生物启发的由铜单原子与宿主防御肽整合成的抗菌治疗纳米反应器

Engineering ›› 2024, Vol. 43 ›› Issue (12) : 225 -237. DOI: 10.1016/j.eng.2024.09.021

研究论文

陈选 ^a^,^b ,
罗维 ^a ,
高群 ^a ,
陈聪荣 ^a ,
李丽婵 ^a ,
刘东波 ^b ,
汪少芸 ^a

作者信息 +

Incorporating Single-Copper Sites and Host Defense Peptides into aNanoreactor for Antibacterial Therapy by Bioinspired Design

Xuan Chen ^a^,^b ,
Wei Luo ^a ,
Qun Gao ^a ,
Congrong Chen ^a ,
Lichan Li ^a ,
Dongbo Liu ^b ,
Shaoyun Wang ^a^,^* ,

Author information +

文章历史 +

Received	Accepted	Published
2024-07-04	2024-09-29
Issue Date
2024-11-18

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摘要

开发非抗生素型抗菌剂是应对由抗生素耐药性急剧蔓延而威胁公共健康安全的可持续解决方案。受抗菌肽中铜镍结合基序的自然防御机制启发，本研究设计并制备了一种应用于抗菌治疗的由铜单原子与宿主防御肽构成的人工复合物（Cu@G-AMPs）。Cu@G-AMPs的基底由鸟嘌呤掺杂丰富的杂原子形成，并锚定了配位数为2，平均键长为1.91 Å的铜单原子。有趣的是，Cu@G-AMPs表现出类芬顿催化作用，即通过产生和传递活性氧导致耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）失活。因为Cu@G-AMPs的催化作用不针对MRSA任何特异性的靶标，所以MRSA的内在应激反应系统将发生系统性地崩溃。此外，Cu@G-AMPs也保持了抗菌肽的免疫调节特性，在MRSA感染的伤口处发挥着促使边缘闭合、稳定肉芽组织、促进胶原纤维增殖、缓解炎症和形成新生血管等功能。本研究制备的Cu@G-AMPs将为有效应对耐受传统抗生素的病原菌威胁提供一个新的视角。

Abstract

A sustainable solution to the dramatic spread of antibiotic resistance threatening public health security is the development of antibiotic-free antimicrobial substances. Inspired by natural host defense mechanisms involving amino-terminal copper-nickel binding motif (ATCUN) antimicrobial peptides (AMPs), we have designed and prepared an artificial complex (Cu@G-AMPs) incorporating single-atom Cu catalysts for antibacterial therapy. The substrate of the complex, formed from guanine doped with abundant heteroatoms, anchored single Cu atoms with a coordination number of 2 and an average bond length of 1.91 Å. Interestingly, Cu@G-AMPs, exhibiting Fenton-like catalytic activity, caused the inactivation of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) by generating and delivering reactive oxygen species (ROS) cargo. Mechanistically, the intrinsic stress response system of MRSA underwent an irreversible collapse when Cu@G-AMPs initiated its offensive program associated with non-specific targets. Furthermore, Cu@G-AMPs, which inherited the immunomodulatory properties of AMPs, sequentially carried out the functions of pulling edge closure, stabilizing granulation tissue, promoting collagen fiber proliferation, alleviating inflammation, and promoting neovascularization in wound areas infected by MRSA. Our results show that Cu@G-AMPs will provide a new perspective on untangling the complex regulatory networks that resistant bacteria have cultivated to deactivate commercial antibiotics.

关键词

抗菌肽 / 单原子催化剂 / 类芬顿反应 / 抗菌治疗

Key words

Antimicrobial peptides / Single-atom catalysts / Fenton-like reactions / Antibacterial therapy

引用本文

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陈选,罗维,高群,陈聪荣,李丽婵,刘东波,汪少芸. 生物启发的由铜单原子与宿主防御肽整合成的抗菌治疗纳米反应器[J]. 工程（英文）, 2024, 43(12): 225-237 DOI:10.1016/j.eng.2024.09.021

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1 引言

在目前公共卫生安全受到耐药病原体严峻威胁的状况下，具有独特抗菌活性和多元作用机制的抗菌肽（AMP）被认为是传统抗生素的理想替代品[1‒2]。新型抗菌肽的发现和结构设计一直是研究人员关注的焦点。例如，通过利用病原体细胞包膜内的物理和结构脆弱性，Simonson等[3]开发了一种在结核分枝杆菌富含霉菌酸的外膜内进行色氨酸定向组装的肽，该肽可以特异性地杀死病原体。Narayana等[4]则通过数据库引导和基于结构设计的方式，开发了两种可以消除耐药病原体及其生物膜的肽。此外，随着纳米技术的跨越式发展，各种纳米金属在抗感染方面的应用取得了前所未有的成功，显示出无抗生素策略的潜力[5‒6]。关键是，一些纳米金属——包括银（Au）[7]、金（Ag）[8]和铜（Cu）[9]——已被证实具有类似于抗菌肽的涉及非特异性靶点的多方面杀菌机制。然而，缺乏由抗菌肽和纳米金属重组而成的新型抗菌剂。

作为抗菌肽和纳米材料协同作用的一个例子，一些宿主可以通过产生高亲和力的金属结合肽来限制细菌对区域内锌、锰和铁的可用性[10]。这种抑菌机制被称为营养免疫，使病原体无法获得上述必需的微量营养素。或者，一些宿主可以利用镍或铜的固有毒性，特意将这些金属汇集到含有致病菌的区域[11]。氨基端铜-镍结合基序（ATCUN）因为在免疫调节中的重要性而被关注，其由位于N端的H2N-XXH序列组成；基序中的XX元素可以是除脯氨酸（Pro）以外的任何氨基酸[12]。Cu基团可以形成扭曲的方形平面几何形状，通过两个去质子化N-酰胺原子的主链和组氨酸（His）咪唑环快速结合到基序上[13]。随后，新形成的复合物通过利用涉及Cu¹⁺/Cu²⁺氧化还原对和过氧化氢（H₂O₂）形成活性氧（ROS）的类芬顿机制，来破坏周边的任何分子[11,14]。值得注意的是，Cu位点与H₂O₂之间的相互作用是决定该反应中ROS形成效率的一个极其重要的环节[15]。

受这种天然宿主防御机制的启发，本研究在概念验证研究中构建了一个包含单原子Cu催化剂的氨基端铜-镍结合基序抗菌肽复合物（Cu@G-AMPs）。在功能上，Cu@G-AMPs可以定位于细胞膜或干扰内部靶标（如DNA、RNA和蛋白质），在接近病原体时原位产生并散发出致命的ROS（图1）。最后，Cu@G-AMPs沿袭了抗菌肽的免疫调节特性，会在耐药菌感染的伤口区域发挥出促闭合、稳定肉芽组织、促进胶原纤维增殖、减轻炎症和促进新生血管的功能（图1）。Cu@G-AMPs的出现为公共卫生安全领域解决耐药细菌已经发展出精确的调控机制来适应抗生素的困境，提供了一个新的视角。

2 材料与方法

2.1 材料

Piscidins-3（FIHHIFRGIVHAGRSIGRFLTG）由吉尔生化有限公司采用固相肽合成技术制备。N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、鸟嘌呤、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）、万古霉素（VAN）购置于麦克林生化有限公司。碘化丙啶（PI）和ROS检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司。磷酸盐缓冲盐水（PBS; pH = 7.4）和SYTO9从赛默飞世尔科技公司（美国）订购。N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲基噻唑基二苯基溴化四唑（MTT）、H₂O₂、戊二醛、二甲基亚砜（DMSO）购置于国药集团化学试剂有限公司。除非另有说明，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA; 43300）从ATCC（美国）获得。Mueller-Hinton肉汤（MHB）和Luria-Bertani（LB）培养基购自汉珀生物科技有限公司。

2.2 Cu@G的制备

通过配位热解法将单原子金属固定在由鸟嘌呤（G）衍生的片状基质上[16]。将2.5 mL Cu(NO₃)₂ （5.3 mmol∙L^-1）滴入60 mL的鸟嘌呤溶液（441 mmol∙L^-1）中，80 ℃搅拌12 h。然后，将干燥和研磨后的反应样品置于800 ℃的管式炉中反应2 h。反应过程在氮气气氛下进行，升温速率为5 ℃∙min^-1。最后，将新的反应产物在800 ℃的氢气（H₂）气氛中还原2 h。

2.3 Cu@G-AMPs的制备

通过酰胺反应将含氨基端铜-镍结合基序的抗菌肽修饰到Cu@G上[17]。首先将EDC（15 mL, 0.4 mmol∙L^-1）和NHS（9 mL, 0.4 mmol∙L^-1）依次添加到溶解于200 mL DMF的100 mg Cu@G悬浮液中，搅拌1 h。然后，在上述悬浮液中加入30 mg AMPs（piscidins-3），搅拌2 d。最后，将新的悬浮液放入DMF和去离子水中进行透析。

2.4 抗菌实验

通过平板涂布试验对纳米材料的体外抑菌活性进行评价[18]。通过PBS（pH = 7.4、6.7和5.5）将细菌悬浮液（对数生长期的MRSA）的浓度调整为1 × 10⁸ CFU·mL^-1。将PBS、H₂O₂（终浓度为1 mmol∙L^-1）和Cu@G-AMPs + H₂O₂（终浓度为128 μg∙mL^-1 + 1 mmol∙L^-1）加入到含有100 μL稀释菌悬液的离心管中，37 ℃孵育30 min。最后将上述反应溶液稀释1000倍后取100 μL均匀涂于LB培养基板上，37 ℃孵育18 h，每次实验至少重复3次。

2.5 活死染色法

用PBS（pH = 6.7）将细菌悬浮液（对数生长期的MRSA）浓度调整为1 × 10⁸ CFU∙mL^-1。将PBS、H₂O₂（终浓度为1 mmol∙L^-1）和Cu@G-AMPs + H₂O₂（终浓度为128 μg∙mL^-1 + 1 mmol∙L^-1）加入含有100 μL稀释菌悬液的离心管中，37 ℃孵育1 h。然后，用PBS（pH = 7.4）洗涤细菌三次，再用PI和SYTO9染料孵育15 min [18]。最后，使用共聚焦激光扫描显微镜对这些细菌拍照（A1；尼康，日本）。

2.6 溶血试验

用不同浓度的纳米材料（256 μg∙mL^-1、128 μg∙mL^-1、64 μg∙mL^-1、32 μg∙mL^-1和16 μg∙mL^-1）在37 ℃下处理从新鲜小鼠（雄性，30~35 g）血液中分离的血细胞1 h。去离子水和PBS（pH = 7.4）分别作为阳性和阴性对照。孵育后，测量每管样品的光密度（OD）₅₇₆值，并按下式计算溶血率[19]。OD_{576 sample}为样品的光密度；OD_{576 blank}为空白对照的光密度；OD₅₇₆ _water是阳性对照的光密度。

溶血率=[(OD_{576 sample} - OD_{576 blank})/( OD₅₇₆ _water - OD_{576 blank})] × 100%

2.7 细胞活力评价

MC3T3-E1细胞培养于含有α最低必需培养基（α-MEM）的培养皿中，该培养基中添加了1%青霉素和10%胎牛血清。培养皿保存在37 ℃加湿培养箱中，气氛为5% CO₂。采用MTT法[20‒21]检测MC3T3-E1细胞的细胞活力。将细胞以每孔1 × 10⁵个细胞的密度接种，孵育形成融合单层。取出细胞培养基，加入不同浓度药物（256 μg∙mL^-1、128 μg∙mL^-1、64 μg∙mL^-1、32 μg∙mL^-1、16 μg∙mL^-1、8 μg∙mL^-1）到96孔板中。孵育24 h后，每孔加入20 μL的MTT溶液。随后，用二甲基亚砜置换混合溶液以溶解甲臜晶体。最后，测量每个管样的OD₅₉₅值。

2.8 类酶（enzyme-like）活性试验

不同浓度的纳米颗粒（256 μg·mL^-1、128 μg·mL^-1、64 ug·mL^-1、和32 μg∙mL^-1）完全溶解于pH = 7.4、6.7、5.5和4.7的乙酸缓冲液中。然后，在缓冲液中加入10 μL TMB（33 mmol∙L^-1）和10 μL H₂O₂（10 mmol∙L^-1），搅拌均匀。最后，在不同时间（每分钟一次，共30 min）监测制备样品的OD₆₅₂值[22]。每项实验进行了三次重复，取独立实验的平均值。

2.9 ROS原位检测

使用试剂盒检测纳米材料处理后细菌细胞的ROS含量[19,23]。简单来说，将细菌悬浮液（对数生长期的MRSA）的浓度用PBS（pH = 6.7）调整为1 × 10⁸ CFU∙mL^-1。将荧光探针（DCFH-DA）加入菌悬液中，孵育20 min。随后，用PBS（pH = 6.7）洗涤细菌细胞3次，去除未进入细胞的荧光探针。之后立即将不同浓度的纳米颗粒（128 μg∙mL^-1、64 μg∙mL^-1和32 μg∙mL^-1）和H₂O₂（终浓度为1 mmol∙L^-1）加入到负载探针的细菌细胞中，孵育1 h。将AMPs（piscidins-3；终浓度为128 μg∙mL^-1）作为对照药物。最后，检测这些样品的荧光强度（525 nm发射波长和488 nm激发波长）。

2.10 蛋白质组学实验

用PBS（pH = 6.7）将细菌悬浮液（对数生长期的MRSA）浓度调整为1 × 10⁸ CFU∙mL^-1。然后，分别将PBS（pH = 6.7）、抗菌肽（piscidins-3；终浓度为128 μg∙mL^-1）和Cu@G-AMPs + H₂O₂（终浓度为128 μg∙mL^-1 + 1 CFU∙mL^-1）加入到含有100 μL稀释菌悬液的离心管中，37 ℃孵育1 h。离心纯化后的细菌沉淀并用PBS洗涤3次，保存于-80 ℃。

细菌细胞在400 μL含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液、200 μg∙mL^-1 DNAse I、200 μg∙mL^-1溶葡萄球菌酶（lysostaphin）和PBS的混合液中裂解20 min，37 ℃下超声10次，每次30 s [23‒25]。细胞蛋白提取物在15 000g下离心10 min，将样品与Laemmli样品缓冲液（SB）混合，采用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，然后进行蛋白质印记或考马斯蓝染色。此外，由上海爱谱蒂康生物科技有限公司完成无标记定量质谱分析。蛋白质提取、肽分离和生物信息学细节在附录A中描述。

2.11 并行反应监测（PRM）验证

PRM是一种灵敏度高、分辨率高、特异性强的蛋白质组学结果验证技术。本文使用的细菌细胞处理和蛋白质提取的详细步骤与蛋白质组学实验中使用的步骤相似[25]。具体来说肽片段的鉴定过程如下：在数据依赖性采集（DDA）文库中鉴定的肽片段使用纳升流速的高效液相色谱（HPLC）进行分离，然后对符合分析条件的肽片段信息进行归一化（Xcalibur，赛默飞世尔科技公司，美国）和分析（Skyline，华盛顿大学，美国）。相关的蛋白质组学实验得到了复旦大学人类表型组研究院的特别支持。

2.12 MRSA感染皮肤模型

所有动物研究均按照中国福州大学动物伦理委员会的动物伦理标准进行。雄性ICR小鼠（30~35 g）在恒温（26 ℃）笼中适应性饲养7 d。在整个实验过程中，老鼠可以自由饮水和进食。首先，每只小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠，剂量为50 mg∙kg^-1。麻醉并去除小鼠背部皮肤同一部位的毛发。在消毒后的小鼠皮肤上构建直径为6 mm的圆形创面。然后，在这些伤口区域滴入20 μL MRSA悬液（对数生长期，1 × 10⁸ CFU∙mL^-1）。值得注意的是，一旦细菌悬浮液完全浸入皮肤伤口，这些区域将用透明敷料包裹并固定（Tegaderm, 3M，美国）[26‒28]。将细菌感染皮肤模型小鼠随机分为6组，给予不同的治疗方案。各组给药方案如下：①20 μL PBS（pH = 6.7）；②20 μL H₂O₂ （1 mmol∙L^-1）；③20 μL piscidins-3（128 μg∙mL^-1）；④10 μL Cu@G（128 μg∙mL^-1）+ 10 μL H₂O₂ （1 mmol∙L^-1）；⑤10 μL Cu@G-AMPs（128 μg∙mL^-1）+ 10 μL H₂O₂ （1 mmol∙L^-1）；⑥20 μL VAN（16 μg∙mL^-1）。最后，每天记录各组小鼠的伤口面积和体重，整个治疗过程持续7 d。在第3天和第7天采集小鼠血液和皮肤组织进行分析。

2.13 伤口闭合度评价和菌落密度测试

通过软件（Image J）确定和监测小鼠皮肤伤口大小的变化。同时，测量创面闭合度，以最新创面大小占初始创面大小的比例计量。1天后，用棉签彻底擦拭小鼠伤口，并用生理盐水（1 mL）浸泡。然后将100 μL的稀释生理盐水转移到培养基（MHB, 10 mL）中孵育（37 ℃）。最后，在孵育完成（18 h）后测定培养基的OD₆₀₀值[29]。

2.14 苏木精-伊红（H&E）染色、马松（Masson）染色和甲苯胺蓝（toluidine blue）染色

第3天和第7天通过切片仔细观察创面组织[26‒28]。简单地说，用剪刀收集并用生理盐水清洗创面组织，之后用纱布干燥组织并以4%多聚甲醛固定。接下来，切片分别用H&E、马松和甲苯胺蓝染色。最后，用中性胶包封脱水的切片。所有染色切片均在显微镜下检查并收集。每个样本至少有5张图像可供统计和分析。

2.15 免疫相关实验

采用免疫荧光法和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组小鼠的免疫状态[26‒28]。应用血小板内皮细胞黏附分子-1（CD31）和山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）H&L免疫荧光切片评估创面组织血管状况；采用增殖细胞核抗原（PCNA）和Cy3偶联山羊抗小鼠IgG免疫荧光切片检测创面组织血管状况。采用ELISA法准确测定各组小鼠（第3天和第7天）血液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-10（IL-10）水平。

3 结果与讨论

3.1 设计、制备和表征

新型抗菌剂的主要制备工艺如图2（a）所示。简而言之，首先通过鸟嘌呤和金属盐混合物的配位热解反应获得了Cu单原子掺杂杂原子的碳基纳米材料（Cu@G）。随后，我们通过酰胺反应将含氨基端铜-镍结合基序的抗菌肽修饰到碳基骨架上，创造了不含抗生素的纳米反应器（Cu@G-AMPs），其具有非特异性靶标的抑菌活性。Piscidins-3具有对血细胞溶血率低、与细胞内DNA结合强、能严重破坏细菌生物膜等优点，被认为是一种很有前景的候选抗菌剂[31]。此外，单原子催化剂具有活性位点识别准确、活性可调、金属利用率高等优点[32]，因此，铜的加入为复制甚至放大抗菌肽的氧化还原特性提供了一个宝贵的机会。也就是说，Cu单原子在类芬顿反应中架起了均相催化和非均相催化之间的桥梁，从亚纳米尺度到微米尺度都不同于传统催化剂[33]。实际上，单原子金属作为“催化剂”在自然界中无处不在，在生命活动中起着关键作用，如氮酶中的钼、血红素中的铁、叶绿素中的镁[11]。

实现单原子Cu分散是制备Cu@G-AMPs的关键技术。这涉及到热力学结构基序或非/亚稳相的产生，需要选择合适的衬底材料来结合金属前驱体，以防止金属原子聚集、团聚和纳米晶体/团簇生长[34]。因此，直接应用具有高表面积的碳基材料作为衬底来结合金属前驱体，成为可扩展制备Cu单原子的理想解决方案[35]。鸟嘌呤是一种具有共轭双键的嘧啶-咪唑环体系组成的核酸碱基组分[16]，因此本文指定鸟嘌呤作为合成碳骨架的原料。鸟嘌呤掺杂丰富杂原子形成的底物有利于单个Cu原子的稳定分散[16]。当然，鸟嘌呤固有的生物安全特性是采用它的一个重要原因。

正如预期，Cu@G-AMPs呈现出类似于石墨烯类材料[35]的高表面积片状形态，这有助于单个Cu原子的充分分散，如图2（b）和（c）所示。此外，Cu@G和Cu@G-AMPs的相似外观表明，抗菌肽的改性过程并未改变碳衬底材料的形貌（附录A图S1和图S2）。至关重要的是，这种表面结构增强了Cu@G-AMPs和Cu@G有效捕获病原体的能力[22]。为了在原子水平上直接观察Cu的结构，我们应用像差校正的高角度环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）对Cu@G-AMPs进行详细的研究。在HAADF-STEM中，由于Cu的质量比C、N和O的质量更大，因此Cu@G-AMPs中的Cu有望在掺杂杂原子的碳衬底上呈现独立的亮点[36]。在2 nm视场中，可以观察到高度分散的单个Cu原子具有更亮的白斑特征[图2（d）]。重要的是，在更大的视场中观察到的Cu元素除了在单原子状态下随机分散外，并没有以团簇或粒子的形式出现。Cu元素均匀地分布在Cu@G-AMPs和Cu@G表面[图2（e）；附录A图S3]。

紫外和可见分光光度法（UV-Vis）的结果表明，Cu@G-AMPs和Cu@G的水溶液在200~600 nm波长范围内没有特征吸收峰，呈非均相状态（附录A图S4）。其中，鸟嘌呤形成的底物捕获光谱能力差的原因可能是强烈的量子尺寸效应[32,34]。傅里叶变换红外光谱（FTIR）结果显示，涉及N掺杂碳基材料的N‒H、C=N和C‒N键的吸收峰分别出现在Cu@G和Cu@G-AMPs的500~1210 cm^-1和500~1580 cm^-1波长范围内[37‒38]，如图2（f）所示。与Cu@G相比，Cu@G-AMPs的FTIR光谱在1110~1210 cm^-1和1400~1700 cm^-1范围内与抗菌肽修饰相关的吸收峰增强。Zeta电位测试结果证实含有抗菌肽的Cu@G-AMPs具有比Cu@G更高的正电荷[图2（g）]。具有适当正电荷的抗菌剂在攻击致病菌或哺乳动物细胞时将有较好的选择性。Cu@G-AMPs和Cu@G的X射线衍射（XRD）谱图在25°附近呈现宽峰，这可能是由于纳米材料中的无定形碳（002）（附录A中的图S5）所致[40]。此外，与Cu@G相比，Cu@G-AMPs的XRD谱图略向低强度偏移；这种转变可能是由于抗菌肽的修饰，导致原始薄片纳米结构发生一定程度的变形。此外，电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）检测结果显示，Cu@G-AMPs中Cu的含量为0.41%，符合单原子金属催化剂含量低、活性位点丰富的特点（附录A图S6）[41]。综上所述，我们通过多种分子结构鉴定技术初步确认Cu@G-AMPs是一种含氨基端铜-镍结合基序和Cu基团的无抗生素纳米材料。

根据催化化学的基本理论，Cu@G-AMPs的催化抑菌活性可归因于Cu原子的d轨道与配位非金属原子（如C、N或O）的p轨道之间的强电子相互作用[42]。此外，Cu@G-AMPs的抗菌活性可被视为与单个Cu原子的离散量子态及其局部化学配位环境密切相关，其中包括最近邻原子的类型和配位数[35]。因此，我们通过测定Cu@G-AMPs的光热性能和增强的纳米酶配位结构，进一步表征了单原子金属分散状态和底物单原子Cu催化剂。在Cu@G-AMPs和Cu@G的拉曼光谱中（附录A图S7），检测到代表无定形碳的峰D（1360 cm^-1）和峰G （1580 cm^-1）[43]。Cu@G-AMPs和Cu@G样品对应的I _D/I _G值非常相似。通过X射线光电子能谱（XPS）在Cu@G-AMPs和Cu@G上都鉴定出了代表吡啶N、吡咯N和石墨N的突出峰。Cu@G-AMPs的N谱计算出47.63%吡啶N（397.5 eV）和44.12%吡咯N（401.3 eV）的相对含量（附录A图S8），而Cu@G的N谱显示吡啶N（399.3 eV）的相对含量高达89.83%（附录A图S9）。有趣的是，吡啶N和吡咯N中的N原子属于费米能级附近的电子供体，这可以为底物上锚定单个Cu原子的稳定性提供极其重要的位点[41]。

以CuO和Cu箔为对照，通过X射线吸收精细结构（XAFS）光谱测定Cu@G-AMPs中单个Cu原子的结构，进一步表征了石墨烯基金属单原子催化剂稳定性和催化性能的基础。XAFS包括扩展X射线吸收精细结构（EXAFS）和X射线吸收近边结构（XANES）光谱[33]。具体而言，铜的XANES结果表明，Cu@G-AMPs的能量吸收阈值介于铜箔和CuO之间[图3（a）和（b）]。这说明Cu@G-AMPs中单个Cu原子的电荷范围在0~+2之间。相应地，Cu@G-AMPs中的Cu在1.5 Å处有一个涉及Cu‒N/O的显著峰，而在2.2 Å处没有涉及Cu‒Cu的显著峰，证实了单个金属原子是高度分散的[图3（c）]。

此外，通过对Cu@G-AMPs的EXAFS参数进行小波变换（WT）分析，我们确定了单个Cu原子与相邻原子在K和R空间中的真实配位环境。Cu@G-AMPs的轮廓极值（R = 1.4 Å, K = 6.7 Å^-1）[图3（d）]与CuO的轮廓极值（R = 1.5 Å, K = 6.8 Å^-1）[附录A图S10]接近，但与Cu箔的轮廓极值（R = 2.3 Å, K = 7.6 Å^-1）（附录A图S11）差距较大，说明Cu@G-AMPs不存在Cu‒Cu相互作用，但存在Cu‒N/O配位。这一结果与Cu@G-AMPs（附录A图S5）的XRD结果一致，缺少涉及Cu‒Cu晶体的特征峰。这两种表征方法表明Cu@G-AMPs中的Cu在原子水平上是分散的，不会聚合成类似金属晶体的结构。

通过对Cu@G-AMPs上的EXAFS的定量分析，进一步揭示了第一壳层中单个Cu原子的配位数约为2，平均键长为1.91 Å [图3（e）和（f），其中图3（f）描述了Cu@G-AMPs中单个Cu原子与掺杂N/O的底物的相互作用细节]。N和O的固有化学性质，严重阻碍了准确识别单个Cu原子在相同键长范围内的杂原子配位环境[34]。总之，我们成功地制备并表征了一种具有潜在类芬顿催化活性的新型纳米反应器（Cu@G-AMPs），该反应器是由含有ATCUN基序的抗菌肽和Cu单原子融合在掺杂了杂原子的碳基衬底上形成的。

3.2 抑菌特性及机理

以MRSA（ATCC 43300）为主要测试菌株，验证制备的上述Cu@G-AMPs体外抗菌活性是否达到预定目标。具体来说，涂布板法的结果显示Cu@G-AMPs对MRSA的抗菌活性取决于处理环境的pH值[26]，如图4（a）所示。Cu@G-AMPs的抑菌作用通常在酸性条件下更优。SYTO9/PI染色结果也证实Cu@G-AMPs在pH值为6.7时对MRSA具有理想的体外抗菌活性[图4（b）]；与PBS和H₂O₂处理的细菌群落相比，Cu@G-AMPs处理的细菌群落表现出强烈的红色荧光和轻微的绿色荧光。SYTO9是一种可以穿透细胞膜的染料，任何活的细菌都可以发出绿色荧光，而PI是一种不能穿透细胞膜的染料，只有膜受损的细菌才能发出红色荧光[44]。总之，Cu@G-AMPs在酸性条件下表现出对MRSA的抑菌活性，这与传统观点一致，即催化金属通过类芬顿反应机制发挥抑菌活性。（类）芬顿反应的活性和效率取决于H⁺和H₂O₂的浓度，它们通常在弱酸性范围内具有高能量[33]。此外，Cu@G-AMPs催化反应体系中H₂O₂的浓度远低于目前临床实践指南（166 mmol∙L^-1），这实际上避免了高浓度H₂O₂伤害正常组织[33]。

通过MTT比色法测定Cu@G-AMPs对MC3T3-E1细胞的毒性（附录A图S12）。在0~128 μg∙mL^-1浓度范围内，Cu@G-AMPs处理的细胞存活率高于75.83% ± 5.67%。MTT比色结果显示Cu@G-AMPs在抑菌作用浓度范围内具有低水平的细胞毒性。值得注意的是，Cu@G-AMPs在0~128 μg∙mL^-1的浓度范围内不会导致红细胞溶解和破裂（附录A图S13）。因此，Cu@G-AMPs具有理想的生物相容性。

Cu@G-AMPs作为一种新型抗菌剂，整合了含有ATCUN基序和Cu单原子的抗菌肽，可能具有一种或多种抑菌机制。因此，我们以TMB为底物检测Cu@G-AMPs固有的类酶活性。理论上，Cu@G-AMPs具有类酶活性，可以将H₂O₂转化为羟基自由基（·OH），将无色的TMB氧化为蓝色的oxTMB [45]，如图5（a）所示。我们研究了Cu@G-AMPs浓度与类酶活性之间的相关性，发现整个反应体系在652 nm处的吸收值呈浓度依赖性增加[图5（b）]。这一发现表明，随着Cu@G-AMPs浓度的增加，反应体系中的氧化物质（即oxTMB）也随之增加。此外，Cu@G-AMPs的类酶活性随着反应体系pH的降低而升高，这与人工纳米材料的类芬顿反应机理一致[图5（c）]。随后，2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光测定结果证实，任何浓度Cu@G-AMPs处理的MRSA细胞都比32 μg∙mL^-1 AMPs处理的细菌细胞生成更多的ROS [图5（d）]，且MRSA细胞中ROS的含量随着Cu@G-AMPs浓度的增加而增加。这里的“ROS”是指好氧细胞在代谢过程中形成的副产物，包括单线态氧、臭氧、超氧阴离子、H₂O₂和·OH。其中·OH被认为在所有ROS中对细菌细胞的毒性和刺激性最高[46]。基于这些结果，Cu@G-AMPs具有本征类酶活性，可以催化H₂O₂产生以·OH为代表的ROS。

在存在ROS的外部环境中，MRSA采用各种保护机制来对抗ROS的刺激，包括产生适应性突变、激活抗应激基因的调控，以及转变为休眠状态[26]。由于蛋白质是MRSA调控功能的最终执行者，因此蛋白质的情况可以很好地反映生物体本身的瞬时生物学状态[26]。为此，我们采用无标记定量蛋白质组学（简称为“无标记”）技术，从细菌应激反应的角度进一步探索Cu@G-AMPs的潜在抑菌机制。具体而言，与PBS处理的细菌相比，从Piscidins-3处理的样品中鉴定出106个上调和183个下调的差异表达蛋白（DEPs）（AMPs/PBS，倍数变化≥ 2或≤ 0.5，P调整值≤ 0.05）[图6（a）]；与PBS处理的细菌相比，从Cu@G-AMPs处理样品中鉴定出6个上调的DEPs和15个下调的DEPs（Cu@G-AMPs/PBS）[图6（b）]；与AMPs处理过的细菌相比，Cu@G-AMPs处理的样品中鉴定出223个上调的DEPs和118个下调的DEPs（Cu@G-AMPs/AMPs）[图6（c）]。简而言之，AMPs改变了MRSA中大量蛋白质的表达水平，而Cu@G-AMPs仅影响较少数的关键蛋白质。此外，对Cu@G-AMPs敏感的重要DEPs主要参与MRSA的传感、调控、修复和重组系统[图6（d）]。

为了更好地理解Cu@G-AMPs对MRSA抑制活性的机制，我们将这些DEPs进行基因本体（GO）类别的划分。MRSA中这些DEPs的统计结果显示，它们主要参与对外界刺激的反应、水平基因转移、DNA介导的转化、转化能力的建立以及细胞通讯的负调控等生物过程[图6（e）]。然而，MRSA内分配给细胞成分（CC）和分子功能（MF）的DEPs很少见，即细菌细胞通过表达多种参与大范围生物过程（BP）的基因产物来响应ROS刺激。同时，MRSA能够通过调节其抗氧化系统等蛋白表达水平来阻止ROS的进一步入侵[26]。当外界氧化压力超过细菌细胞所能承受的极限压力时，无疑会对细胞的抗氧化系统造成不可逆的负面影响[47]。因此，与PBS处理的细菌相比，从Cu@G-AMPs处理的细菌中鉴定出的DEPs，包括lytM、msaA、isaB、mecA和msrA，显著下调[图6（d）]。此外，当外源性ROS引起MRSA细胞内DNA或RNA损伤时，相关的修复系统可能被激活以维持细菌基因组的完整性。总之，Cu@G-AMPs通过破坏MRSA内的应激反应系统（包括群体感应调节、抗氧化酶、基因修复和重组）来实现抑菌功能。

PRM是一种灵敏度高、分辨率高、特异性强的蛋白质组学结果验证技术[48]。本研究选择了三个与MRSA氧化应激功能相关的靶蛋白（aaa、mecA和msrA）用于PRM。选定29个含有半胱氨酸（Cys）残基的DEPs进行PRM测试，主要是因为活性氧很容易使多肽中的Cys残基氧化并将其转化为化学键，如S-谷胱甘肽、S-亚磺酸、S-磺酸、二硫键和S-次磺酸[49]。总的来说，PRM中这些选定DEPs的定量与无标记技术的结果相似[图6（f）]。即验证了无标记技术检测结果的准确性和可靠性。

3.3 MRSA感染皮肤的治疗

应用于体内的抗菌肽经常遇到复杂的微环境限制，如伤口渗液、蛋白酶和pH值[26]。因此，本研究通过小鼠创面耐药细菌感染模型和药物分组治疗策略进一步评估Cu@G-AMPs在体内的应用前景[图7（a）]。创面感染模型小鼠总治疗期为7天。随着治疗时间的延长，各组创面面积均有明显的缩小趋势[图7（b）]。与其他治疗组相比，Cu@G-AMPs和VAN治疗5天后创面接近闭合（附录A图S14）。需要指出的是，抗菌肽piscidins-3在体内环境中的稳定性无法保证，因此piscidins-3在促进小鼠伤口愈合方面的贡献与PBS相比并没有表现出显著的优势[2]。重要的是，我们在第一天迅速评估了使用抗菌药物治疗的伤口的细菌密度，发现Cu@G-AMPs和VAN比其他药物具有更理想的抗菌活性（附录A图S15）。凝血、炎症、增殖和重塑是小鼠伤口愈合的必要阶段，这一过程主要涉及成纤维细胞、上皮细胞、炎症细胞、肥大细胞和间充质细胞[50]。相应地，与其他处理组相比，Cu@G-AMPs和VAN处理3天的伤口H&E染色图像显示，炎症细胞数量少，结缔组织疏松[图7（c）]。随后，在第7天，Cu@G-AMPs处理的伤口轮廓显示出更厚的肉芽组织和几乎完整的表面细胞，这表明Cu@G-AMPs具有多种功能，包括拉紧伤口边缘和稳定肉芽组织[图7（c）]。

我们进一步用马松染色法评价各组小鼠伤口愈合的实际进展，马松染色可使胶原纤维变为蓝色，肌纤维变为红色[26]。在第3天和第7天，Cu@G-AMPs处理过的创面出现了大片蓝色区域，表明Cu@G-AMPs抑制了不良肉芽的生长，促进了胶原纤维的增殖[图7（d）]。抗菌肽piscidins-3是一种来源于鱼皮肥大细胞分泌的免疫因子，这促使我们用甲苯胺蓝染色检测小鼠伤口肥大细胞的浸润情况[10]。肥大细胞浸润是皮肤组织损伤和过敏反应的普遍信号[12]。在第3天和第7天，Cu@G-AMPs处理的创面中没有明显浸润的肥大细胞，这表明Cu@G-AMPs具有与VAN相似的抗炎功能[图7（e）]。为了调查Cu@G-AMPs是否对动物有不良副作用，在整个实验过程中监测了小鼠的体重波动。体重变化超过20%通常被用作发病率、痛苦和总体毒性的关键指标[30]。幸运的是，在皮肤伤口愈合过程中未发现副作用（如肿胀、发红或瘙痒）或体内毒性[图7（b）和（c）；附录A图S16]。

采用免疫荧光染色法分析不同药物治疗小鼠创面中CD31和PCNA的含量。绿色荧光CD31和红色荧光PCNA是代表血管生成的一对常见标记物[26]。与其他治疗组相比，Cu@G-AMPs和VAN治疗3天后创面出现了更多的CD31和PCNA（附录A图S17和图S18）。当第7天创面处于重塑期时，与其他处理组相比，Cu@G-AMPs和VAN处理组的样本中CD31和PCNA的含量较低（图S17和图S18）。也就是说，Cu@G-AMPs延续了抗菌肽的促血管生成特性。事实上，细菌感染的伤口愈合的整个周期都伴随着炎症反应，这是各种正、负免疫因子调节平衡的结果[51]。具体来说，IL-10作为一种多功能负调节因子，在机体中发挥拮抗炎症介质和下调炎症反应的作用[50]。使用Cu@G-AMPs和VAN处理的样品组在3天后IL-10水平低于其他处理组，在7天后逆转[图8（a）]。IL-1β和TNF-α是机体免疫反应中典型的多功能正调节因子[50]。使用Cu@G-AMPs和VAN处理的样品组在3天后检测到的IL-1β和TNF-α水平高于其他处理组，在7天后则相反[图8（b）和（c）]。基于这些结果，在药物治疗引起的不同愈合周期中，伤口免疫因子的实时释放存在差异。

4 结论

受抗菌肽中铜-镍结合基序的自然防御机制启发，本研究开发了一种含有Cu单原子催化剂的人工抗菌肽复合物（Cu@G-AMPs），用于抗菌治疗。在鸟嘌呤掺杂丰富杂原子制备的底物上，以配位数为2、平均键长为1.91 Å的方式固定了单个Cu原子。Cu@G-AMPs表现出类芬顿反应的催化活性，在应对MRSA时将产生并递送出致命的ROS。这些ROS对MRSA的应激反应系统，包括群体感应调节、抗氧化酶以及MRSA内部的基因修复和重组，造成了不可逆的损伤。值得注意的是，Cu@G-AMPs能够适应体内复杂的微环境，在耐药细菌感染的伤口区域显示出牵拉边缘闭合、稳定肉芽组织、促进胶原纤维增殖、减轻炎症和促进血管新生的作用。本研究设计的Cu@G-AMPs将为有效应对耐药细菌威胁提供新的视角。

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