

2.12 蛋白质印迹分析

每份样品取100 µg蛋白，加载到10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）凝胶中，电泳分离后转移至硝酸纤维素膜（PALL，美国）。膜在5%的脱脂奶粉溶液中封闭2 h后，在4 ℃下与一抗孵育过夜，所用一抗包括p21（Cat#ab188224; Abcam，美国）、p53（Cat#9282; Cell Signaling Technology，美国）、LC3（Cat#ab192890; Abcam）、p62（Cat#ab109012; Abcam）、Lamp1（Cat#ab208943; Abcam）和TRPML1，GAPDH（Cat#TA-08；中山金桥）作为内参。孵育后，使用Odyssey红外成像系统（LI-COR，美国）对蛋白条带进行定量分析。

2.13 电子显微镜检查

将小鼠心脏组织和心肌细胞置于2.5%戊二醛溶液中，在4 ℃下固定过夜。随后用2%四氧化锇处理样品70 min。样品经过梯度乙醇系列脱水后，使用乙酸铀和柠檬酸铅进行染色。染色后的样品通过电子显微镜（JEOL公司，日本）进行拍摄。

2.14 流式细胞术

新生小鼠心肌细胞（neonatal mouse cardiomyocytes，NMCMs）经过消化后收集，并用PBS彻底清洗三次，随后在1000 g下离心5 min。细胞在4 ℃下用70%预冷乙醇固定12 h以上。固定完成后，在4 ℃黑暗环境下处理细胞，加入核糖核酸酶（ribonuclease, RNase）和碘化丙啶孵育30 min。通过流式细胞仪（CytoFLEX；贝克曼库尔特）检测碘化丙啶信号，对细胞周期进行分析。通过CytExpert 2.0软件（贝克曼库尔特公司，美国）处理分析实验数据。

2.15 免疫荧光染色

（1） 将细胞接种在预处理过聚-L-赖氨酸的玻片上培养。培养后，细胞用PBS清洗两次，固定在3.7%的甲醛溶液中，然后用PBS/0.1% Triton-X/3%牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）在室温下封闭30 min。随后，细胞与抗Actinin（Cat#A7811, 1∶200; Sigma）和抗Lamp-1（Cat#ab25245; Abcam）或抗TFEB（Cat#A303-673A, 1∶200; Bethyl Laboratories，美国）的一抗孵育。二抗使用结合Alexa Fluor 594或Alexa Fluor 488的抗体。PBS清洗三次后，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）（Cat#D1306; Thermo Scientific）对细胞核进行染色，随后用PBS冲洗。最终使用共聚焦激光显微镜（LSM780; Zeiss Microsystem）获取图像并进行分析。

（2） 细胞在37 ℃下与500 nmol∙L-1的LysoTracker（碧云天生物技术公司）孵育30 min，用于标记溶酶体。为了量化LysoTracker的荧光强度，每个独立实验随机选取三个不同的盖玻片拍摄图像。DAPI染色用于可视化细胞核。最终使用共聚焦激光显微镜（LSM780; Zeiss Microsystem）观察荧光信号。

2.16 细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）检测

使用荧光染料2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA）测量细胞内的ROS水平。处理后的NMCMs在37 ℃下与DCFH-DA（20 μmol∙L-1，碧云天生物技术公司）孵育30 min，然后用PBS清洗。随后在荧光显微镜（Carl Zeiss Microscopy）下拍摄荧光图像。

2.17 RNA-蛋白质相互作用分析——RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation, RIP）实验

RIP实验使用Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒（Cat#17-701; Millipore，德国）进行。提取的RNA使用ReverTraAce qPCR RT试剂盒（Cat#FSQ-101; Toyobo）转录为cDNA。目标基因通过SYBR Green PCR主混合试剂盒（Toyobo）在7500快速实时PCR系统（AB Applied Biosystems，美国）上进行定量。通过熔解曲线分析来评估扩增的特异性和质量。

2.18 RNA-蛋白质下拉（pull-down）实验

将Zeb1os1序列通过亚克隆插入巨细胞病毒DNA3.1载体。使用T7 RNA聚合酶试剂盒（Cat#D7069；碧云天生物技术公司）进行离体RNA转录。随后使用RNA 3′端Desthiobiotin化试剂盒（Cat#20163; Oshkosh，美国）对RNA转录物进行标记。RNA-蛋白质下拉实验使用Pierce磁性RNA-蛋白质下拉试剂盒（Cat##20164; Pierce）进行。通过蛋白质印迹分析Zeb1os1与TRPML1蛋白的相互作用情况。

2.19 免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation, CO-IP）实验和泛素化（ubiquitination, UB）分析

MG132（Cat#2194; CST，美国）处理细胞12 h后，使用预冷的放射免疫沉淀实验缓冲液裂解细胞。提取的蛋白与结合抗TRPML1抗体（Cat#ACC-081; Alomone Labs）的Protein A/G PLUS琼脂糖（Santa Cruz Biotechnology）在4 ℃摇床上孵育12 h以上。免疫沉淀的蛋白通过蛋白质印迹分析，使用抗泛素（Cat#58395; Cell Signaling Technology）和抗TRPML1的抗体进行检测。

2.20 活细胞成像监测自噬流

使用荧光探针监测细胞中的自噬流。通过腺病毒系统将红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-轻链3蛋白（red fluorescent protein-green fluorescent protein-light chain 3, RFP-GFP-LC3）荧光探针（汉恒生物）转染入细胞。转染24 h后，使用共聚焦激光显微镜（Olympus，日本）监测自噬流的变化。

2.21 心肌细胞中溶酶体钙释放的测定

（1）染料制备：将50 mg的Fluo-3染料（Cat#F1242; Invitrogen）溶解在50 μL DMSO中，制备染料储备液A。将2 mg的F127（BASF，美国）粉末混入1 mL钙溶液中，制备染料储备液B。染料工作液的配方为5 μL储备液A + 65 μL储备液B + 930 μL钙溶液。

（2）心肌细胞染色：将染料工作液加入含有心肌细胞的24孔板中，37 ℃孵育35 min。弃去上清液，用移液器将细胞用钙溶液清洗三次，然后将细胞悬浮于新鲜的钙溶液中备用。

（3）溶酶体钙释放的测定：先用离子霉素（Sigma）处理心肌细胞5 min，然后用ML-SA1（Sigma）刺激细胞，并使用flash4.0 LT相机进行成像，持续约4 s。荧光强度的变化代表细胞内钙浓度的变化，ΔF代表荧光信号变化，F 0为背景荧光值，ΔF/F 0代表心肌细胞钙释放的最大值。

2.22 细胞质和细胞核中RNA的提取

使用NE-PER细胞核和细胞质提取试剂盒（Pierce）。从心肌细胞中分离提取RNA。简言之，细胞用PBS清洗两次后离心，之后将细胞重悬于细胞质提取试剂I中进行处理。离心后，收集上清液作为细胞质RNA。细胞沉淀重悬于细胞核提取试剂中，在冰上孵育并离心，最终获得细胞核RNA。

2.23 溶酶体酶活性测定

使用特定的组织蛋白酶D（cathepsin D, CTSD）和组织蛋白酶B（cathepsin B, CTSB）活性检测试剂盒（Cat#Ab65302和Ab65300；Abcam），根据制造商的说明检测并量化CTSD和CTSB的活性。

2.24 成年小鼠心肌细胞分离

通过腹腔注射2%的阿氟汀（剂量为0.2 g∙kg-1）麻醉成年小鼠。迅速摘除心脏并连接Langendorff装置进行逆行灌注。在无钙Tyrode溶液灌注3~5 min后，使用II型胶原酶（1 mg∙mL-1, Gibco，美国）和BSA（1 mg∙mL-1, BioFroxx，德国）进行心脏灌注。心肌组织软化后，分离左心室并在无钙Tyrode溶液中轻柔吹吸以分离心肌细胞。分离后的心肌细胞在含有0.18 mmol∙L-1 CaCl2和1% BSA的Tyrode溶液中进行平衡处理。

2.25 荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）

FISH实验使用Ribo FISH试剂盒（Cat#R11060.10; Ribobio）进行。按照试剂盒说明，对Zeb1os1进行FISH探针染色。样品在37 ℃孵育30 min后，与20 μmol∙L-1 Zeb1os1 FISH探针混合物在室温下杂交12 h。用柠檬酸钠盐水缓冲液（saline-sodium citrate, SSC）和PBS/Tween-20溶液进行清洗，并用DAPI对细胞核染色。最后，使用共聚焦荧光显微镜进行成像分析。

2.26 分子对接

TRPML1的晶体结构（编号：5jw5）从结构生物信息学研究协作数据库（research collaboratory for structural bioinformatics Protein Data Bank, RCSB PDB）获取。通过ViennaRNA网络服务和3dRNA/DNA Web服务器预测Zeb1os1功能片段（functional domain, FD）的三维结构。使用HEX8.0软件计算两者的结合亲和力，结合复合物通过PyMOL软件进行可视化和调节。

2.27 细胞核/细胞质蛋白分离

细胞核和细胞质蛋白的分离使用ExKine核质蛋白提取试剂盒（Cat#KTP4002; Abbkine）。使用细胞刮刀收集贴壁细胞，随后在500g下离心5 min。细胞重悬于预冷的PBS中并再次离心，沉淀物用细胞质提取试剂处理以分离细胞质蛋白。剩余的沉淀则使用核提取试剂处理以分离出核蛋白。两部分的提取物均保存在冰上或-80 ℃下以备进一步分析。

2.28 数据分析

所有数据均使用SPSS 25.0（IBM，美国）和GraphPad Prism 9.0进行统计分析。对于多组比较，使用单因素方差分析（ANOVA），并进行Tukey事后检验。对于两组比较，使用Student双尾t检验。统计学显著性定义为p < 0.05。

3 结果

3.1 长链非编码RNA Zeb1os1在衰老心脏中上调

为了解衰老心脏中lncRNA表达的变化，我们从年轻（2个月）和老年（24个月）小鼠心脏中提取RNA样本进行RNA-seq分析，鉴定出多种具有统计学意义的差异表达lncRNA。在这些lncRNA中，有的在老年组中显著上调（红色），而有的则显著下调（绿色）[图1（a）]。我们选择了具有跨物种保守性的五种显著上调的lncRNA，并通过qRT-PCR验证其表达。结果显示，与年轻对照组相比，NONMMUT031348.2（即Zeb1os1）在衰老心脏中显著上调[图1（b）]。为了进一步探究ZEB1-AS1在人类心脏中的表达情况，我们利用单细胞数据库工具（singlecell.broadinstitute.org）分析了ZEB1-AS1在各种心脏细胞类型中的表达水平（附录A图S1）。结果显示，ZEB1-AS1在心肌细胞和成纤维细胞中高表达。因此，我们聚焦于其对心脏衰老的作用。此外，Zeb1os1在心肌细胞的细胞核和细胞质中均有分布[图1（c）]。D-半乳糖（D-galactose, D-gal）是一种常用的体内和体外人工诱导衰老的物质[32]。与对照组相比，D-gal处理后，NMCMs中Zeb1os1的表达显著增加[图1（d）]，在AC16细胞系中也得到了相似的结果[图1（e）]。通过FISH，我们检测了年轻和老年小鼠心肌细胞中的Zeb1os1表达，结果显示老年小鼠心肌细胞中Zeb1os1的表达显著高于年轻小鼠（附录A图S2）。为了进一步探讨ZEB1-AS1与心脏衰老的关系，我们测量了不同年龄健康成人血液中的ZEB1-AS1 mRNA水平。研究共纳入了49名受试者（包括心脏舒张功能正常与减退个体），表1中详细描述了他们的临床特征。E/A比率是评估舒张功能的一个已知指标，结果显示随着年龄增长，E/A比率显著下降[图1（f）和（g）]。此外，ZEB1-AS1在老年人血液中的表达水平显著高于年轻人，而性别差异不显著[图1（h）；附录A图S3]。单变量和多变量分析（表2）均显示，ZEB1-AS1水平与年龄呈显著正相关，且与E/A比率呈负相关。这些结果表明，ZEB1-AS1（Zeb1os1）可能作为一种反映心脏衰老的循环生物标志物，具有潜在的临床应用价值。

3.2 Zeb1os1损害小鼠心脏舒张功能

我们猜想上调Zeb1os1对心脏功能产生不利影响，过表达Zeb1os1可能诱发心脏衰老表型。为验证这一猜想，我们将携带Zeb1os1基因的腺相关病毒9型（AAV9）载体（AAV-Zeb1os1）转染至年轻的野生型小鼠（2月龄），并持续处理六个月。结果显示，阴性对照组（AAV-NC）未改变Zeb1os1的表达水平，而AAV-Zeb1os1显著增加了小鼠心脏中Zeb1os1的表达[图2（a）；附录A图S4]。脑钠肽（brain natriuretic peptide, BNP）作为心脏衰老的生物标志物，常用于舒张功能障碍的诊断[33]。我们的结果表明，AAV-Zeb1os1显著提高了小鼠血清中BNP水平[图2（b）]。此外，超声心动图评估结果显示，AAV-Zeb1os1处理导致小鼠的E/A和MV E显著降低，IVRT增加[图2（c）~（f）]，表明这些小鼠的左心室舒张功能受损。然而，EF和FS等收缩功能参数在AAV-Zeb1os1处理后没有显著变化[图2（g）和（h）]。鉴于舒张功能障碍是左心室肥厚的常见原因之一[34]，我们观察到AAV-Zeb1os1处理的小鼠LVPWD和LV质量显著增加[图2（i）和（j）]。H&E染色结果进一步证实了心肌细胞横截面积的增大，表明心肌肥厚[图2（k）；附录A图S5]确实发生。马松染色结果也显示AAV-Zeb1os1诱导心脏纤维化，这是衰老心脏常见的特征[图2（l）；附录A图S5]确实发生。进一步，我们使用SA-β-gal染色验证心脏衰老，AAV-Zeb1os1处理组心脏中SA-β-gal阳性面积增大[图2（m）]，衰老标志物p53和p21表达水平也显著上调[图2（n）和（o）]，提示AAV-Zeb1os1诱导心脏衰老。综上所述，Zeb1os1通过损害小鼠心脏舒张功能、引发心脏肥厚和纤维化并促进心肌细胞衰老，成功诱导典型的心脏衰老表型。这些结果表明Zeb1os1在心脏衰老过程中起到关键作用。

3.3 敲减Zeb1os1减轻自然衰老小鼠的心脏功能障碍

为探究Zeb1os1是否可以作为心脏衰老的潜在治疗靶点，我们采用功能缺失策略，使用携带Zeb1os1-shRNA片段的AAV9载体（AAV-shZeb1os1），测试Zeb1os1敲减对自然衰老小鼠心脏功能的影响。通过qRT-PCR和免疫荧光验证了AAV-shZeb1os1对小鼠心肌内源性Zeb1os1的敲减效果，结果显示Zeb1os1的转录水平显著下降[图3（a）；附录A图S4]。AAV-shZeb1os1可有效抑制衰老小鼠中BNP水平的升高[图3（b）]。随后，我们评估了不同组小鼠的心脏功能。衰老小鼠表现出明显的左心室舒张功能障碍，具体表现为E/A和MV E降低，IVRT增加。而在AAV-shZeb1os1处理后，这些参数均得到显著改善[图3（c）~（f）]。EF和FS在AAV-shZeb1os1处理后未发生显著变化[图3（g）和（h）]。此外，与年轻对照组相比，衰老小鼠表现出严重的心脏肥厚，表现为LVPWD和LV质量增加，而AAV-shZeb1os1处理改善了这一现象[图3（i）和（j）]。H&E染色和马松染色证实，AAV-shZeb1os1减轻了衰老小鼠心脏重构[图3（k）和（l）；附录A图S5]。同时，SA-β-gal染色结果表明，AAV-shZeb1os1减轻小鼠心脏衰老的程度[图3（m）]。此外，AAV-shZeb1os1处理显著抑制了衰老标志物p53和p21上调[图3（n）和（o）]。这些结果表明，敲减Zeb1os1能够有效延缓心脏衰老进程，并减轻由衰老引发的心脏功能障碍。

3.4 Zeb1os1促进心肌细胞衰老

为进一步探究Zeb1os1在心肌细胞衰老中的作用，我们通过外源转染Zeb1os1质粒（OE-Zeb1os1）过表达Zeb1os1 [图4（a）]，同时使用siZeb1os1敲减Zeb1os1 [图4（b）；附录A图S6]，研究其对心肌细胞衰老的影响。SA-β-gal染色结果显示，OE-Zeb1os1显著增加了衰老心肌细胞的数量[图4（c）和（d）]，而siZeb1os1敲减后，SA-β-gal阳性细胞数量显著减少[图4（e）和（f）]。ROS在推动细胞衰老过程中扮演了重要角色[35]。我们的研究结果表明，Zeb1os1的过表达导致了心肌细胞衰老，表现为ROS显著增加。相反，siZeb1os1敲减后，衰老心肌细胞中的ROS积累显著减少[图4（g）~（j）]。为进一步探究Zeb1os1对心肌细胞功能的影响，我们评估了心肌细胞收缩和舒张功能变化。结果显示，D-gal处理或Zeb1os1过表达损害了心肌细胞的收缩和舒张功能，且每分钟搏动（beats per minute, BPM）显著减少。相反，敲减Zeb1os1改善了D-gal的有害影响（附录A图S7）。衰老通常伴随细胞周期停滞[36]。通过流式细胞术分析细胞周期分布发现，Zeb1os1的过表达导致了典型的衰老心肌细胞表型（G0/G1期细胞比例增加，G2/M期细胞比例减少）。而敲减siZeb1os1后逆转了这些效应[图4（k）~（n）]。此外，心肌细胞经过Zeb1os1和D-gal处理后，衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）显著增加，而siZeb1os1处理后SASP水平被抑制[图4（o）和（p）]。这些结果表明，Zeb1os1通过诱导ROS产生、促进细胞周期停滞和增加SASP表达，促进心肌细胞衰老，而敲减Zeb1os1显著改善这些特征。

3.5 Zeb1os1在心脏衰老过程中调节溶酶体功能

为了探究Zeb1os1调控心脏衰老的潜在机制，我们利用基于RNA-seq揭示的差异表达基因，进行基因本体（gene ontology, GO）富集分析。其中，多个富集的生物过程与细胞组分和溶酶体功能相关，用红色箭头标记[图5（a）]。为进一步验证这些发现，我们使用透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）观察心脏组织中与溶酶体功能相关的显微结构变化。结果显示，AAV-Zeb1os1处理的小鼠心脏组织中，溶酶体、自噬溶酶体及吞噬体数量减少，且线粒体受损[图5（b）]。由于溶酶体相关膜蛋白1（lysosome-associated membrane protein 1, Lamp1）是溶酶体膜的重要组成部分，也是衡量溶酶体数量和完整性的标志物[37]，我们检测了不同组小鼠心脏组织中Lamp1的表达水平。免疫荧光结果显示，在AAV-Zeb1os1处理的小鼠心脏中，Lamp1在细胞质中靠近细胞边缘的点状定位减少，且Lamp1蛋白水平下降[图5（c）和（d）]。自噬依赖于溶酶体的大规模降解，因此我们进一步探讨了自噬过程的变化。蛋白质印迹结果显示AVV-Zeblos1组的LC3II和自噬体适配蛋白p62水平增加，这表明AAV-Zeb1os1处理组中自噬体积累、自噬体与溶酶体的融合效率下降[图5（d）]。接下来，我们在自然衰老小鼠中评估了Zeb1os1的敲减是否影响溶酶体功能。在未干预的老年小鼠心脏中，观察到溶酶体功能障碍，如溶酶体数量减少、线粒体肿胀和肌节断裂，这些与AAV-Zeb1os1过表达的小鼠表现相似。然而，AAV-shZeb1os1处理后，溶酶体功能障碍显著减轻[图5（e）]。此外，老年小鼠心脏中的Lamp1表达减少，免疫荧光和蛋白质印迹结果都支持这一发现[图5（f）和（g）]。与之前的研究[17,38]一致，衰老心脏中自噬体和自噬溶酶体的形成受阻，导致LC3II水平降低、p62水平升高。而这些溶酶体功能的恶化在AAV-shZeb1os1处理后显著逆转[图5（g）]。综上所述，Zeb1os1通过调节溶酶体功能，推动了心脏衰老的进程，其敲减能够显著改善溶酶体功能障碍并延缓心脏衰老。

3.6 Zeb1os1直接与TRPML1蛋白结合

为了进一步明确Zeb1os1调控心脏衰老的下游靶点，我们分析了与溶酶体相关的两个富集最显著的生物过程（内体运输和自噬）以及两大细胞组分（晚期内体和溶酶体膜）中的失调基因。图6（a）中的Venn图显示了这些基因的重叠，结果表明Clec16a、MCOLN1和Ubxn6这三种基因有重叠。MCOLN1编码的TRPML1是位于溶酶体膜上的钙离子通道，负责将Ca2+释放到胞质中，调节溶酶体生成并促进自噬溶酶体的形成[39]。我们首先研究了TRPML1在衰老心脏中的表达是否受到影响，并探讨了Zeb1os1在溶酶体功能中的作用。结果显示，在Zeb1os1过表达的小鼠心脏中，MCOLN1对应蛋白（TRPML1）的表达显著下降[图6（b）和（c）]。同样，老年小鼠心脏中TRPML1表达明显低于年轻小鼠，而AAV-shZeb1os1处理后，TRPML1水平得以恢复[图6（d）和（e）]。在细胞水平，Zeb1os1的过表达显著抑制了TRPML1的蛋白水平，而敲减Zeb1os1（siZeb1os1）显著增加了D-gal处理后的TRPML1水平，但Zeb1os1对其mRNA水平没有影响[图6（f）和（g）；附录A图S8]。LncRNAs通常通过与功能蛋白相互作用发挥其调控作用[18,40‒41]，因此，我们测试了Zeb1os1是否可以与TRPML1蛋白结合来调节其功能。通过RNA-蛋白质相互作用预测（RNA-protein interaction prediction, RPISeq）数据库分析，我们发现Zeb1os1与TRPML1之间有较高的相互作用可能性（附录A图S9）。接下来，RIP实验进一步验证了这种相互作用。如图6（h）所示，TRPML1免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）成功捕获了大量Zeb1os1，表明Zeb1os1与TRPML1具有强结合亲和力。此外，Zeb1os1在NMCMs中反捕TRPML1的结果也进一步支持这一发现[图6（i）]。为了揭示Zeb1os1导致TRPML1蛋白减少的潜在机制，我们研究了几种蛋白质降解途径。结果显示，蛋白酶体抑制剂MG132能够阻止Zeb1os1诱导的TRPML1下调，而溶酶体抑制剂氯喹（chloroquine, CQ）没有类似效果[图6（j）]。此外，我们检测了TRPML1的泛素化水平，结果表明在Zeb1os1过表达的NMCMs中，TRPML1的泛素化水平显著升高，这表明Zeb1os1促进了TRPML1的泛素化，从而诱导其通过蛋白酶体途径降解[图6（k）]。

为了进一步验证TRPML1在延缓心脏衰老中的潜在作用，确认其是否通过改善溶酶体功能来延缓细胞衰老，我们在D-gal处理的NMCMs中进行了相关研究。结果表明，D-gal处理后TRPML1的表达水平下降，而TRPML1过表达质粒能够使其恢复至正常水平[附录A图S10（a）]。如预期所示，TRPML1的过表达在D-gal预处理的细胞中上调了Lamp1的水平[附录A图S10（b）]。此外，TRPML1改善了自噬过程，表现为LC3II水平的增加和p62蛋白水平的降低[附录A图S10（c）和（d）]。在D-gal预处理的细胞中，TRPML1还抑制了衰老标志物p53和p21的表达[附录A图S10（e）和（f）]。SA-β-gal染色结果显示，TRPML1的过表达有效消除了衰老细胞比例增加的情况[附录A图S10（g）]）。这些结果证实，Zeb1os1通过与TRPML1结合，促进TRPML1的泛素化和降解，从而损害溶酶体功能并加速心肌细胞衰老。同时，TRPML1是改善溶酶体功能和清除衰老细胞的有效治疗靶点。

3.7 Zeb1os1通过靶向作用TRPML1调节心肌细胞的溶酶体功能

我们进一步通过评估溶酶体生成、自噬溶酶体形成及溶酶体酶活性，证实Zeb1os1对溶酶体功能的调节作用，并探究Zeb1os1对TRPML1介导的溶酶体Ca2+释放的影响。结果表明，TRPML1激活剂ML-SA1能诱导溶酶体Ca2+释放，但在Zeb1os1过表达（OE-Zeb1os1）和D-gal预处理组中，Ca2+电流幅度显著降低；而在转染siZeb1os1后，Ca2+释放水平恢复[图7（a）和（b）]。溶酶体Ca2+释放驱动TFEB的核转位，而TFEB是溶酶体生成及自噬的关键调控因子[42]。免疫荧光染色和蛋白质印迹实验结果显示，OE-Zeb1os1显著抑制了TFEB的核转位，而siZeb1os1显著促进了衰老心肌细胞中TFEB的核转位[图7（c）和（d）；附录A图S11]。

我们还通过Lamp1和LysoTracker的免疫荧光染色进一步确认了溶酶体生成的变化。与体内实验结果一致，OE-Zeb1os1在心肌细胞中显著损害了溶酶体功能，表现为Lamp1和LysoTracker荧光强度的显著降低[图7（e）和（f）]。此外，我们评估了溶酶体介导的自噬功能。通过RFP-GFP-LC3双标腺病毒转染的NMCMs显示，OE-Zeb1os1处理导致黄色信号（自噬体）增强，红色信号（自噬溶酶体）减弱，表明自噬体与溶酶体的融合受阻[图7（g）]。在D-gal诱导的衰老心肌细胞中，溶酶体数量显著减少，但经过siZeb1os1处理后，溶酶体数量恢复[图7（h）和（i）]。D-gal处理组中的黄色和红色信号均减弱，提示自噬流受到抑制[图7（j）]，而Zeb1os1敲减能够逆转这一现象[图7（j）]。

为了进一步研究Zeb1os1对自噬过程的影响，我们使用Bafilomycin A1（BafA1）阻断自噬体与溶酶体的融合。实验结果表明，BafA1处理导致自噬溶酶体形成减少、自噬体积累，而Zeb1os1敲减能够显著逆转BafA1在对照组和D-gal处理的NMCMs中引起的自噬流阻断（附录A图S12）。同时，通过测定关键溶酶体酶CTSB和CTSD的活性进一步量化溶酶体功能。OE-Zeb1os1显著抑制了CTSB和CTSD的活性，而siZeb1os1则逆转了D-gal诱导的CTSB和CTSD活性下降[图7（k）~（n）]。溶酶体pH值升高与溶酶体功能障碍密切相关，如自噬体与溶酶体融合受阻、溶酶体生成受损及溶酶体酶活性降低[43]。我们的实验结果显示，OE-Zeb1os1和D-gal处理均导致溶酶体pH值显著升高，而Zeb1os1敲减则能够恢复D-gal处理的NMCMs中溶酶体pH值[图7（o）和（p）]。

综上所述，Zeb1os1通过调控TRPML1介导的溶酶体Ca2+释放、抑制TFEB的核转位及破坏溶酶体功能，加速了心肌细胞的衰老。而Zeb1os1敲减能够有效逆转这些负面效应，恢复溶酶体功能并减缓细胞的衰老进程。

3.8 Zeb1os1功能片段是调节TRPML1的核心

通过序列比对分析，我们识别出Zeb1os1在多个物种中高度保守的区域，称为功能片段（附录A图S13）。我们推测Zeb1os1的这一功能片段可能与TRPML1蛋白相互作用。为了验证这一猜想，我们使用Hex 8.0和PyMOL进行分子对接分析，结果显示Zeb1os1-FD具备与TRPML1结合的潜力。TRPML1蛋白氨基酸链中的ARG-172、ASP-183、HIS-286和ASP-176可能是Zeb1os1-FD的核心结合位点[图8（a）和（b）]。为了进一步验证这一猜想，我们合成了含有上述四个氨基酸突变的TRPML1基因质粒（Mut-TRPML1），并评估Zeb1os1对野生型TRPML1（WT-TRPML1）和Mut-TRPML1泛素化作用。结果表明，与WT-TRPML1相比，Zeb1os1不能促进Mut-TRPML1的泛素化，凸显了这些核心氨基酸是Zeb1os1与TRPML1相互作用中的关键因子（附录A图S14）。

进一步的分子分析表明，Zeb1os1-FD中的C-62、G-66、G-79和C-81核苷酸通过形成氢键与TRPML1蛋白发生相互作用。为了验证这一结果并更深入地理解Zeb1os1的分子机制，我们合成了对应Zeb1os1-FD的寡核苷酸片段，并通过引入核苷酸替换生成突变功能片段，以干扰其与TRPML1的结合能力[图8（a）]。随后，我们将Zeb1os1-FD转染至NMCMs，以评估其与TRPML1的相互作用及其对溶酶体功能和细胞衰老的影响。如图8（c）~（f）所示，Zeb1os1-FD复制了完整Zeb1os1的作用，导致TRPML1表达下调、溶酶体生成减少以及心肌细胞衰老加速，表现为TRPML1和Lamp1蛋白表达降低[图8（c）和（d）]，以及SA-β-gal活性增加[图8（e）和（f）]。相反，Mut-FD未能改变TRPML1蛋白表达，且失去影响溶酶体功能和细胞衰老的能力[图8（c）~（f）]。

综上所述，以上实验数据确认了Zeb1os1的关键功能片段，表明Zeb1os1的功能片段可能成为减缓心脏衰老的潜在治疗工具。这一发现为Zeb1os1的调控机制及其作为治疗靶点的潜力提供了新见解。

4 讨论

本研究揭示了Zeb1os1在心脏衰老中的病理生理作用及潜在机制。我们发现，Zeb1os1在衰老小鼠心脏和老年人血液中显著增加，表明其在衰老过程中起着重要作用。具体而言，Zeb1os1的上调与心脏功能的恶化密切相关。通过敲减Zeb1os1，部分逆转了衰老导致的舒张功能障碍和心脏重构，表明Zeb1os1下调能够缓解心脏衰老。年轻小鼠过表达Zeb1os1诱导衰老心脏表型，进一步验证了其对心脏功能损害的作用。此外，Zeb1os1通过抑制溶酶体功能，导致自噬减少并加剧了心肌细胞衰老。在分子层面上，Zeb1os1通过直接与TRPML1结合，抑制了这一关键溶酶体钙离子通道的功能，限制了溶酶体Ca2+释放，进而损害溶酶体功能。通过对TRPML1活性的调控，Zeb1os1加速了心脏衰老。我们还识别出了Zeb1os1的功能片段，并发现该功能片段与TRPML1的结合在溶酶体功能受损和心肌细胞衰老中发挥重要作用。我们提出Zeb1os1调控心脏衰老的机制：随着年龄增长，Zeb1os1表达增加，导致TRPML1表达下降，溶酶体Ca2+释放减少，溶酶体功能受损，从而加速心肌细胞和心脏的衰老，如图8所示。以上研究结果表明，lncRNA Zeb1os1通过靶向作用TRPML1及其相关溶酶体功能，促进心脏衰老进程。

研究表明，非编码RNA在心血管疾病中扮演重要角色，这增强了其作为生物标志物和衰老相关心脏功能障碍新型调节因子的潜力[44]。Zhu等[45]的研究发现，lncRNA MATAT1通过外泌体递送减少炎症，预防心脏衰老相关的功能障碍；Yang等[46]发现lncRNA ENSMUST00000134285增加了MAPK活性，调节衰老相关的心肌细胞凋亡；Li等[47]证明lncRNA CPAL通过调控心脏代谢和心肌细胞焦亡，保护心脏免受缺血性损伤。这些研究揭示了lncRNA在心脏衰老中的调控作用。我们前期的研究发现，长链非编码RNA LOC105378097在老年人血液中表达升高，并能通过靶向Parkin介导的线粒体自噬诱发心脏衰老[54]。此外，我们发现老年人血液中microRNA-203水平降低，且与患者E/A比值显著相关[48]。除ncRNA外，Wu等[49]利用免疫球蛋白G N-糖基化谱结合机器学习构建了免疫球蛋白G N-糖基化心血管年龄指数，可用于追踪老年人心血管健康状况并预测心血管风险。然而，目前对lncRNA在心脏衰老中作用的认识仍处于起步阶段，在提出治疗方案前仍需更多研究。未来研究应着重揭示相关分子机制，并鉴定更具特异性和敏感性的生物标志物，以筛选不同病理背景下的功能性lncRNA。基于此，本研究首先对年轻和老年小鼠心脏RNA样本进行测序，发现衰老小鼠心脏中Zeb1os1表达显著增加。进一步检测发现老年人血液样本中人类Zeb1os1表达量较年轻人显著升高，且与年龄呈正相关。值得注意的是，我们发现LVEF正常的受试者中E/A值随年龄增长而下降，提示存在轻度射血分数保留的心力衰竭[50]。同样，本研究发现Zeb1os1与E/A比率呈负相关，支持其作为心脏衰老潜在血液标志物的可行性。

健康个体随着年龄增长，左心室肥厚发生率增加，而舒张功能下降，但射血分数通常不变。自然衰老小鼠也表现出类似的病理特征，而Zeb1os1敲减能够显著缓解这些衰老相关的功能损害。相反，Zeb1os1的过表达诱发了与自然衰老小鼠类似的心脏功能障碍，证实了Zeb1os1在心脏衰老中的关键作用。许多研究集中于识别心脏衰老的功能调节因子，发现了一些新基因。例如，Ye等[51]发现Sirtuin 2水平下降导致STAT3高度乙酰化，从而激活CDKN2B基因，引发线粒体损伤；FOXP1在衰老心肌细胞中大幅下调，被认为加速了心肌细胞肥大和衰老表型[52]；IGF1R减少则与更好的心脏健康状况相关，表明其可能通过自噬流的抑制调控心脏衰老[53]。

LncRNA在心脏衰老中作用的研究仍处于早期阶段，值得进一步探索。Ding等[17]的研究指出，circHIPK3通过促进HuR蛋白降解和抑制p21活性，成为调控心脏衰老的关键因子，而敲除circHIPK3会加剧心肌细胞衰老并导致心功能减退。我们此前的研究也表明，lncRNA LOC105378097的过表达导致了衰老心脏中的线粒体功能障碍和心肌细胞衰老[54]。本研究表明，Zeb1os1的敲减可以缓解D-gal诱导的心肌细胞衰老，体内实验也显示shZeb1os1减轻了老年小鼠心脏的衰老迹象，改善了心脏重构和肌纤维紊乱，表明Zeb1os1可能成为治疗心脏衰老的新候选靶点。

亚细胞水平的研究揭示了溶酶体功能障碍（包括溶酶体数量减少及自噬溶酶体形成受阻）是衰老心肌细胞的关键病理标志，维持溶酶体功能可能对抗心脏衰老。这与我们此前的研究结果一致，多项早期研究已证实，溶酶体功能障碍可通过增加氧化应激和炎症反应，进而导致衰老相关心功能异常[55‒56]。此外，靶向维持溶酶体功能的疗法已被证明可有效治疗衰老相关神经退行性疾病[57]。值得注意的是，溶酶体相关功能调节因子在心脏衰老中具有重要作用。例如，作为溶酶体膜上激活的营养感受器，mTORC1通过调控自噬、细胞衰老、蛋白质合成、线粒体功能及炎症反应，在心脏衰老进程中发挥关键作用。本研究进一步证实，改善溶酶体功能可有效逆转衰老诱导的心功能障碍和心肌细胞衰老。特别需要指出的是，AAV-Zeb1os1和OE-Zeb1os1可能通过损害溶酶体功能，成为诱导心脏衰老或细胞衰老的驱动因子。

关于Zeb1os1调控溶酶体功能的具体机制此前尚未阐明。为此，我们对Zeb1os1的下游靶点展开研究。通过RNA测序分析发现，TRPML1在衰老心脏中表达异常且受Zeb1os1调控。TRPML1介导的溶酶体钙外流对溶酶体生物合成、晚期内体/自噬体与溶酶体的融合至关重要[58]。钙信号通过磷酸酶calcineurin调控TFEB活性，而TFEB核转位可促进自噬和溶酶体生物合成相关基因的表达[59]。研究表明，TFEB过表达能通过改善自噬-溶酶体通路保护心肌细胞免受蛋白毒性损伤，且心肌细胞中蛋白酶体功能障碍激活自噬需要TFEB调控的TRPML1参与[60]。TRPML1缺失会导致溶酶体数量减少、自噬流阻滞及溶酶体降解功能受损，进而引发细胞损伤甚至死亡，这与肾脏损伤和神经退行性疾病等多种疾病相关[61‒62]。本研究首次证实TRPML1在心脏衰老和心肌细胞衰老中的功能调控作用。D-gal可显著抑制TRPML1表达，而过表达TRPML1能通过恢复溶酶体功能有效改善心肌细胞衰老。更重要的是，shZeb1os1通过将TRPML1表达水平、Ca2+流及TFEB核转位恢复至正常范围，显著改善了溶酶体功能障碍和细胞衰老。值得注意的是，TRPML1异常激活会大幅增加其介导的Ca2+释放，进而损害溶酶体运输和生物学功能[63]，但shZeb1os1对TRPML1表达的调节并未引发上述副作用。最新研究还发现，在缺血性损伤和癌症中，TRPML1过表达会导致溶酶体释放大量Zn2+，引发自噬阻滞、ROS累积和细胞凋亡，而将TRPML1表达恢复至正常水平可消除这些病理效应[64‒65]。这些研究与本研究的共同发现表明，TRPML1表达过低或过高均会导致细胞损伤，将其表达精准调控至生理水平以维持离子流平衡，是治疗TRPML1失调相关疾病的有效策略。

LncRNA的分子作用机制具有多样性，包括调控表观遗传和（转录后）基因表达、充当miRNA分子海绵以及形成亚细胞区室化结构等。这些功能通常通过lncRNA与RNA结合蛋白的相互作用来实现[66]。我们前期研究发现，lncRNA ZFAS1能够通过其功能结构域直接结合靶蛋白，从而抑制蛋白功能[18]。与上述研究一致，本研究发现（通过计算对接分析预测并经RIP和下拉实验验证）Zeb1os1与TRPML1蛋白存在相互作用。Zeb1os1下调TRPML1蛋白的机制可能涉及蛋白构象改变，这种改变会通过泛素-蛋白酶体途径导致TRPML1蛋白过度降解，该现象与其他研究报道的机制相似[67]。

鉴于lncRNA介导的基因调控具有高度复杂性，Zeb1os1可能具有多靶点、多机制的作用特点。Lv等[68]研究发现，下调ZEB1-AS1可通过削弱Wnt/β-catenin信号通路诱导结直肠癌细胞凋亡。ZEB1-AS1还可作为miR-141-3p的分子海绵，其敲低能显著抑制癌细胞增殖[69]。在肝细胞癌中也观察到类似的致癌机制，即ZEB1-AS1通过吸附miR-299-3p提高E2F1水平，从而促进HCC细胞恶性进展[70]。此外，Su等[71]证实ZEB1-AS1能结合并招募组蛋白甲基转移酶MLL1，激活ZEB1转录进而促进前列腺癌细胞增殖和迁移。本研究首次为Zeb1os1在心脏衰老中的作用提供了可靠证据。通过生物信息学分析、分子生物学技术及功能获得/缺失策略，我们阐明Zeb1os1可直接抑制TRPML1的表达。这些发现为探索Zeb1os1在心脏衰老中的其他治疗靶点开辟了新研究方向。

总而言之，本研究首次揭示了Zeb1os1在心脏衰老中的关键作用。Zeb1os1通过直接靶向作用TRPML1并降低其蛋白质水平，损害溶酶体功能，加速心肌细胞和心脏的衰老。敲减Zeb1os1能够显著改善心肌细胞衰老，恢复老年小鼠的心脏功能，表明Zeb1os1及其功能片段可能成为治疗心脏衰老的有效靶点。这为未来开发针对心脏衰老的新型干预策略提供了重要的理论基础。

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