1 引言
由成熟体细胞重编程诱导产生多功能干细胞（iPSC）的技术，以及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）与其相关蛋白（Cas）的发现，均已荣获诺贝尔奖并在各自领域带来了重大突破。当两项技术单独应用时，iPSC具有再生受损、受伤或衰竭组织的潜力；而CRISPR/Cas9则能高效编辑基因组，应用于医学、农业和动物育种领域[
1]。这些技术的交叉点在于一个核心原理，即基因表达调控组织的退化和修复。因此，操控基因表达成为构建疾病模型及实现组织再生的可行方式。本文将再生医学广义定义为对突变、受损、受伤或缺陷组织的修复。传统的再生医学策略依赖于将干细胞植入生物相容性支架，或通过转录基因递送来诱导细胞分化为理想的目标组织。尽管这些策略已取得一定成效，但常因体内稳定性低、无法从根源上靶向解决组织损伤，以及潜在的免疫原性等问题，其疗效往往仅限于短期效果。为应对这些挑战，本文将介绍基因组工程（特别是CRISPR/Cas9）如何成为一种高效、精准且多功能的再生医学领域的疗法。此外，我们还将探讨基因编辑作为强大的研究工具在该领域的机制研究中的作用。
在治疗应用方面，CRISPR技术有助于使组织恢复至原始状态，已用于纠正遗传性疾病、将细胞重编程以补偿缺失或功能缺陷的组织、规避同种异体移植的免疫排斥，以及精确调控细胞蛋白表达量。此外，CRISPR技术还被应用于功能基因组学研究和疾病模型构建，且已被证实是再生医学应用与转化研究的重要工具。本文将探讨CRISPR技术在再生医学领域的现状，重点阐述其局限性以及未来发展的前景。
2 组织工程与再生医学
再生医学旨在恢复受损组织和器官的功能。组织工程常与再生医学紧密关联，作为再生医学领域的一个分支，通过构建结构来模拟、维持或恢复组织的正常功能[
2]。具体而言，将干细胞移植到生物材料支架中，并常结合生物活性分子，可促进组织再生[
3]。组织工程与再生医学借助干细胞的自我更新能力恢复失去的功能，并利用生物材料支架模拟细胞外基质（ECM），同时规避免疫原性问题。鉴于器官供体数量有限且免疫排斥频发，这些策略为器官移植提供了极具前景的替代方案。目前，该技术已应用于神经、骨骼和肾脏再生领域，部分工程化组织（如皮肤和软骨）已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准[
3‒
4]。尽管组织工程材料仍面临免疫原性等挑战和其他局限性，但这个不断发展的多学科领域已为复杂慢性疾病的治疗带来了多项突破性进展。
2.1 组织工程的进展和成就
组织工程疗法的成功取决于其高效再生受损组织的能力，而新型技术的出现显著拓展了现有的组织工程工具库。智能生物材料、改良生物反应器、先进三维（3D）打印技术以及新的干细胞来源等成果，共同提升了工程化组织的治疗潜力[
5]。例如，采用ECM支架构建的组织工程产品能为干细胞生长分化提供类原生微环境。研究表明，美国CryoLife公司开发的脱细胞肺的同种异体移植物SynerGraft相比传统同种异体移植物，具有更低的免疫原性[
6]。此外，对材料独特性能的探索也拓展了组织工程产品的应用潜力。以合成水凝胶为例，其优异的保水性能使其成为肾脏再生应用的理想选择[
4]。总体而言，水凝胶能为细胞包埋和生长提供仿生环境，且可通过调节孔隙率、成分和弹性来促进组织再生[
7]。
此外，多种材料3D生物打印技术的进步推动了组织结构中微通道的创建，这不仅增强血管生成及氧气和营养物质的扩散，还能支持特异性细胞的有序排列[
8]。研究人员已成功将分化的心肌细胞和上皮细胞植入3D打印的胶原支架和水凝胶中，缓解了心肌细胞不可增殖带来的挑战[
9‒
10]。由此形成的构建体在几何结构上模拟了心脏的复杂结构，且其多孔微观结构有利于血管生成和细胞浸润[
9‒
10]。在模拟人体组织和器官的复杂几何结构时，先进的打印技术尤为关键。为成功重现表皮与真皮层之间的网状嵴结构，研究人员借助3D打印压印和微折叠技术，最终实现了几何形态与周期性的精准控制[
11]。四维（4D）生物打印技术则能使构建体具备响应外界刺激而改变形状和性能的能力，如电刺激后的特异性细胞分化[
12‒
13]。
胚胎干细胞（ESC）虽存在伦理争议，但其多能性和分化能力在组织工程中具有极高价值。目前，研究人员已投入大量精力寻找干细胞替代来源，如从胎盘或羊水提取干细胞，或通过将体细胞重编程为iPSC。为利用iPSC复制神经组织等组织构建体的多细胞结构，研究人员成功开发了正交分化法[
14]。该方法不依赖培养基诱导信号，而是通过转录因子诱导分化[
14]。
这些进展推动了组织工程产品进入临床转化和FDA批准的阶段。多种工程化组织（包括软骨、骨骼、皮肤、膀胱、血管移植物、气管和心脏组织）已应用于患者治疗[
15]。2008—2021年，欧盟针对组织工程产品的临床试验主要集中于肌肉骨骼疾病、心血管疾病以及皮肤/结缔组织疾病[
16]。一些成功的市场化产品包括：用牛胶原负载人成纤维细胞的OrCel产品治疗烧伤创面（美国Forticell Bioscience公司），通过聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）支架上的人成纤维细胞（Dermagraft）修复糖尿病足溃疡（美国Organogensis公司）[
17]。然而，尽管取得这些进展，心脏和肺等复杂组织的再生仍面临巨大挑战。体外组织工程技术（如类器官与器官芯片）在疾病建模、药物筛选与药物研发领域正发挥日益重要的作用。
2.2 组织工程的局限和挑战
尽管组织工程和再生医学领域已取得显著进展，但仍有巨大的提升空间。传统组织工程疗法主要依赖自体干细胞以避免免疫排斥。事实上，一项分析欧盟组织工程产品临床试验趋势的研究显示，超过半数的试验来源采用自体细胞，且自体细胞产品的研发阶段领先于异体细胞产品，这表明细胞来源与试验阶段之间存在显著相关性[
16]。但近年来，因自体细胞产品存在产能不足、最终治疗产品质量波动大等缺陷[
16]，近期依赖异体细胞来源的试验数量呈上升趋势。此外，当前研究日益聚焦于开发具有广泛免疫相容性的“现货型”组织工程产品。尽管如此，异体细胞的获取仍面临一系列挑战，包括伦理争议、高昂成本、法规壁垒及安全性问题。基因编辑为解决这些问题提供了颇具前景的途径，它有助于iPSC及多种特化细胞类型的生成，而这些细胞对于构建需要多样化细胞类型的复杂组织起了重要作用。此外，本文第4.3节将深入探讨再生医学中基因编辑技术的进展如何应对非免疫原性产品的构建挑战，但需注意的是，这种方法主要针对细胞成分的免疫原性问题，而支架材料的免疫问题仍需寻找其他解决方案。
组织工程产品保质期较短，由于需同时维持三维结构完整性与细胞活性，大多数产品的保质期无法超过4天[
16]。许多用于保存分离细胞的成熟技术（如慢速冷冻法或干燥保存法）在应用于组织工程产品时均无效[
18]。这就迫切需要新的方法来解决产品的保存和按需制备问题，以推动临床转化并缩短患者等待时间。一项研究发现，在低温（4 ℃）磷酸盐缓冲液中保存48 h，可维持iPSC来源组织工程骨的细胞活性和完整性，而冷冻保存培养基无法达到这一效果[
19]。在另一项研究中，研究人员成功将人脂肪基质/干细胞的片状融合培养物在低温（4 ℃）保存溶液中保存，观察到其代谢活性得以保留、ECM完整性未受破坏，且成脂和成骨分化能力维持正常[
20]。然而，低温保存方法的成功仍无法解决长期保存的问题。这表明若证实长期保存技术不可行，则需要可靠且快速的无菌处理技术，以及带有多功能供体数据库的细胞库来实现组织工程产品的按需制备。
组织工程产品的成功与否，取决于其植入体内后能否实现血管化和神经支配，以确保与组织的有效整合。一些研究人员已成功模拟出心脏组织的高密度细胞组成和排列方式，从而能够控制收缩力的大小和方向[
21]。尽管如此，这类组织的转化潜力仍因缺乏血管系统而受限。相反，另一些研究人员成功通过3D打印技术构建出较厚的血管化心脏组织，但存在泵血功能不足、细胞密度低及微血管打印精度受限等缺陷[
22]。近期研究发现，脂肪组织来源微血管片段（ad-MVFs）因其内在的血管生成潜力，成为极具前景的血管化部件。一项研究显示，亚正常体温（20 ℃）下培养24 h的ad-MVFs，其体内血管化密度明显优于正常体温（37 ℃）下标准培养组及未培养的对照组[
23]。尽管基于血管化片段的血管化策略前景广阔，但由于分离出的ad-MVFs比动物源ad-MVFs存活率更低[
24]，未来仍需对其进行优化并提升可扩展性。总体而言，尽管简化组织模型已在多个领域成功应用，但在细胞和组织层面重现器官的全部复杂性仍难以实现。是否能克服这一挑战将取决于制造技术的进步，以及这些技术在可扩展性、精度和一致性方面的提升。
由于每种组织或器官都具有独特的特征和需求，组织工程疗法需要采用个体化定制方案。这就要求在成功开发有效疗法的过程中，仔细考量多种因素，包括细胞类型的选择、与ECM的相互作用、机械力的影响、动态效应以及空间限制等。
3 基因编辑
基因编辑的标志性技术是CRISPR及其相关内切核酸酶，其灵感源自原核生物的免疫系统[
25]。在锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）等众多基因编辑工具中，CRISPR/Cas9因操作简便、特异性强、可重复性高脱颖而出[
26]。
3.1 CRISPR/Cas9编辑的基本原理
CRISPR/Cas9依赖内切核酸酶和向导序列发挥作用，向导序列的功能是将内切核酸酶定位到目标位点。当识别到作用位点后，具有催化活性的内切核酸酶会诱导产生双链断裂（DSB）。细胞随后会启动两种不同的DNA修复机制——非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）。前者会在切割位点产生插入/缺失（indels），后者则需要拥有序列高度同源的供体模板才能在切割位点完成整合[
图1（a）和（b）]。通常情况下，NHEJ可在切割位点构建基因敲除或敲入模型，而HDR能实现可控且精准的基因敲入模型[
27]。然而，NHEJ产生的编辑片段有长度差异，即便使用计算算法也难以预测。因此，NHEJ产生的插入/缺失突变可能无法达到预期的编辑效果，从而限制了其可纠正突变的能力。此外，HDR因效率低、发生频率低（归因于其细胞周期限制）而不受青睐[
28]。在非分裂细胞或细胞周期的G1期，HDR处于失活状态[
29]。CRISPR/Cas9诱导的双链断裂并非毫无缺陷，它们可能导致染色体易位、大片段缺失，还可能激活人类干细胞和祖细胞（hSPC）中的p53通路[
30]。因此，本文还将探讨其他不依赖双链断裂进行编辑的CRISPR方法。
Cas内切核酸酶的作用在一定程度上受限于是否存在兼容的原间隔序列相邻基序（PAM），且PAM需位于单链向导核糖核酸（sgRNA）结合位点的互补链上。目前最常用的Cas9同源物是化脓性链球菌Cas9（SpCas9），这得益于其相关PAM序列具有广泛的靶向范围。尽管邻近基序识别序列（NGG PAM）位点分布广泛，但仍有部分基因无法被靶向编辑。为解决这一问题，研究人员开发了SpCas9的变体（如SpG和SpRY），这些变体能够识别基因组中更多种类的PAM序列[
31]。同理，SpCas12a在诱导切割DNA时也会识别不同的PAM序列。与SpCas9相比，SpCas12a的独特之处在于其能产生交错切割（生成黏性末端而非平末端）。此外，新型Cas效应物已被证实具有转录抑制功能。Cas13因具备单链核糖核酸切割能力而为人熟知，研究显示，Cas13a、Cas13b和Cas13d与CRISPR核糖核酸（crRNA）一同使用时，可实现有效抑制作用[
32]。这项技术能实现RNA水平敲除而不会对基因组造成永久性改变[
32]。
sgRNA由crRNA和反式激活CRISPR核糖核酸（tracrRNA）组成，其作用是引导Cas9定位到靶标位点。此外，sgRNA还决定CRISPR的特异性（即靶向目标位点的精准程度）和效率（即产生双链断裂的效果）[
33]。sgRNA的生成方法主要有三种，即质粒DNA（pDNA）介导、体外转录和化学合成。其中，pDNA法生成sgRNA耗时较长，且容易产生脱靶效应，还存在基因组整合的风险。体外转录法在实验操作上难度较大，且容易出错。相比之下，化学合成的sgRNA在编辑效率上更具优势，同时风险也最低，是目前较好的选择。sgRNA能滴定测量基因的表达水平，这一点至关重要，因为细胞只有在特定的基因表达水平下才会呈现出特定的行为。这对于理解生化通路，以及确定与疾病和治疗相关的基因产品阈值具有重要意义[
34]。研究人员通过创建包含错配sgRNA的文库实现对基因表达的精细调控[
34]。此外，多个sgRNA可靶向基因组的不同区域，从而进一步精确调控基因的表达水平。
sgRNA最关键的特征在于其能够有效结合到基因组内的靶位点，这直接决定了内切核酸酶的作用效果。Cas9介导的脱靶效应通常由sgRNA与靶标序列之间的错配引起。通过实验评估精心筛选sgRNA可降低脱靶风险，但这种方法耗时长。许多研究人员已尝试利用深度学习模型来预测sgRNA的效率[
35‒
36]。然而，由于这些模型所使用的数据源自不同研究，在实验设计上缺乏一致性，且模型验证所采用的参数也存在差异，因此这些模型的应用常受到限制[
35]。
3.2 CRISPR系统
除常规CRISPR/Cas9系统外，多种新技术正处于研究阶段，包括切口酶、失活Cas9（dCas9）、碱基编辑器和引导编辑器等，这些系统具有不同的编辑特性。
3.2.1 切口酶
CRISPR切口酶是常规CRISPR/Cas9的改良形式，其两个核酸酶结构域中的一个发生突变。因此，根据突变位于RuvC结构域还是HNH结构域，这些酶会在DNA的某一条链上产生单链断裂，而非DSB [
25]。切口酶通常可减少脱靶突变，降低染色体易位的发生风险，总体安全性更高[
37]。此外，可通过双Cas9切口酶产生双链断裂，而非依赖单一Cas9核酸酶。研究表明，这种策略的靶向编辑效率与核酸酶相当，有时甚至更高[
37‒
40]。
3.2.2 失活Cas9
催化失活的dCas9是Cas9酶的一种变体。dCas9缺乏任何内切核酸酶活性，无法形成DSB或单链断裂，但仍能与DNA结合[
41]。这种策略可规避与双链断裂相关的细胞毒性[
42]。通过将转录激活因子或抑制因子结构域融合到dCas9末端，可使这些酶具备在转录水平重编程的能力[
图1（c）]。基于这些特性，使用dCas9的CRISPR技术被命名为CRISPR激活（CRISPRa）或CRISPR抑制（CRISPRi）技术[
43]。尽管存在其他转录调控方法[如RNA干扰（RNAi）或小干扰RNA（siRNA）]，但CRISPRa/CRISPRi技术的靶向范围更窄，能够成功阻止来自同一转录起始位点（TSS）的非靶标的转录本受到调控[
44]。
为提高dCas9的效能，研究人员已尝试对转录激活域和抑制域进行优化。在CRISPRa系统中，dCas9可与VP64、p65、Rta等转录激活因子或其组合（如由VP64、p65和Rta组成的VPR系统）进行融合，以增强转录活性。此外，dCas9还能与串联多肽阵列融合（如SunTag系统），或者采用协同激活介体（SAM）系统（该系统结合dCas9-VP64以及由MCP、p65和热休克因子1组成的MPH激活融合蛋白）进一步提升效率[
45‒
47]。CRISPRi采用类似策略，但改用抑制结构域（如KRAB或MeCP2）以及DNA甲基转移酶（如DNMT3A）[
48]。本文将探讨dCas9在细胞重编程、定向分化、遗传筛选研究及疾病模型构建中的应用。
3.2.3 碱基编辑器
碱基编辑器可在不诱导DNA DSB的情况下，对DNA单链上的碱基进行修改[
图1（d）]。细胞自身的DNA修复机制可随后在互补链上完成碱基转换的互补校正。碱基编辑器由Cas9切口酶与脱氨酶融合而成，主要分为两类：胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）。尽管碱基编辑器具有较高的特异性，但其应用受限于碱基转换范围，CBEs仅能实现C∙G至A∙T的转换，而ABEs仅能实现A∙T至G∙C转换。此外，它们可能因随机脱氨基作用导致脱靶编辑和旁观者核苷酸编辑。不过，通过工程化改造脱氨酶以及设计可切割的脱氧胞苷脱氨酶抑制剂，已能有效减少脱靶效应[
49‒
50]。目前，许多深度学习模型已被开发用于预测此类脱靶编辑[
51]。
鉴于点突变是已知的最大一类致病性变异，碱基编辑器成为纠正疾病相关点突变的有力工具[
52]。由于其具备精准性且对细胞周期的限制较少，碱基编辑比通过HDR编辑更有效。此外，由于碱基编辑不涉及DSB，这降低了出现非预期indels以及大规模基因组重排和易位的风险。
然而，碱基编辑器的效力受限于递送效率。这些与sgRNA融合的Cas9效应子体积较大，需要借助多个病毒载体进行递送。具体而言，CBE或ABE加上sgRNA长度为 6.9 kb，而常用病毒载体（如腺相关病毒）的打包上限仅为4.9 kb [
52]。
3.2.4 引导编辑器
引导编辑是一种比碱基编辑更精准、功能更多的替代技术[
图1（e）]。与碱基编辑类似，引导编辑也不依赖DSB，且在产生碱基替换和插入时比HDR更高效。然而，与碱基编辑不同，引导编辑可实现全部12种碱基间的转换以及小片段的indels。引导编辑利用一种与Cas9切口酶融合的逆转录酶，将引导编辑向导核糖核酸（pegRNA）中的信息写入目标编辑区域，从而替换原始DNA序列。pegRNA既能引导催化活性受损的Cas9至靶位点，又能编码所需的编辑序列。此外，与Cas9核酸酶相比，引导编辑过程中的三次不同DNA结合事件降低了脱靶编辑的风险。同时，引导编辑比Cas9核酸酶具有更高的编辑灵活性，能够编辑距PAM位点更远的碱基。最后，与HDR不同，引导编辑可在细胞周期的任何阶段引入编辑，且不依赖供体DNA模板。
一项研究使用引导编辑实现了多种碱基间的转换，并通过靶向indels来治疗疾病、插入遗传标签和表位[
53]。研究发现，引导编辑的效率与HDR相当或更高，其脱靶编辑率低于Cas9核酸酶，而碱基编辑效率则与传统碱基编辑器相近[
53]。研究人员发现，通过向相应的核酸酶结构域引入额外突变，可筛选出最高效的切口酶变体[
54]。为进一步提高引导编辑的效力，研究人员正在探索经工程改造的pegRNA，其中引入了突变和结构修改，能够编辑以往无法编辑的位点[
55]。用带有额外突变的切口酶、经工程化的pegRNA，再结合引导编辑本身已具备的多功能性，进一步提升了编辑特异性，这推动它成为纠正疾病和改进基因组的有效工具。重要的是，尽管引导编辑器本身体积较大，经改进的引导编辑系统大小仍保持不变，因此不会因尺寸问题增加递送难度[
55]。
3.3 CRISPR系统的递送
CRISPR系统的靶向性与充分递送是实现有效基因编辑的关键。评估递送系统需综合考虑免疫原性、包装容量、基因组整合、稳定性、细胞毒性以及靶向能力等要素。我们将递送系统分为病毒递送系统和非病毒递送系统两大类，其中非病毒递送系统又进一步分为化学方法和物理方法。递送载体不仅能保护递送物质免受酶降解，还有助于其实现靶向递送并跨细胞膜转运（
图2）。
3.3.1 递送组件
CRISPR组件的递送方式主要有三种：质粒sgRNA和Cas9、Cas9信使核糖核酸（mRNA）以及合成或体外转录的sgRNA，由Cas9蛋白与sgRNA组成的核糖核蛋白（RNP）复合物。使用pDNA成本低且稳定性好，但存在起效较晚、可能发生基因组整合及脱靶效应等风险。mRNA和RNP的脱靶风险较低，无基因组整合风险，且起效迅速，但受限于成本较高和体积较大，可能给递送带来困难[
56]。此外，RNP复合物无需依赖转录和翻译过程即可生成编辑工具，并且能有效控制sgRNA与Cas9蛋白的比例。
3.3.2 病毒递送
病毒载体是体内递送CRISPR/Cas9系统的常用工具。具体而言，许多研究依赖慢病毒载体、腺相关病毒（AAV）和腺病毒载体。慢病毒可携带大量物质且免疫原性低，但慢病毒会整合到宿主基因组中，这意味着可能因插入突变导致Cas9表达失控，进而可能引发脱靶编辑。AAV的特点是免疫原性低、细胞毒性小，最显著的是其不会整合到宿主基因组中，因此被用于多项临床试验，并成为病毒递送CRISPR系统的首选方法。然而，这种载体受限于其可递送物质的大小，容量不能超过5 kb [
57]。为缓解这一问题，研究人员尝试将CRISPR组件拆分到多个腺相关病毒中，或使用更小的内切核酸酶（如SaCas9）。尽管使用多个载体或更小内切核酸酶的解决方案看似简单，但多个递送载体本身会降低靶向效率并增加病毒毒性，而SaCas9由于其PAM位点较少，也存在自身局限性，从而限制了其应用潜力[
29,
56‒
57]。腺病毒载体具有较大的包装容量，且不会整合到宿主基因组中，从而降低了插入突变的风险。尽管如此，它们的免疫原性很强。许多研究还使用了杆状病毒，其显著特点是具有38 kb的大包装容量[
58]。
尽管使用这些病毒载体的临床试验已取得一定成效，但这些递送载体的免疫原性存在诸多安全隐患。另一个问题是宿主可能产生针对病毒的抗体（称为抗Cas9抗体），导致病毒载体仅限单次使用。尽管如此，研究人员正在开发新的变体（如衣壳变体）以降低免疫反应[
59]。
3.3.3 非病毒递送
为缓解病毒递送面临的挑战，研究人员已探索出非病毒递送方法，分为化学法和物理法。
3.3.3.1. 化学法。CRISPR递送的非病毒化学法包括聚合物和脂质纳米颗粒系统。这些方法可诱导核酸酶的瞬时表达，从而减少脱靶编辑及其他毒性反应。这一点对于CRISPR而言尤为重要，与传统基因治疗不同，CRISPR无需稳定整合到宿主基因组中即可维持足够的治疗水平，而稳定整合反而会产生不良影响。阳离子脂质体和聚合物常被用作CRISPR组件的体内递送载体，因其能够通过静电作用包裹带负电的CRISPR pDNA、mRNA或RNP复合物。研究人员可构建大型文库，可筛选出具有最佳包装容量、最低免疫原性和最高编辑效率的纳米颗粒配方。例如，已有研究通过优化阳离子聚合物的支链和功能基团，增强其静电相互作用，从而提高细胞摄取率和内体逃逸能力[
60]。通常情况下，传统基因递送中使用的类似聚合物和纳米颗粒制剂也可用于CRISPR递送。此外，还有研究人员探索了将磁性纳米颗粒和纳米金刚石作为非病毒递送的载体，为递送提供更新颖的选择[
61‒
62]。
3.3.3.2. 物理法。治疗剂递送的物理法包括显微注射、电穿孔和声穿孔。这类方法的特点是精准度高，但具有侵入性。例如，显微注射（将CRISPR组件直接注入细胞）和电穿孔（利用电脉冲瞬时打开细胞质膜）已被证实具有较高的转染效率，然而由于其细胞毒性，无法在体内使用。此外，对细胞膜的操作会破坏细胞的完整性[
56,
63]。尽管如此，电穿孔仍被广泛应用于离体研究——细胞经过编辑后回输到患者体内时常采用这种方法。更具创新性的物理递送方法包括膜过滤辅助跨膜内化（TRIAMF）以及通过渗透胞吞与丙氨酸甜菜碱诱导转导（iTOP）[
63‒
64]。与电穿孔相比，这些方法的细胞毒性更低，但仍无法实现体内递送[
63‒
64]。
这些物理法通常更适用于内吞摄取能力较弱的细胞，因此这类细胞需要依赖直接转染方法。尽管如此，须注意并非所有临床应用都能依赖体外编辑，也并非所有临床应用都能获得先进设备。
3.3.4 基因治疗与再生医学
本文关注基因编辑在再生医学和组织工程中的应用。基因编辑是更广泛的基因治疗领域中的一个专业化的分支，能对基因组进行更精准且持久的改造。传统基因治疗通常涉及向靶细胞递送外源基因，且往往需要多轮治疗以维持疗效，而与传统基因治疗不同，基因编辑则直接修改基因组内的DNA序列[
65]。基因治疗（或称基因添加疗法）主要有两种形式：一是在体内递送外源基因；二是在体外将基因递送至已采集的细胞，随后进行细胞移植。除了通过基因编辑实现直接的基因修改外，基因治疗还可抑制过量产生的蛋白质的合成，或递送遗传物质以人工增加某种蛋白质的产量[
66]。例如，在骨再生研究中，许多研究通过递送血管生成因子、骨形态发生蛋白或成骨转录因子来诱导性多能干细胞分化[
67‒
68]。类似地，在镰刀型细胞贫血病（SCD）的治疗中，FDA最近批准了蓝鸟生物公司的体外基因疗法，该疗法可向患者细胞中添加功能性β-珠蛋白基因[
69]。尽管基因治疗在多种疾病的治疗中已取得显著成功，且被视为该领域的重要里程碑，但其仅能递送基因，而不能纠正或灭活突变基因[
70]，因此无法治愈某些疾病。传统基因治疗的最大挑战之一是递送载体的优化，本文也将探讨为何这仍是基因编辑技术面临的挑战。总体而言，向细胞或组织递送健康基因虽能带来良好的治疗前景，但纠正突变基因的能力具有更大的应用潜力。
4 基因编辑在再生医学治疗中的应用
本节将阐述基因编辑在再生医学治疗领域的应用。总体而言，我们将其分为治疗单基因疾病、增强组织修复、减轻移植后免疫反应，以及精准的蛋白质剂量调控与递送四大类。
令人振奋的是，目前已有多项使用CRISPR/Cas9技术治疗各类疾病和综合征的临床试验正在进行中。根据clinicaltrials.gov数据，大多数Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期临床试验旨在治疗血红蛋白病（如镰刀型细胞贫血病和β型地中海贫血）或多种癌症（包括淋巴瘤、白血病和实体瘤）。此外，还有一项针对杜氏肌营养不良症治疗进入Ⅰ期活性临床试验阶段（NCT05514249）。这些试验为基因编辑疗法的未来发展奠定了基础。重要的是，目前尚无探索用于治疗退化组织的组织构建的基因编辑的临床试验，这凸显了将基因编辑疗法转化为再生医学应用方面存在的显著差距。
4.1 基因编辑用于纠正遗传性疾病
因为单基因疾病的突变仅局限于单个基因，所以该类疾病[如囊性纤维化（CF）、SCD和成骨不全症（OI）]成为基因组编辑技术的理想治疗对象。目前已知的单基因遗传病超过5000种，据估计，6%的人一生中会受其影响[
71]。基因编辑技术可应用于干细胞和祖细胞，从而产生持久、潜在的治愈效果。下一节将探讨研究人员如何利用CRISPR技术来改善遗传性疾病。鉴于发病率较高、领域内研究较广、根据研究进展有望治愈，本文重点关注上述三种单基因疾病。
4.1.1 囊性纤维化
CF是由囊性纤维化跨膜传导调节因子（
CFTR）基因突变引起的单基因遗传病，会导致呼吸道和消化道中的氯离子通道功能异常。小分子药物已显示出改善肺功能的潜力，但它们存在局限性，如需要重复给药、不适用于无法产生
CFTR基因的CF患者，且最终无法针对疾病的遗传根源治疗。此外，多种细胞外屏障（如气道黏液、黏膜纤毛清除作用和CF黏液脓性痰）为体内药物和基因递送带来了挑战[
72]。考虑到大量基因治疗方法试图递送
CFTR基因的互补DNA（cDNA），上述屏障问题显得尤为关键[
73]。再者，基因治疗在实现野生
CFTR的永久性表达方面受到限制，原因包括肺上皮细胞的快速更新以及干细胞和祖细胞的靶向性较差[
74]。而CRISPR/Cas9基因编辑技术绕过了这一限制，因为它不需要核酸酶的持续表达即可发挥功效。然而，值得注意的是，CF存在超过2000种突变，可分为六大类，无论使用CRISPR还是小分子药物，这些突变都将大大增加该疾病在靶向治疗方面的难度[
75‒
76]。
多项研究使用CRISPR HDR介导的敲入技术，创建基因校正后的自体干细胞疗法。一项研究中，研究人员采用体外基因编辑技术，纠正原生的上呼吸道基底干细胞（UABC）中常见的Ⅱ类ΔF508突变[
77‒
78]。研究人员通过电穿孔将含沉默突变的RNP导入，以防止Cas9再切割[
77]。此外，研究人员通过腺相关病毒6型（AAV6）递送供体修复模板，感染复数（MOI）为10
6。类似策略（先电穿孔导入RNP，再通过AAV6递送供体）已成功将大型转基因导入hSPC，不同之处在于这些细胞不需要如此高的MOI [
79]。总体而言，结果显示UABC的校正效率较高，且无需使用HDR法中常用的药物筛选手段。尽管采集自体UABC存在技术难度，但使用这些原代细胞具有多项优势，包括降低免疫排斥风险、减少未分化iPSC导致的畸胎瘤形成风险，且无需冗长的分化流程即可直接回输至患者体内[
图3（a）]。不过，上呼吸道的体内移植方案仍需进一步研究和优化[
77]。尽管电穿孔适用于该体外研究，但无法用于体内研究。研究团队随后拓展了工作，意识到除常见ΔF508突变外，
CFTR基因中还有许多其他致病性突变需要纠正。因此，他们使用CRISPR/Cas9 HDR介导的敲入技术，将cDNA插入
CFTR基因座，其中外源基因通过两种AAV导入UABC [
80]。HDR需要外源修复模板，且具有细胞周期依赖性，这意味着该过程效率极低，在转化应用和临床实践中难以普及[
81]。因此，对传统HDR技术的改进或替代方案将有助于CF的相关应用适配。
另一种纠正
CFTR基因突变的方法是递送AsCas12a核酸酶及单一CRISPR核糖核酸（crRNA），通过indels来修正原生气道上皮细胞中的点突变。Maule等[
74]采用这一方法纠正了
CFTR基因中影响基因正确剪接的突变，这类突变会导致生成截短且功能异常的蛋白质产物。其他研究也采用了类似策略，利用SpCas9及多个sgRNAs来纠正剪接突变[
82]。不过，用AsCas12a产生的缺失片段更小，这体现了该核酸酶的精准性。为纠正相同突变，同时寻求比NHEJ和HDR（两者易出错且受细胞周期限制）更高效的编辑方法，其他研究分别采用了碱基编辑器[
83]和引导编辑器[
84]。其中一项研究通过碱基编辑技术，将优化后的SpCas9-ABE7.10 RNP经电穿孔递送至人气道上皮细胞（而非干细胞或祖细胞），以恢复
CFTR通道功能。由于许多
CFTR突变属于点突变，因此碱基编辑的应用具有可行性。尽管碱基编辑取得了成功，但该工具也产生了不理想的旁观者编辑[
83]。
综合来看，在针对CF的基因编辑中，有几个重要问题需要注意。首先，在递送方面，由于CF会影响多个器官，治疗囊性纤维化药物若能采用可到达多个组织的全身递送方式将能发挥最大效用。但这需要递送系统穿过毛细血管内皮层和间质组织，才能到达肺或其他器官内的上皮基底膜[
75]。相反，若要递送至上皮管腔，则需绕过厚厚的黏液层和黏膜纤毛，避免被清除[
75]，如
图3（b）所示。细胞穿透肽（CPP）与穿梭肽结合后，能够跨越多重屏障并到达上皮屏障细胞[
85]。尽管如此，研究人员可能会选择采用有创的自体或同种异体校正细胞移植。虽然这种方法无法解决广泛患病的器官的系统问题，但一般认为，仅针对肺部进行治疗就可能带来显著疗效[
81]。关于需要移植多少细胞才能达到治疗效果，目前尚无定论，但以往研究表明，当10%~50%的气道上皮细胞表达野生
CFTR时，该系统即可呈现野生型功能[
86]。此外，鉴于CF突变数量繁多，一个有利的选择是插入全长
CFTR基因以替换整个突变的内源基因，尽管这受到HDR技术局限性的制约。而这些局限性或许可以通过针对CF的引导编辑技术来克服。
4.1.2 镰刀型细胞贫血病
输血依赖性β型地中海贫血（TBT）和SCD是两种常见的单基因疾病，均由
HBB基因突变引起，二者都会损害红细胞功能，后者会导致野生型血红蛋白（HbA）突变为镰状血红蛋白（HbS）[
87]。目前的治疗方法虽能缓解疾病症状，但均无治愈效果[
88]。例如，临床标准治疗药物羟基脲是一种胎儿血红蛋白促进剂。胎儿血红蛋白（HbF）通常在出生后表达受抑，但其产量增加可弥补疾病导致的HbA缺陷。这种口服药物虽患者依从性较高，但存在诸多不良反应，且需要重复给药[
89]。基因治疗方法依靠慢病毒导入抗镰变β珠蛋白变体或短发夹核糖核酸（shRNA），以逆转对HbF的抑制作用[
88,
90]。两种方法分别产生抗镰变血红蛋白变体（HbA
T87Q）或诱导HbF形成[
88,
90]。
令人振奋的是，FDA批准了首款一次性非病毒CRISPR/Cas9疗法，卡斯盖维（CASGEVY）。该疗法由福泰制药公司和CRISPR医药公司共同研发，用于治疗SCD和β型地中海贫血[
91‒
92]。这种治疗方法是一种自体的体外基因疗法，流程为从患者骨髓（BM）中采集人多能干细胞（hPSC）并进行编辑[
91]，如
图3（a）所示。该疗法通过沉默
Bcl11a基因（一种抑制胎儿血红蛋白基因的基因）发挥作用[
91]。最后，患者接受骨髓清髓治疗以清除病变血细胞，经编辑的细胞则被回输至患者骨髓中。其他临床试验也旨在通过增加胎儿血红蛋白（NCT06506461）的量，以相同方式治疗该疾病。鉴于采集患者细胞、骨髓清髓和移植均具有侵入性，还需更多研究来评估该技术在体内递送的潜力。此外，这种治疗SCD和β型地中海贫血的疗法面临高成本阻碍，尤其是考虑到这些疾病在许多资源匮乏地区较为高发。而且，重新激活HbF仍未解决疾病的根本病因。尽管如此，通过精准编辑干细胞，这种疗法仍具有治愈潜力。
鉴于SCD由
HBB基因的单个点突变引起，已有研究尝试采用其他策略纠正。Kamau医药公司开发的自体药物产品nulabeglogene autogedtemcel（简称nula-cel）正处于Ⅰ/Ⅱ期临床试验阶段，通过HDR技术将突变氨基酸胸腺嘧啶转化为非致病性变体（NCT04819841）。首位接受nula-cel治疗的患者一年随访发现，患者临床症状显著改善，未出现血管闭塞危象，生活质量显著改善，说明该药物有望治疗更多患者[
93]。nula-cel疗法的作用机制与CASGEVY不同，它通过降低致病性HbS水平，从根源上针对疾病进行治疗。尽管其治愈效果的长期持久性仍在评估中，但这种疗法已成为SCD治疗领域的重要里程碑。
鉴于HDR效率较低，且更先进的碱基编辑技术不断发展，近期研究已关注运用引导编辑器治疗SCD。Li等[
94]成功通过引导编辑器将突变的缬氨酸密码子转化为谷氨酸密码子。由于引导编辑器体积较大，而大多数慢病毒和AAV载体存在容量限制，研究人员将其装载到辅助依赖型腺病毒（HDAd）载体中。这种载体可通过其纤维蛋白特异性靶向造血干细胞（HSC）。转化成谷氨酸不仅纠正了镰变突变，还通过引入一个沉默突变破坏PAM序列，从而阻止引导编辑器进一步编辑[
94]。体外编辑结果经下一代测序（NGS）验证，证实靶位点的转化率较高。尽管体外方法能对干细胞进行高度可控的处理，并允许在移植前验证编辑后的细胞，但这种耗时且有创的过程仍需借助体内编辑技术。为评估引导编辑器的体内应用潜力，研究人员静脉注射了一种非整合型、表达引导编辑器的病毒载体，最终使43%的镰状血红蛋白被健康的成人血红蛋白替代[
94]。在体内，HSC存在于BM中，并受到骨髓基质等物理屏障的保护。目前，体内编辑策略依赖于将造血干细胞从骨髓移动至至外周血，以便静脉递送的基因编辑组件能够接触到它们[
94‒
95]，如
图3（b）所示。若能优化成直接向骨髓的递送方式，将对这些策略大有裨益。尽管如此，针对SCD的引导编辑在体外和体内治疗中均取得了显著进展，两种方法均能使患者的血液学参数恢复正常，且类似健康对照组[
94]。这种疗法的脱靶编辑极少，且操作简便、易于推广，使其能够在该疾病高发的欠发达地区应用。
4.1.3 成骨不全症
OI是一种单基因骨疾病，其特征为骨骼脆弱、骨量减少和反复骨折。已知OI与
Col1a1和
Col1a2基因突变有关，这两个基因编码构成I型胶原蛋白的组分，而Ⅰ型胶原是骨骼的主要成分。除了使用双膦酸盐预防骨量丢失外，研究人员还尝试了干细胞疗法。他们将人类胎儿血液间充质干细胞/基质细胞或人类胎儿早期绒毛膜干细胞通过腹腔注射或直接植入成骨不全症小鼠的骨骼中，将这些细胞分化为成熟的成骨细胞，最终产生健康的胶原[
96‒
97]。尽管取得了一定成功，但这种方法并未从遗传根源上解决疾病问题。
在一项研究中，研究人员采用OI患者来源的外周血单个核细胞（PBMC），将其重编程为iPSC，并通过HDR介导的CRISPR敲入技术纠正突变基因[
98]。在这项体外实验中，研究人员通过试剂转染内切核酸酶和供体单链DNA（ssDNA），最终细胞成功分化为成骨细胞并产生Ⅰ型胶原[
98]。另一项研究中，研究人员使用类似方法将OI患者来源的成纤维细胞重编程为iPSC的同时，递送CRISPR/Cas9组件及供体DNA，通过HDR介导突变纠正[
99]。
这些研究为OI的基因校正提供了原理验证，但仍需进一步研究评估这些细胞的移植至患者的能力。成功的关键在于避免移植后的免疫排斥反应，这一点将在第4.3节中讨论。
4.1.4 其他疾病的基因校正应用
CRISPR技术已成功应用于多种其他疾病的校正研究，如杜氏肌营养不良症、糖尿病和年龄相关性黄斑变性（AMD）等。以下简要列举相关研究及其成果与局限性。
为解决大型ABE递送困难的问题，研究人员将碱基编辑器拆分到两个独立的病毒载体中。借助AAV，研究人员在成年小鼠中成功纠正了杜氏肌营养不良症[
100]。尽管取得了这一成果，但小鼠实验的阳性结果并不一定能推广到人类身上。此前一项采用静脉注射高剂量、编码CRISPR激活编辑技术的AAV（NCT05514249）来治疗杜氏肌营养不良症的Ⅰ期临床试验导致患者死亡。该案例表明，尽管体内递送方式在CRISPR/Cas9递送方面比体外方式更具优势，但该领域仍需优化体内递送效率，在保证高基因校正水平和靶向性的同时，还需降低剂量。此外，有必要开发毒性低于病毒载体的递送系统，因为病毒可能具有强毒性（尤其是高剂量使用时），而高剂量往往是递送大型CRISPR的技术必要条件。
另一项研究中，研究人员通过CRISPR HDR技术在体外纠正了一种导致糖尿病的致病性变异[
101]。在AMD治疗研究中，研究人员使用工程化慢病毒实现Cas9的瞬时表达，通过CRISPR敲除目标基因，有效恢复了视网膜组织和血管的发育，同时缓解了慢病毒递送的主要挑战之一，即整合到宿主基因组中[
102]。除了优化体内递送、效率和可扩展性外，未来研究将探索构建“现成可用”的iPSC，以简化体外干预。但这也面临挑战，即每位患者的免疫系统存在差异且同一种疾病可能具有不同的临床表现。
4.2 用于增强组织修复的基因编辑
许多疾病和损伤的特征是成熟细胞的流失。例如，阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、帕金森病和亨廷顿病等神经退行性疾病，都伴随中枢神经元的丢失和退化。此外，骨骼和肌肉损伤的特征是成骨细胞、软骨细胞以及肌纤维的流失。这些细胞往往会永久性丧失，或难以完全恢复功能和数量。而且，许多这类细胞的再生潜力会随着年龄增长而衰退。因此，组织工程领域高度依赖iPSC和ESC，因为它们具有高度的多能性、自我更新能力，以及用于组织替代疗法的高分化潜力。由于人类胚胎的获取受限且存在伦理争议，该领域已转向探索优化iPSC制备的方法。多年来，通过慢病毒递送转录因子以重编程体细胞的方法尽管在靶向性、多路复用方面存在局限性，且与大型转基因的兼容性较差，但是在该领域占据主导地位。此外，当iPSC完成去分化后，如何通过精心选择的培养基实现体外定向分化，以获得高度特异且纯化的细胞群仍是一项挑战，且该过程的可重复性往往较差。
本节将阐述CRISPR技术在增强组织修复这一领域的应用。首先，探讨利用CRISPR技术将体细胞重编程为iPSC的方法。其次，探讨使用CRISPR技术分化成熟细胞时需考虑的因素。最后，讨论通过移植这些细胞创建体内组织结构以修复受损组织的相关研究。这些应用均借助CRISPR技术改变细胞命运，用以服务于再生医学。对这些应用的总结详见
图4（a）。
4.2.1 体细胞重编程为iPSC
传统上，将成熟的体细胞重编程为多能干细胞的方法是向细胞的开放阅读框（ORF）中导入一组经过深入研究的外源转录因子，这些因子在胚胎发育中具有重要作用，包括
Oct14、
Klf4、
Sox2和
c-Myc [
103]。后续研究中，通过加入
Nanog、
Lin28等额外的转录因子，也取得了成功[
104]。这些转录因子的递送方式包括质粒病毒载体表达、mRNA转染或蛋白质转染，但这些方法存在局限性。质粒和病毒载体可能导致非预期的外源基因整合到基因组中，引发外源基因的重新激活，进而可能导致肿瘤发生[
105]。逆转录病毒载体的外源基因表达具有时间限制性和渗漏性，因为多能干细胞会沉默逆转录病毒[
106]。非整合型病毒载体（如腺病毒）的重编程效率较低。利用合成mRNA和蛋白质进行重编程的方案成本高昂，且技术难度较大[
107‒
108]。近年来，研究开始采用化学法进行体细胞重编程，但该方法在效率、特异性以及化学物质诱导的遗传毒性方面仍面临挑战[
109‒
110]。为克服这些局限性，我们将探讨CRISPR技术在体细胞重编程中的应用。
CRISPRa/CRISPRi在基因重编程中具有独特优势。该技术具备同时进行多靶点编辑的能力，可将针对不同基因座启动子的多种sgRNA连接到单个质粒中。此外，它对多个内源基因座的靶向性具有高度特异性。这为通过CRISPRa/CRISPRi抑制技术实现高效且精准的修改奠定了基础。多项研究探索了使用CRISPRa将体细胞重编程为iPSC，具体方式是靶向内源启动子，如
Oct14、
Klf4、
Sox2、
Lin28和
c-Myc的启动子[
111]。此外，研究发现，通过额外靶向胚胎基因激活富集的ALU基序（EEU）和miR-302/367位点，可进一步提高重编程效率，而EUU在参与胚胎基因激活（EGA）的基因启动子附近富集，miR-302/367基因座在ESCs中高表达[
111‒
112]。与传统方法相比，这些方法还被证实能加快iPSC的形成[
111‒
112]。在体细胞重编程中，基因编辑的特异性和持久性使其比转录因子的病毒递送更具优势。
4.2.2 iPSC分化为目标细胞类型的注意事项
总体而言，该领域已实现将干细胞和祖细胞分化为神经元、单核细胞、巨噬细胞、骨骼肌细胞、成骨细胞和软骨细胞[
42,
44,
113‒
115]。精心选择与dCas9融合的激活域或抑制域促成研究取得成功。例如，研究表明强效三联激活因子（VPR）促进神经细胞分化的效率较VP64提升十倍以上[
44]。然而，还有其他关键因素会影响转录调控的成功，包括靶基因的表观遗传状态、CRISPR组件大小，以及对dCas9活性的精细调控能力。
部分研究重点关注从一种成熟细胞类型直接转分化为另一种成熟细胞类型。在一项研究中，研究人员通过SunTag转录激活因子（用p65-HSF1替代VP64）激活三个内源基因，在体内将星形胶质细胞转化为功能性神经元[
26]。与其他dCas9系统类似，研究人员发现靶基因的激活水平存在差异，推测这与基因的基础表达水平、表观遗传状态或sgRNA靶位点的可及性有关[
26]。因此，这些数据强调了外在因素对CRISPR技术成功应用及后续蛋白质表达的重要性。其效率不仅取决于转录激活因子的水平，还取决于靶基因的表观遗传状态以及sgRNA的定位能力。
此外，在体内递送大型dCas9及转录激活因子/抑制因子仍是一项挑战，这限制了该技术的完整转化潜力。考虑到融合结构域和调控因子体积较大，且为提高效率常需联合使用，这一问题就显得尤为突出。带有转录结构域的dCas9尺寸超过了重组AAV载体的承载能力，而AAV载体是基因递送的金标准。为解决dCas9的递送难题，已有研究尝试根据蛋白质水平将dCas9拆分到两个递送载体中，部分研究已成功实现高效的转录激活及靶基因的长期表达[
116]。一分为二的dCas9重组效率因拆分位点的不同而存在显著差异。因此，这些研究关注分裂位点对重建效率的影响的深入筛选和表征，以及这在多大程度上影响转录活性。另一项研究通过将sgRNAs和转录激活因子/抑制因子装入一种病毒，而将dCas9装入另一种病毒，实现了CRISPR组件的拆分递送[
117]。尽管双病毒递送dCas9的方式取得了成功，但单个或多个病毒载体相关的安全性问题仍是一大隐患。此外，由于难以在时间和空间上同时将两种组件递送至同一细胞，这些双递送系统的效率通常较低[
118]。
因此，通过化学或物理法成功实现dCas9和sgRNA的非病毒递送，理论上具有更高的负载能力，从而为大型dCas9的递送提供更高效、更安全的选择。在一项研究中，研究人员开发了一种在聚己内酯（PCL）纳米纤维上包覆自组装肽（SAP）涂层，形成自组装肽涂层支架的方法，该支架可在基于聚乙烯亚胺（PEI）的转染试剂辅助下，成功负载并释放CRISPR组件[
119]，如
图4（b）所示。PCL因结构稳定且生物相容性良好而广泛应用于组织工程，PCL与可实现CRISPR局部递送的SAP涂层结合，可构建可定制化的支架，且能整合具有独特功能的肽。这些肽可发挥不同作用（如促进增殖或细胞黏附），与CRISPR的转录活性形成互补。例如，层黏连蛋白衍生肽可通过偶联促进神经细胞黏附，同时配合CRISPR激活技术介导神经细胞分化。尽管该系统在负载和释放pDNA复合物方面表现出一定成效，但转染效率并不高，尤其在难以转染的细胞系，如人类神经祖细胞（hNPC）[
119]。研究认为，尽管成本较高，但通过递送RNP组件，或使用比PEI转染试剂更有效的递送载体，可能会改善这一问题。因此，开发具有高转染效率的非病毒CRISPR递送系统仍十分必要。为实现高容量递送，另一类研究尝试通过删除不同结构域来构建dCas9的小型变体。尽管如此，这些方法并非完美无缺，因为它们会限制可利用的PAM位点。研究还探究了除CRISPR技术外的其他小型表观遗传调控技术，例如，利用纳米抗体招募内源性染色质调控因子至靶基因，最终形成表观遗传记忆[
118]。尽管本文聚焦于基因编辑技术（尤其是CRISPR技术），但值得注意的是，转录调控领域还存在其他更小型的替代技术。联用这些技术可能会产生更强的转录调控效果。
此外，成功的定向分化还依赖于增强dCas9调控的方法。这能实现对基因激活或抑制更高效的调控，尤其是考虑到大多数应用场景需要dCas9持续且稳定地表达，用以在多次细胞分裂过程中维持转录调控[
42]。多项研究发现，使用多个sgRNA同时靶向同一基因，可增强预期的转录激活效果[
47,
120‒
121]。在另一种系统中，研究人员将dCas9与KRAB转录抑制结构域、DNA甲基转移酶结合，并加入抗蛋白水解连接子，以稳定基因沉默记忆[
42]。研究发现，尽管dCas9蛋白的表达是瞬时的（转染后10天），但其转录活性却能持续50天，这一特性在iPSC向神经元分化的内源基因沉默应用中展现出显著优势[
42]。虽然某些治疗应用可能需要随着细胞增殖维持基因的持续表达（如对细胞存活和维持至关重要的管家基因），但其他应用可能仅需要瞬时的基因表达（如参与细胞应激反应的基因）。在这项研究中，研究人员发现，通过CRISPR技术敲除DNA甲基转移酶，可有效逆转之前的转录沉默状态[
42]。综上，这些研究为细胞分裂和分化过程中表观遗传记忆的可编程调控提供了策略。
关于体细胞重编程，如第4.2.1节所述，研究人员采用了多西环素（DOX）诱导型转基因递送策略，因为重编程效率与转基因的表达持续时间相关[
26,
122]。尽管多西环素诱导技术历来被用于递送慢病毒转录因子以实现重编程，但近期研究将其与CRISPRa/CRISPRi技术结合，以消除非预期的基因重新激活和低效沉默问题。研究将dCas9整合到宿主基因组中，通过多西环素来调控多能性与分化过程，最终实现蛋白质水平的上调或下调[
116,
123‒
124]。因此，如今我们已能激活特定基因，且调控精度更高。例如，仅在细胞达到适当成熟状态时才激活基因。此外，多西环素诱导的Cas9表达解决了Cas9的表达渗漏问题，而这种表达渗漏会导致不必要的脱靶编辑。鉴于细胞状态具有瞬时性，且在成熟细胞分化过程中，转录因子的激活存在时间相关性，这种可调节且可逆的基因激活技术显得尤为实用。
研究人员利用CRISPR敲入技术，将已知对运动神经元（MN）特性建立至关重要的外源转录因子整合到诱导型四环素反应元件的下游[
125]。尽管这些转基因已成功整合，但研究人员观察到，促进运动神经元分化的内源性调控基因和功能基因出现了失调[
125]。这一现象与四环素诱导系统的表达渗漏相关，也与即使在DOX引入前，转录因子就已被激活相关。总体而言，分化失败被归因于iPSC中转基因的过早激活，这干扰了正常的神经分化过程[
125]。该研究揭示了多西环素诱导系统的缺陷，以及在不使用培养基中本应提供的模式形成因子的情况下，利用CRISPR技术驱动分化所面临的挑战。这类系统的另一缺点更明显，即当药物浓度达到阈值水平时，药物浓度与基因激活/抑制之间会呈现负相关关系[
116]。
综上，鉴于多种退行性疾病和损伤的特征均为细胞丢失，将iPSC定向分化为成熟细胞至关重要。尽管将CRISPR技术应用于iPSC是一种极具价值的选择，但正如相关研究所强调的，必须考虑多种因素，如目标基因的表观遗传可及性、编辑组件的大小，以及实现可编程核酸酶的表达等。
4.2.3 体内组织构建体
尽管目前存在不依赖基因编辑技术的传统自体移植物和同种异体移植物，但这些方法受限于供体可获得性、低效率以及感染风险。将基因编辑技术与具有高增殖和分化能力的干细胞相结合，可增强细胞的再生潜力，并为实现组织完全再生奠定基础。本节将阐述CRISPR技术在干细胞中的应用，以修复体内受损组织。
4.2.3.1. 骨修复。骨骼虽具备自我再生能力，但在临界尺寸骨缺损和大面积骨丢失的情况下，其再生能力会受到限制[
126]。此外，婴儿能够轻松修复颅骨，而成年人随着年龄增长，干细胞功能下降，这种修复能力也会丧失[
127]。另外，在骨肿瘤（常见于癌症转移）病例中，骨骼无法自行再生，这就有必要开发新型骨修复技术[
128]。本文综述的多项研究均采用经基因组编辑的细胞（而非基因递送的细胞）移植回患者体内，以修复受损骨骼。
研究表明，骨形态发生蛋白（
Bmp）、胰岛素样生长因子1和2（
Igf1和
Igf2）、转化生长因子（
Tgf）以及血管内皮生长因子（
Vegf）等生长因子可诱导骨生成，并在自然骨再生过程中发挥作用[
67‒
68,
129]。因此，研究人员探索通过CRISPRa激活这些基因以再生骨组织。在一项研究中，研究人员利用慢病毒CRISPRa技术在体外编辑原代骨髓间充质干细胞（MSC），使
Bmp9过表达，随后将这些细胞局部注射到颅骨缺损大鼠体内[
130]。该研究采用组成型dCas9-VPR表达。
Bmp9增强了间充质干细胞分化的骨生成潜力，体内研究显示骨形成和矿化程度均有所提升[
130]。尽管慢病毒转染效率较高，但其尺寸限制和安全性问题仍是亟待解决的挑战。在另一项研究中，研究人员利用基于杆状病毒协同激活介体的CRISPR激活系统，在原代骨髓干细胞中协同激活
Wnt10b和
Foxc2基因，以促进成骨细胞分化，随后将这些细胞植入体内，用于修复颅骨缺损[
121]。研究中，CRISPRa系统成功激活内源性基因的时间超过14天[
121]。杆状病毒的特点是其包装容量大于慢病毒，能够容纳所有必需的CRISPRa/CRISPRi组件。此外，它具有非整合特性，这降低了毒性并使其具备安全性，但同时也限制了激活的持续时间。为了突破持续时间的限制并延长被激活基因的表达，研究人员在此使用了一种杂交杆状病毒系统。该系统表达Cre重组酶，以及一个独立的、由loxP位点侧翼标记的转基因（包含sgRNA序列、dCas9、相关转录激活域和核定位信号）[
121,
131]。在另一项研究中，研究人员通过非病毒递送的CRISPRa技术协同激活转化生长因子β1（
Tgfb1）和
Vegfa，以促进成骨细胞前体的成骨[
132]，如
图4（c）所示。研究人员使用了一种含细胞核定位肽和叔胺基团的阳离子共聚物。这种非病毒递送系统不仅规避了病毒载体的包装限制和免疫原性问题，还采取了有效措施将CRISPR组件递送至细胞核，从而避免质粒被溶酶体降解[
132]。此外，为了规避其他研究中采用的有创性输注编辑细胞所带来的风险，研究人员将编辑后的细胞植入水凝胶中进行体内递送。因此，这项研究不仅强调了对经过充分编辑的细胞的需求，还凸显了对细胞包封移植装置的需求。这种装置需模拟天然ECM，并能实现可调节的细胞释放。研究中，多基因激活在提升骨密度和促进愈合效果方面优于单基因激活，这体现了CRISPR技术多靶点调控能力的优势[
图4（c）]。尽管如此，这种非病毒CRISPRa递送系统的激活效果持续时间有限（未超过14天），研究人员推测这可能与酶介导的DNA降解有关。这对于需要持续基因激活以实现组织修复的长期骨再生过程而言，可能并不适用。这表明需要一种可诱导或可编程的非病毒CRISPR激活系统，以实现对生长因子激活的可控性，同时保持较高的安全性。以往的研究依赖于可生物降解且生物相容性良好的支架来直接负载生长因子（如BMP9），这种方法能有效促进MSC向成骨细胞分化[
133]。尽管直接进行基因治疗和蛋白质递送看似可行，但这受表达短暂、靶向效率低下限制，且若将其载入支架，还会出现生物活性丧失的问题[
134]。CRISPR/Cas9所具备的精准性及其多靶点调控潜力，使其比传统基因或蛋白质递送方法更具优势。然而，关键在于评估多靶点调控能力何时能发挥优势，因为已知某些生长因子可独立发挥作用，而另一些则在协同作用时效果最佳[
68]。此外，值得注意的是，文中提及的许多基因（如
Tgfb1和
Foxc2）具有多效性；因此，在激活这些分子时需谨慎，并建议使用非整合型递送载体，以助于实现对转基因表达的时间调控。
除CRISPRa外，CRISPRi也能有效促进骨再生。尽管存在siRNA和shRNA等蛋白质抑制方法，但这些方法易产生脱靶效应。研究表明，与核糖核酸干扰（RNAi）和反义寡核苷酸相比，CRISPRi的脱靶效应最少[
135‒
136]。
Bmp2在促进骨修复的同时，也会促进其拮抗剂Noggin（
Nog）的表达，从而自我限制自身活性[
137]。因此，研究人员利用杂交杆状病毒在脂肪干细胞（ASC）中同时抑制拮抗剂
Nog并导入
Bmp2，以刺激有效的成骨作用和体内骨愈合[
131,
137]。此外，尽管该研究未使用CRISPRa激活
Bmp2，但鉴于杆状病毒的大容量，未来研究可尝试在单个杆状病毒中同时表达CRISPRi和CRISPRa。例如，另一项研究中，研究人员构建了一种双向基因调控系统，该系统能够同时激活和抑制基因，以诱导软骨细胞分化从而促进骨愈合[
138]。具体而言，研究人员利用融合了转录激活因子的失活化脓性链球菌Cas9（dSpCas9），通过染色质重塑（即组蛋白乙酰化）激活
Sox5、
Sox6和
Sox9基因，并利用融合了DNA甲基转移酶的失活金黄色葡萄球菌Cas9（dSaCas9）在脂肪干细胞中抑制
C/ebp-α和
Ppar-γ基因[
138]。这些技术选用脂肪干细胞而非骨髓干细胞，因为前者更易获取，但成骨或成软骨能力较弱，因此有必要借助CRISPR/Cas9技术。在该系统中，由于靶向基因数量较多，研究人员通过三种杆状病毒递送CRISPR组件[
138]。
在CRISPRa和CRISPRi系统中，激活或抑制效率均取决于局部染色质结构及可及性，这直接影响dCas9接近内源性目标基因的能力，这提示在确定靶向基因时，需重点考虑这一因素[
139]。此外，上述所有研究中，必须筛选与dCas9融合的不同或额外转录激活因子、抑制因子的作用效果，以及验证CRISPRi替代切割系统（如Cas13a、Cas13b和Cas13d）的应用成效[
140‒
141]。最后，正如部分研究指出，除转录激活因子和抑制因子外，加入表观遗传及染色质重塑剂也大有益处，这对难以靶向的基因而言尤为重要[
138]。
4.2.3.2. 其他再生与修复应用。除了将编辑后的干细胞移植到需要骨修复的患者体内，这项技术还被用于重建许多其他受损和退化的组织。
在角膜内皮疾病治疗方面，由于野生型人角膜内皮细胞（hCEC）无法再生，研究人员应用CRISPRa逆转其退化特征[
142]。研究中，激活
Sox2最终促进了人角膜内皮细胞的伤口愈合和再生[
142]。具体而言，研究人员在角膜损伤前两天，结合电穿孔技术向前房局部注射质粒[
142]。在损伤前注射编辑后的细胞，这在许多基因工程再生医学应用中并不常见，但鉴于其预防潜力，应在其他疾病中继续开展研究。
此外，前文提及的杂交杆状病毒系统研发者利用该技术，通过基于SAM的CRISPRa在ASC中激活了三个神经营养因子基因（
Bdnf、
Gdnf和
Ngf）[
143]。当将其递送至体内坐骨神经损伤部位时，实验动物表现出功能恢复、神经再支配、轴突再生及髓鞘再生[
143]。此外，该系统实现了长期的治疗性表达，即基因激活状态至少持续21天，这得益于杂交杆状病毒特有的Cre/loxP重组酶系统[
143]。尽管这项研究取得了成功，但递送编码单一神经营养因子的互补DNA，其表达水平高于CRISPRa系统。尽管如此，CRISPRa仍具备可编程性和多靶点调控能力，而这正是传统基因治疗所缺乏的[
143]。
CRISPR技术已不仅限于编辑干细胞和祖细胞，还扩展到了成熟细胞，以应对Ⅱ型糖尿病和肥胖相关疾病[
144]。这些经过编辑的细胞在移植后展现出血管化能力，这是组织工程和体内构建中的关键环节。将编辑后的干细胞和祖细胞纳入相应研究，可助力其实现持久、潜在治愈效果。
4.3 基因编辑预防移植后免疫反应
只有当研究人员考虑采用规避免疫排斥和移植物抗宿主病（GVHD）的移植策略时，iPSC或工程化组织构建体的全部转化潜力才能得以实现。此外，要开发“现成可用”或具有普遍兼容性的疗法，唯一途径是识别并避免免疫不匹配问题。研究iPSC的免疫原性尤为重要，因为已知其后代细胞在分化过程中，免疫原性会增强[
145]。当前组织工程策略致力于开发新型免疫调节生物材料，以减轻移植毒性、提升长期耐久性，并促进有利于再生的免疫微环境[
146]。另一方面，近期多项研究依赖CRISPR敲除技术来规避移植后排斥反应。我们推测，CRISPR编辑所具备的多靶点、患者特异性和长期稳定的修改作用，与作为编辑细胞载体的免疫调节生物材料相结合，将具有较高的成功率。
除组织工程和再生医学领域外，已有大量研究针对该主题在免疫疗法中的应用。例如，尽管工程化T细胞在癌症免疫疗法中取得了成功，但因供体-宿主配型不合会引发同种异基因免疫反应，这些细胞的移植仍面临挑战[
147]。因此，可以借鉴免疫疗法中的研究成果。在再生医学领域，CRISPR医药公司正积极使用体外基因编辑技术，保护移植的β细胞免受患者免疫系统的攻击，以用于糖尿病治疗。
每个人的免疫系统都存在显著差异，这取决于年龄、性别、感染史或疾病史、遗传特质以及环境因素等[
148]。因此，组织工程产品在不同患者中的修复效果存在差异。本节将围绕这一观点展开，具体从“免疫系统是一种拮抗剂，需要规避其影响”这一角度进行探讨。尽管如此，免疫系统在组织修复中也具有积极作用。例如，B细胞通过释放炎性细胞因子促进皮肤伤口闭合[
149]，而CD161
+调节性T细胞可加速伤口愈合[
150]。为充分发挥组织工程产品的潜力，可利用CRISPR技术同时实现两个目标，一是规避移植物引发的有害免疫反应，二是增强患者自身的宿主免疫系统以促进组织修复，两种策略均考虑了患者独特的免疫状态。
4.3.1 人类白细胞抗原配型
移植T细胞引发的同种异体免疫反应，很大程度上源于供体与受体之间的人类白细胞抗原（HLA）不匹配，因此需要对HLA基因组进行编辑[
147,
151]。这一原理同样适用于再生医学，具体表现为HLA配型或HLA编辑。HLA分为HLA Ⅰ类和HLA Ⅱ类，分别对应主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类和Ⅱ类，其功能是向T细胞呈递抗原，进而促使T细胞杀死靶细胞。研究表明，孕期母体血液与胎儿组织之间的合体滋养层细胞具有MHC Ⅰ类和Ⅱ类低表达、CD47高表达的特征，这可能是母体免疫系统能够保护含有父系遗传抗原的胎儿细胞的原因[
152]。归根结底，HLA表型使免疫系统能够区分“自身”和“非自身”细胞[
145]。显然，HLA配型匹配是移植成功的必要条件。然而，由于基因类型存在遗传变异，配型难度极大，成本也很高。例如，兄弟姐妹之间HLA完全匹配的概率仅为25% [
153]。此外，尽管HLA匹配的造血干细胞移植已开发用于SCD治疗，但仅14%~20%的患者有HLA匹配的供体[
88]。
为减轻HLA引发的移植物排斥反应，研究人员尝试通过构建HLA纯合的iPSC细胞库来实现HLA表型匹配。为此，他们利用CRISPR技术，从纯合
HLA-A、杂合
HLA-B的iPSC中敲除杂合的
HLA-B基因，随后得到细胞系的免疫原性低于野生型细胞系[
153]。尽管取得了这一成果，但目前尚未有证据表明，构建HLA纯合表型足以在同种异体移植中保护细胞。此外，其他研究显示，改变HLA表型会影响自然杀伤（NK）细胞的反应，这一点在许多研究中被忽视，但对同种异体移植的成功至关重要。再者，这种构建纯合iPSC细胞库的尝试依赖于使用传统Cas9核酸酶的CRISPR敲除技术，该技术会产生许多带有不同indels变异的克隆，最终仅一个克隆在核糖核酸和蛋白质水平上均产生了预期反应，表明其效率较低[
153]。另一项研究也观察到类似的现象，即HLA敲除的成功率较低，共产生40个克隆，但仅3个具有预期功能且无意外突变[
151]。
尽管部分研究已证实HLA表型匹配是可行的，但许多研究发现，仅靠HLA匹配并不足以规避免疫排斥。其中一项研究在猕猴中使用MHC匹配表型的iPSC，在使用和不使用免疫抑制剂的情况下，将其诱导分化为心肌细胞以治疗终末期心力衰竭[
154]。结果显示，与使用免疫抑制剂的对照组相比，未使用任何免疫抑制剂、经皮下移植的MHC匹配的iPSC增强了NK细胞的激活[
154]。另一项研究在亨廷顿病的神经移植中使用了匹配的单倍型HLA，也得到了类似结果[
155]。这些研究共同表明，HLA匹配必须辅以免疫抑制手段，才能实现移植物的长期存活并保证其疗效。
为减轻仅匹配HLA带来的上述问题，研究人员尝试进行额外的HLA基因敲除。在一项研究中，研究人员从iPSC中敲除了
HLA-A、
HLA-B 和
HLA-
II（但保留了对预防NK细胞反应至关重要的
HLA-C）[
156‒
157]。这种策略不仅能充分构建免疫相容性细胞，还能减少构建全面的单倍型库所需iPSC克隆的数量，从而适配许多受体。然而，若宿主的
HLA-C为杂合型，而供体的
HLA-C为纯合型，考虑到
HLA-C的高度多态性，很可能发生因缺乏NK细胞抑制信号而引发免疫反应[
145,
156]。在另一项研究中，研究人员通过分别靶向
B2M基因和
CIITA基因，敲除了
HLA-I和
HLA-II，成功构建出可规避T细胞和NK细胞识别的iPSC [
158]。该研究还通过敲除
PVR并转导
HLA-E来抑制NK细胞反应，这得益于CRISPR的多靶点调控能力[
158]。值得注意的是，这项研究及其他多项研究中敲除的
CIITA基因，不仅会导致
HLA-II基因敲除，还会影响其他免疫相关基因，这可能引发多种副作用[
151]。与之相似，另一项研究敲除了
MHC I、
MHC II并过表达
CD47，以生成功能完整且低免疫原性的iPSC [
152]。这些干细胞分化出的内皮细胞（EC）、平滑肌细胞和心肌细胞，在完全MHC不匹配的受体中均能规避免疫排斥，且无需使用免疫抑制剂即可长期存活[
152]。还有一项研究在HLA纯合的iPSC中敲除了
HLA-A、
HLA-B和
HLA-II [
151]。选择纯合iPSC是因为其可通过单个sgRNA实现双等位基因敲除，操作更简单；而使用更多sgRNA会增加脱靶编辑和诱发基因突变的可能性[
151]。该研究揭示了HLA编辑的一大核心挑战，即由于HLA基因在人群和等位基因间存在高度变异，设计能同时靶向HLA基因两个等位基因的合适sgRNA难度极大[
145,
151]。
再生医学应用中值得注意的是，HLA基因的脱靶编辑会产生诸多影响，包括对细胞分化潜能的作用。在
HLA-A和
HLA-B之间序列存在大片段缺失的iPSC，丧失了分化为心肌细胞的能力，原因在于
POU5F1基因（又称
OCT3/4）缺失，它在体细胞重编程中发挥重要作用[
151]。未来的研究应致力于提高编辑的精准度，以减轻这些不良后果。
4.3.2 抑制自然杀伤细胞反应
已知修改细胞的HLA表型会引发NK细胞的细胞毒性[
158]。例如，某些
HLA-I类标记物的表达可作为NK细胞的抑制性配体，使得这些杀伤细胞将iPSC识别为“自身”[
154,
158]。因此，完全沉默
HLA-I虽可能会抑制细胞毒性CD8
+ T细胞，但会激活NK细胞，这就需要额外的基因组修改来抵消这种效应。这种现象被称为“缺失自我理论”，且已知会引发免疫排斥[
145,
152]。
为开发免疫抑制剂抑制NK细胞毒性的替代方案，研究人员尝试了另一种基因编辑策略，即用孕期已知具有免疫抑制特性的蛋白质。一项研究通过慢病毒基因疗法上调CD47的表达，因为CD47在合体滋养层细胞中高表达（暗示其固有的免疫抑制作用），且已被证实能阻止NK细胞释放干扰素-γ（IFN-γ）[
152]。这些敲除了
MHC-I和
MHC-II（分别通过敲除
B2M和
CIITA进行）并上调
CD47的细胞，在人源化小鼠模型中实现了长期存活[
152]。此外，有研究通过表达MHC配体（如
MHC-E和
MHC-G）来抑制NK细胞对hPSC的细胞毒性[
159‒
160]。其中一项研究利用慢病毒基因疗法递送单链
HLA-E（
scHLA-E），借助了其对NK细胞的抑制特性。但由于
HLA-E仅为NKG2A
+ NK细胞的配体，而该受体仅存在于健康个体中50%的NK细胞亚群上，研究人员还需通过CRISPR敲除
PVR，以抑制NKG2A
- NK细胞的细胞毒性[
158]。尽管该策略有效，但它需要进行多次基因组修饰，这增加了潜在的误差来源。另一项研究有效地运用了CRISPR技术，将
HLA-G双等位基因敲入人多能干细胞的
B2M基因座中[
161]。前文提及的多项研究为降低免疫原性，敲除了所有
HLA-I类基因的整个
B2M序列编码[
147,
152,
158]。然而，考虑到部分
HLA-I类基因在抑制NK细胞毒性方面的作用，如Kitano等[
151]研究所示，选择性敲除
HLA-I类基因可能更为有利。
上述研究提及在人类祖细胞中进行HLA基因敲除，并发现基于“缺失自我现象”，HLA敲除会增强NK细胞的细胞毒性。另一项研究则使用CRISPR技术对定向分化为EC的定向祖细胞进行HLA敲除，尽管这些细胞同样存在
B2M和
CIITA基因敲除，但并未引发NK细胞的免疫原性反应，这似乎与“缺失自我现象”矛盾[
162]。此外，当移植物被移植时，这些内皮细胞仍保留了血管生成潜能。这些结果与NK细胞对血管化组织和实体器官同种异体移植物的细胞毒性反应需要额外信号才能触发的事实一致。因此，尽管具体机制尚不明确，但已知NK细胞会杀伤缺乏HLA的造血移植物，却不会攻击组织移植物[
162]。正如这项研究所表明的，使用定向祖细胞在免疫原性方面具有优势，且与多能干细胞不同，使用定向祖细胞不太可能形成畸胎瘤，但同时也丧失了分化为多种细胞类型的能力。
已有少数案例表明CRISPR技术可用于再生医学领域，专门规避免疫反应。例如，在一项针对慢性肢体缺血（CLI）的研究中，研究人员通过敲除iPSC的
HLA I/II类基因并上调
CD47，将其分化为工程化EC后移植至体内。这些细胞不仅存活并增殖，还改善了肢体灌注，并降低了肢体并发症的发生率[
147]。此外，这些经过基因编辑的iPSC在冷冻损伤诱发的心肌梗死模型中也得到了验证，移植后，心脏收缩功能、左心室每搏输出量、每搏作功及心排血量均有所改善[
147]。这为同种异体疗法带来了希望，因为迄今为止，用于慢性肢体缺血的细胞治疗临床试验仅使用患者自体来源的的细胞[
163]。
关于HLA缺陷移植物，一个值得关注的问题是其长期非免疫原性风险。然而，一项研究发现，HLA-I缺陷型肿瘤会激活γδ T细胞（而非CD8⁺ T细胞），这使得肿瘤仍易受T细胞的细胞毒性攻击[
164]。这表明，即使存在HLA缺陷，其他免疫细胞之间仍存在相互作用。这既凸显了HLA缺陷型移植物的优势，也暴露了其劣势，同时为可能参与其中的细胞开辟了新的研究方向。尽管如此，HLA缺陷仍是一个值得关注的问题，且与裸淋巴细胞综合征（BLS）相关联[
145]。
本节回顾了预防移植物移植后免疫反应的策略。
表1 [
147,
151‒
153,
156‒
158,
161‒
162]总结了多种策略及其局限性。尽管这些策略总体表现成功，但移植手术本身就会通过吸引中性粒细胞和巨噬细胞至移植部位而引发免疫反应，而现有研究尚未深入探讨这一现象[
145]。我们认为，对这些先天性免疫细胞进行原位基因编辑可抑制此类强烈反应，或可通过携带编辑细胞的免疫调节生物材料来减轻这种影响。此外，全基因组测序（WGS）或外显子组测序等先进技术，既能帮助研究人员为受体匹配兼容性最高的供体细胞，又能指导确定哪些HLA编辑可进一步提升相容性[
145]。最后，为降低多靶点基因编辑的脱靶风险，已有研究开始采用以精准著称的碱基编辑器对
B2M进行修改，从而降低嵌合抗原受体（CAR）-T细胞的免疫原性[
165]。
4.3.3 器官异种移植
对于多数重症病例，可能需要进行器官移植而非移植分化细胞。只有借助CRISPR/Cas9编辑技术，器官异种移植的全部潜力才能得以发挥。鉴于猪器官移植可能在数分钟内引发免疫排斥，CRISPR/Cas9技术为敲除已知会引发免疫反应的基因，或整合调控免疫及凝血功能的基因开辟了道路[
166‒
167]。该领域已在敲除α-1,3-半乳糖和猪内源性逆转录病毒方面取得一定成功，但在器官异种移植应用于患者之前，仍有大量研究空间[
168]。
4.4 用于调控蛋白质剂量的基因编辑技术
前文探讨了利用CRISPRa和CRISPRi技术通过促进或抑制基因表达来引导细胞分化。虽然该技术在某些组织修复应用中显示出良好效果，但在其他应用中则需要更精确的调控，这同样可通过其他CRISPR技术实现。例如，在炎症或剂量相关性疾病等特定应用中，要实现有效的组织修复（而非仅仅引导细胞向特定谱系分化），就需要对蛋白质剂量进行精确控制。本节将重点综述蛋白质剂量调控技术及其在组织修复中的应用。
4.4.1 炎症诱导的组织降解
炎症虽然在初步抵御感染和损伤方面具有积极作用，但它所营造的环境却极易导致组织降解，且不利于组织的完全修复。例如，肌肉或深层皮肤损伤引发的炎症会导致纤维化瘢痕形成，这在一定程度上是由炎性细胞因子驱动的，此类细胞因子会促进纤维瘢痕组织生成，从而阻碍组织的完全再生与修复[
169‒
171]。另一个例子是，肝脏微环境（niche）中的生态位细胞（如肝星状细胞，HSC）在肝细胞受损时会被激活，转化为肌成纤维细胞，并进一步加剧纤维化级联反应[
172]。此外，关节炎、自身免疫性疾病等慢性疾病的特征之一是促炎细胞因子水平升高，这会加速组织分解代谢，并破坏内源性干细胞微环境[
173‒
175]。因此，如何在损伤诱发的炎症反应中实现组织的完全再生，成为当前面临的挑战。为减轻这些炎症反应，许多研究者已开展相关研究，如使用抗炎分子（如针对肌肉纤维化[
176]和肝纤维化[
177]的抗纤维化药物）或抗细胞因子疗法[
178‒
179]。总体而言，这些分子疗法能有效抵消促炎细胞因子的负面作用，改善组织修复并减少瘢痕形成。然而，鉴于促炎细胞因子（特别是其在组织稳态维持中）的多效性作用，完全抑制这些细胞因子反而会损害组织修复过程。例如，正常生理水平的转化生长因子（TGF）-β1对组织再生、重塑及损伤后的上皮再生至关重要[
180‒
181]。而白细胞介素（IL）-1α已被证实可通过激活和促进细胞增殖来调控干细胞微环境[
171,
182‒
183]。这些分子的多效性提示，开发一种具有环境感知能力的时序性抗炎生物制剂递送系统具有重要意义，该系统能够调控这些蛋白质的存在及其持续时间。因此，我们既可以通过招募干细胞进行增殖和分化，也可以通过减轻不良炎症反应，来有效实现组织再生。
鉴于干细胞在再生医学中所发挥的直接作用，解决损伤性炎症所致组织降解的关键在于激活损伤微环境中的干细胞。这些细胞具有分化为多种组织特异性细胞类型的能力。尽管干细胞疗法在再生医学中已取得成效，但在炎症微环境中移植干细胞的效果仍然有限。例如，在TGF-β水平升高的肌肉损伤环境中，注入的肌源性干细胞（MDSC）会分化为成纤维细胞，这限制了干细胞的再生潜能[
184‒
185]。虽然通过调整干细胞注射时机（损伤后的炎症程度会随时间变化）可部分缓解这种不利影响[
185]，但CRISPR/Cas9敲入技术能为增强干细胞在炎症环境中的再生能力提供更精准的调控。
为增强内源性细胞的再生潜力并防止其分化为成纤维细胞（该过程会加剧纤维化级联反应），研究人员已利用CRISPRa/CRISPRi技术通过激活或抑制基因来引导细胞向理想方向分化。例如，有研究将使用CRISPR激活技术封装的外泌体递送至肝星状细胞，以促进其分化为肝细胞[
186]。虽然该策略显著减轻了肝纤维化，但未能针对纤维化的根本诱因之一（炎症细胞因子）发挥作用。
通过HDR介导的敲入技术，研究人员对MDSC和iPSC进行了编辑，前者可响应TGF-β1介导的炎症[
187]，后者能响应肿瘤坏死因子（TNF）-α和IL-1介导的炎症[
188]，并可动态且剂量依赖性地产生针对这些细胞因子的生物拮抗剂。这些干细胞如同闭环系统，仅在炎症环境刺激下才会释放拮抗剂。两项研究均特意选择sgRNAs的目标启动子，因其会被炎症细胞因子刺激并差异表达。研究采用脂质体转染试剂在体外转染Cas9质粒、sgRNA及细胞因子拮抗剂转基因并导入细胞。尽管这种CRISPR/Cas9递送方法能满足体外研究需求，但脂质体试剂具有毒性，会降低细胞活力，因此不适合转化研究[
189]。尽管如此，在这项研究中，经基因编辑的MDSC被移植到 TGF-β1促炎因子水平升高的简化肌肉损伤微环境后，其向纤维化谱系的分化减少，有效减轻了损伤后的纤维化级联反应[
187]。尽管研究未检测这些细胞分化为功能性肌细胞的能力，也未在具有时间依赖性炎症反应和多种纤维化刺激的复杂肌肉损伤环境中进行测试，但它仍展现了组织有望在损伤诱发的炎症环境中再生的前景[
187]。在另一项针对TNF-α和IL-1介导的炎症的类似研究中，经工程化改造的iPSC分化为软骨细胞后，能有效减轻炎症反应，降低降解酶的表达；特别是经TNF-α拮抗剂编辑的细胞，对细胞因子诱导的关节软骨降解具有抵抗性[
188]。而表达IL-1拮抗剂的经编辑的iPSC，在IL-1水平升高的环境中无法充分保护关节软骨，因为这种工程化组织的ECM成分表达会受到抑制[
188]。这表明，炎症环境中多种细胞因子的作用存在差异，且实现功能性再生所需的拮抗剂剂量也不同。此外，这些研究中的另一个重要因素是准确确定细胞因子所刺激的基因位点。下一代基因测序（NGS）可用于验证细胞因子对特定基因位点的刺激作用。为利用CRISPR/Cas9的多靶点潜力，我们可通过多靶点HDR在多个差异表达基因位点整合针对多种细胞因子的拮抗剂[
190]。与传统慢病毒基因递送相比，这些研究中使用CRISPR/Cas9能实现剂量精准调控，并构建受调控的闭环反馈系统。
4.4.2 剂量相关疾病中的其他应用
在另一项调控蛋白质表达水平的研究中，研究人员采用CRISPR敲入技术，在内源基因参与细胞分化前整合了小分子辅助关闭（SMASh）系统[
191]。SMASh系统受NS3蛋白酶抑制剂的剂量依赖性调控，这意味着目标蛋白质的浓度可通过NS3蛋白酶抑制剂的浓度来调节[
191]。这一系统使我们能够研究内源性蛋白质在细胞分化中的剂量依赖性作用，这对剂量相关性疾病（如影响神经发育的FOXG1综合征），以及通过调控分化来构建组织结构而言至关重要。SMASh介导的蛋白质浓度调控还可用于疾病建模[
191]，并在治疗中精准清除导致组织退化的蛋白质（如具有多效性的炎症分子）。然而，与HDR介导的细胞因子拮抗剂敲入策略相比，SMASh介导的蛋白质浓度调控方法的优势较弱，因为它依赖外源性分子（蛋白酶抑制剂），缺乏闭环递送机制。
5 基因编辑作为再生医学中的研究工具
除了应用于再生医学中的基因编辑的治疗，许多研究还将CRISPR技术用作筛选基因和构建疾病模型的研究工具，而这正是治疗应用的前提。CRISPR技术的精准性使研究人员能够从根本上理解靶基因、细胞及疾病，从而为转化研究提供指导。
5.1 基因筛选
CRISPR技术已被用于基因筛选，尤其是筛选再生医学应用中与细胞分化相关的基因。研究人员分别利用CRISPR敲入和敲除技术进行功能获得性研究和功能缺失性研究。此外，研究人员还通过敲入荧光标记物或表位标签开展研究。这些应用揭示了转录因子及其他蛋白质在驱动细胞定向分化中的生物学作用，而这些可作为治疗靶点的关键基因。此类研究阐明了许多基因在再生通路、疾病进展过程及其他多种生物学过程中的功能。
5.1.1 功能缺失与功能获得研究
如4.2节所述，许多研究依赖CRISPRa/CRISPRi诱导干细胞向特定细胞谱系分化。这类应用的成功取决于对激活或抑制哪些转录因子的准确认知。本节将阐述CRISPR技术在深入理解细胞分化过程中基因功能中的应用，尤其聚焦于使用CRISPR开展功能缺失或功能获得筛选研究。以往的方法依赖慢病毒转录因子递送的系统性试错（技术难度大），或通过比较干细胞与成熟细胞的表达谱（失败率高且难以解读）[
图5（a）]；而CRISPR技术凭借其多靶点编辑能力，不仅有助于精确解析基因的功能，还能说明同一信号通路中多个基因之间的关联。
许多研究探索了转录因子介导的干细胞向成熟细胞的分化过程。为维持正常的成骨，以及牙齿、神经嵴等其他器官的发育，同源盒转录因子Msh同源盒1（MSX1）的表达水平必须得到严格调控[
192]。泛素连接酶通过向蛋白质添加泛素分子使其易于降解，而去泛素化酶（DUB）则从蛋白质上移除泛素分子，这表明蛋白质的调控受泛素化与去泛素化活动的影响。MSX1以及泛素化/去泛素化过程的平衡在干细胞分化和发育中均发挥重要作用，但其分子机制尚未完全明确。为探究干细胞分化过程中影响MSX1蛋白调控的因素，研究人员将注意力投向了去泛素化酶的功能缺失研究[
193]。通过全基因组去泛素化酶CRISPR敲除，研究人员阐明了哪些去泛素化酶通过调控MSX1的表达促进hMSC的成骨分化，以及其作用机制[
193]。这类研究为筛选具有潜在调控作用的去泛素化酶及相应转录因子提供了重要依据，这些未来可通过CRISPRa和CRISPRi技术用于工程化组织构建体。在另一项全基因组CRISPR筛选研究中，研究人员使用CRISPRa同时激活多个内源性靶点，用来构建遗传相互作用图谱，最终明确了参与神经细胞重编程的关键因子[
194]，如
图5（b）所示。类似地，另一项研究中，研究人员在分化的iPSC中应用CRISPRi技术，阐明了对神经元存活至关重要的基因，以及基因敲低对神经元形态的影响[
136]。其他许多功能缺失研究还探索了基因在器官发育、形态发生调控、细胞命运决定、细胞间通信及细胞黏附中的关键作用，这些均对再生医学具有重要意义[
195]。此外，还有研究利用CRISPR技术探究了对学习及其他脑功能等生物学过程至关重要的基因的调控作用[
196‒
197]。在所有这些应用中，值得强调的是，在功能缺失研究中，CRISPR技术相较于RNAi等其他方法具有显著优势。
除利用CRISPR技术揭示特定基因的功能外，该技术还可用于研究尚未明确的突变所产生的影响。例如，STAT3
K39R突变此前被认为与免疫系统相关，但一项研究阐明了该突变在胰腺分化失调中的作用，它会导致胰腺发育不全[
198]。此外，CRISPR技术能在排除任何遗传干扰的前提下揭示突变的效果。例如，大多数研究通过比较健康组与患者组来探究突变的影响，但为了精准理解突变特异性表型并排除遗传差异的干扰，纳入经基因校正的患者组至关重要，而这一点可通过CRISPR技术有效实现。最后，凭借其多靶点编辑特性，CRISPR技术促进了对多基因神经障碍的理解[
196]。
5.1.2 荧光谱系示踪
研究人员还利用CRISPR敲入技术整合荧光标记物或表位标签，以进一步理解尤其是在再生医学背景下基因的功能[
图5（b）]。这些系统是极具价值的工具，它们可以实现实时观察基因表达动态、追踪细胞谱系、分离特定细胞群，同时也有助于体内移植时进行识别。
为深入理解视神经损伤导致的轴突损伤和视网膜神经节细胞（RGC）死亡背后的机制，研究人员创建了经CRISPR工程化改造的荧光报告干细胞系[
199]。这些细胞在内源性
Brn3b ORF中通过CRISPR敲入了mCherry荧光蛋白基因，随后分化为视网膜神经节细胞，并利用荧光激活信号分选技术纯化细胞[
199]。这种策略对难以分化的细胞尤为适用。类似地，为探究
Wnt4表达是否足以诱导干细胞和祖细胞向β细胞成熟分化，研究人员通过CRISPR敲入技术，在胰岛素启动子前插入GFP序列[
200]。需要重点考虑敲入的基因位点，因为某些位点易出现蛋白质瞬时表达，这意味着在分化过程中荧光蛋白的表达可能会消失[
201]。AAVS1基因座是少数能实现转基因稳定且长期表达的位点之一[
201]。
荧光标记通常位于重要的成熟细胞标志物或转录因子的ORF中。荧光标记可在翻译后与目标蛋白融合，这一特性有助于研究蛋白质的细胞内定位、蛋白质动力学、蛋白质动态变化以及蛋白质间相互作用[
202]。然而，融合的荧光报告基因可能会影响目标蛋白的功能。为减轻这种影响，可添加自剪切多肽，这可以使荧光标签和目标蛋白在翻译过程中各自独立，避免二者发生融合。
5.2 疾病模型的构建
药物从研发到上市过程复杂，其中依赖动物实验所带来的挑战尤为突出。关键问题在于人类与实验动物之间存在生理和遗传上的巨大差异，这种差异可能导致药物在体内的作用方式出现显著不同，有时会使动物实验的结果应用于人类时产生误导[
203]。在动物身上显示出疗效和安全性的药物，面对复杂的人类生物学特性时可能会失效，因为动物模型无法完全反映人类的多样性，包括性别、年龄、种族和疾病状态等因素[
图5（c）]。除了科学层面的局限性，动物研究的伦理问题也备受争议。对动物福利的关注以及让动物接受实验性治疗所涉及的道德争议，促使人们越来越多地呼吁采用替代研究方法。
为推动更符合伦理且更有效的药物研发，科学界正转向先进的替代方法，如器官芯片、类器官、计算建模和基于人类细胞的检测等[
204]。与动物模型相比，这些创新技术能更贴切地揭示人类生理与疾病的特征，从而提高药物发现过程的效率和准确性。基因编辑技术进一步助力了这一转变，它使用包括患者来源的iPSC构建组织和类器官[
图5（d）]。这种方法不仅规避了动物实验相关的伦理问题，还引领我们迈向一个个性化再生医学惠及大众且切实有效的未来，标志着人类在疾病治疗与认知能力上的重大进步。
器官芯片模型是一种体外微流控装置，内部衬有细胞并通过相关生理流体灌注，旨在模拟器官的复杂性，在某些情况下还能模拟器官之间的相互作用[
205]。这些模型用于疾病研究、药物研发和推动个性化医疗。研究人员已构建出心脏、肝脏、骨骼、大脑及血脑屏障等模型。例如，他们成功建模了阿尔茨海默病、乙型肝炎病毒感染，以及关节置换植入物中溶解金属的释放过程[
206‒
208]。将基因编辑技术与这些模型相结合，研究人员能够开发个性化模型，这对于理解每位患者的疾病病理和治疗方案至关重要。
表2 [
209‒
215]重点列举了成功的器官芯片和类器官模型，以及如何利用CRISPR/Cas9技术进行疾病建模和治疗评估。这些模型是加速再生医学领域发展的宝贵工具。
5.2.1 类器官模型
iPSC衍生类器官的过程包括将体细胞重编程为iPSC，随后在三维环境中培养，并暴露于特定的生长因子和信号分子中。这些因子和分子调控严格受控的分化过程，最终形成能重现人体器官结构和功能特征的类器官。类器官的发育因模拟器官的不同而存在差异，一些器官的类器官（如肠道类器官）可在数天内形成，而大脑这样的复杂器官，其类器官可能需要数月才能成熟[
216]。
要充分发挥类器官技术的潜力，仍需克服诸多重大障碍。其中一个挑战是在类器官发育过程中实现精确的时空调控。精准调控生长因子和信号分子的作用，对于引导干细胞分化为理想的细胞类型、重现真实器官的复杂结构至关重要。研究人员正积极研发生物工程策略以实现这种时空调控[
217]。例如，微流控装置可实现对类器官的营养物质、生长因子和信号分子的可控递送，从而能随时间精确调控类器官的微环境。这种方法可构建生化梯度，模拟器官自然发育过程中的调控线索[
218]。另一种方法则利用三维生物打印技术，该技术能按特定空间排布沉积细胞和生物材料，从而构建结构有序、更接近天然组织架构的类器官[
219‒
222]。光图案化和光遗传学等技术通过光激活或抑制特定细胞通路，实现对细胞行为的动态调控。这些方法可在类器官内对细胞分化和组织排列进行时空精准调控[
223]。还有一种方法是磁力操控技术，通过施加磁场来操控嵌入磁性纳米颗粒的细胞或生物材料，实现类器官的无创组装和分布。该方法无需物理接触即可将细胞在空间上组织成复杂结构[
224‒
225]。利用基因编辑技术引入特定突变或致病基因，是类器官的一大显著优势。此外，基因编辑还能实现反向操作，修正已有的致病突变，再研究编辑后类器官的变化[
图5（d）]。这样，研究人员能比传统动物模型更精准地模拟人类疾病。患者来源类器官（PDOs）进一步强化了这一优势，可用于研究个性化疾病机制及个体对潜在疗法的反应[
图5（d）]。下文将探讨视网膜、脑、肺和卵巢类器官的研究进展，以及基因编辑在推动这些模型发展中的应用前景。
5.2.1.1. 视网膜。类器官为深入了解眼部疾病的病理生理学机制提供了全新的思路和方法，尤其是考虑到视网膜疾病的发病率日益攀升，而啮齿类动物模型在重现人类眼部生理特征方面存在局限性。视网膜易受青光眼、X连锁青少年视网膜劈裂症（XLRS）、视网膜色素变性等退行性疾病的影响，因其与眼科学及更广泛的神经学研究都密切相关，成为再生医学研究的典型模型[
62,
226]。视网膜类器官（尤其是模拟视网膜色素变性等疾病的模型——通常由单基因常染色体隐性突变引起），简化了CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用体系。这种模型的简洁性有助于在受控环境中探究CRISPR/Cas9的治疗潜力及其递送机制。
视网膜类器官研究进展（尤其在移植治疗领域），为组织工程提供了新的路径。关于整合hPSC来重建视网膜色素上皮（RPE）的研究，凸显了其对地图样萎缩等疾病（会导致感光细胞死亡）的潜在治疗价值[
227]。然而，挑战依然存在，包括类器官缺乏血管系统、RPE细胞层的复杂结构未完全重现、光感受器盘膜脱落而缺失部分组件、与RPE的连接缺失，以及细胞更新不足。这些问题共同阻碍了对视网膜疾病的精准建模。此外，光感受器相互作用的模拟程度较低，且视网膜生物学固有的动态过程限制了疾病模型的保真度以及潜在治疗性移植方案的开发[
226]。
尽管存在上述障碍，视网膜类器官仍成功模拟了关键的发育现象，包括细胞组织排列和光感受器形态发生，同时还揭示了潜在的治疗靶点。例如，研究阐明
RPGR突变在X连锁视网膜色素变性中的作用，发现RPGR与凝溶胶蛋白之间的致病性相互作用会促进肌动蛋白聚合[
228]。这一过程可被特定药物抑制，而类器官则成为验证这一机制的平台。然而，在体外重现体内细胞间的复杂相互作用仍是一项艰巨挑战，尤其是考虑到视网膜与大脑功能之间存在关键的相互作用。这种复杂性让开发整合视网膜类器官与脑类器官的共培养系统成为必要，但此类系统存在类器官特征的变异性，且需要大量维护。
5.2.1.2. 脑。人类脑的发育是分子与细胞过程的复杂协同，这些过程通过精密的机制逐步演化，形成大脑复杂的结构与功能。这种发育由遗传蓝图主导，并在不同时空尺度受环境因素影响，涉及细胞周期、细胞间相互作用及形态发生素梯度等多个方面。理解健康和疾病相关的大脑发育结构与机制至关重要，但动物模型中存在的物种特异性差异，以及发育中的人类脑组织难以获取等挑战限制了我们的认知。过去十年间，脑的类器官应运而生，为模拟发育中脑的细胞组成和结构提供了模型[
229‒
231]。
脑类器官的构建方法分为非引导式和引导式两种。两种方法均始于由iPSC形成胚状体（EB）。非引导式方法依赖特定培养条件下的细胞自组织能力，生成具有多种脑区特征的类器官。而引导式方法则通过添加模式化因子，定向引导形成特定脑区的类器官，如前脑或小脑的类器官。这些类器官在细胞多样性、结构和发育轨迹上接近发育中的人类脑，转录组分析显示其与胎儿脑甚至出生后发育阶段的脑存在相似性。
脑的类器官已被用于模拟多种神经系统疾病，包括神经退行性疾病、自闭症谱系障碍（ASD）和无脑回畸形等神经发育障碍[
232‒
234]、雷特综合征和米勒-迪克尔综合征[
235‒
236]、精神分裂症[
237]、病毒感染[
238‒
240]以及环境暴露相关疾病[
241]。一项研究发现，CRISPR/Cas9技术可修正来自携带
HEXB基因突变的iPSC的脑类器，该突变与Sandhoff病（一种神经退行性疾病）相关[
211,
242]。然而，利用这些模型解析疾病机制时，一个主要挑战是滤除个体间的遗传变异（常被称为“背景噪声”）。传统意义上，减少这种噪声依赖于增加样本量，这会显著提高成本和工作量。而使用基因编辑的hPSC来构建类器官，是解决这一问题的可行方案之一。
另一种解决方案源于人类脑嵌合体技术的发展[
243]。该技术无需从每位患者的iPSC中单独构建患病的类器官，而是通过将来自多个单一供体类器官的神经干细胞或定向祖细胞重新聚集，共同培育出成熟的类器官。这些嵌合体能有效捕捉供体对环境毒素的特异性反应，为跨不同个体的遗传或神经毒性效应的高通量评估提供了可扩展的平台。
5.2.1.3. 肺。由于呼吸系统疾病的特性，在相关模型中观察宿主与病原体的相互作用及感染进展至关重要。研究人员已利用肺泡的类器官对肺纤维化、肺结核和流感病毒等进行了研究[
244]。肺的类器官能够重现二维（2D）培养中缺失的分支结构和毛细血管网络。此外，这些疾病模型使研究人员能够筛选抗病毒药物，检测感染率和药物的抗病毒能力。肺的类器官还能模拟巨噬细胞等细胞的免疫应答[
245]。
与视网膜和脑的类器官模型类似，肺的类器官也缺乏足够的血管系统。随着技术的进一步发展，这些类器官将成为药物筛选和毒性研究的宝贵工具，并最终通过PDO为精准医疗提供渠道[
244]。
5.2.1.4. 卵巢。激素变化（包括妊娠、更年期和月经周期）会影响卵巢功能，并具有时间特性。因此，卵巢的类器官在这些研究中具有重要价值。现有研究表明，这些模型可用于识别疾病治疗靶点，包括不孕症、子宫内膜异位症和卵巢癌等[
246]。未来的研究方向将是在卵巢类器官中整合激素分泌功能，构建具有时间动态变化的模型。卵巢类器官还缺乏生殖系统核心的多器官环境，目前，卵巢类器官最成功且可靠的应用是作为肿瘤模型。PDO已被用于筛选化疗药物，以确定最有效的卵巢癌治疗方案。然而，PDO存在个体间差异的问题，意味着研究结果无法广泛适用于所有患者[
247]。不过，通过使用基因编辑干细胞衍生的类器官来控制患者间的遗传差异，该问题得以缓解。除了化疗药物筛选，借助CRISPR技术调控基因表达，类器官还能明确基因型与表型之间的关联。对编辑后的细胞进行全基因组筛选将产生大量数据，从而建立基因与疾病之间的联系[
242]。
基因编辑在视网膜、脑、肺和卵巢类器官中的应用，为构建疾病模型提供了可能，这些模型不仅有助于深入解析疾病的分子机制，还可用于小分子药物和生物制剂的筛选。此外，基因编辑技术还能帮助这些模型克服个体间的遗传差异问题。在再生医学领域，这些模型具有不可估量的价值，为受损和病变组织的再生研究提供了重要框架。然而，要充分发挥其在药物研发和再生医学中的潜力，还需进一步优化类器官模型，以更精准地重现体内复杂的细胞及生理环境。
5.2.2 动物模型
基因编辑工具可应用于动物模型，以模拟疾病并研究治疗方法。既往动物模型已成功模拟了糖尿病、心血管疾病和免疫缺陷等多种疾病[
248]。选择最适宜的物种是该方法的一大挑战，需要在与人类相似的解剖学和生理学特征，以及符合研究需求的现实可行性之间取得平衡。研究中需重点考虑以下因素，包括关注的器官系统、物种的寿命，以及在该物种中进行基因编辑的可行性。啮齿类动物（如小鼠）被广泛用于动物模型，因其易于进行基因工程操作、寿命短且饲养相对简便。然而，没有任何物种能完全与人类等效。啮齿类动物无法稳定重现人类的生理系统和通路，导致药物测试的临床失败率较高。绵羊模型已被应用于多种疾病生理学研究，包括神经系统疾病、心血管疾病和肌肉骨骼疾病。此外，绵羊的妊娠期较长（150天），为研究胎儿再生提供了机会。尽管马模型成本较高，但在肌肉骨骼疾病和损伤的存活研究中具有优势[
249]。然而，大型动物的使用引发了伦理争议，难以获得广泛认可，且对其进行基因编辑和饲养也更为困难。尽管由于动物模型的独特优势，科学研究不太可能完全摒弃动物实验，但开发非动物疾病模型将减少不必要的动物实验。最终，类器官和器官芯片模型有望在成本、多功能性、可控性和可靠性方面取代动物模型。
6 未来工作
自2012年开发出CRISPR技术以来，经过多年发展，它已取得诸多进步，从最初简单的DNA切割拓展至如今的碱基转换、转录调控、核糖核酸编辑及精准敲入等。在第4节和第5节，我们已探讨了这些技术进步在再生医学中的应用，包括其作为治疗手段和多功能研究工具的潜力。尽管如此，要充分实现CRISPR技术在再生医学中的应用，仍有大量工作亟待完成。
图6总结了目前用于解决这些挑战的部分策略。
关于基因编辑的伦理与法律影响，关键考量因素包括编辑的细胞类型、长期后果以及编辑目的。本文所提及的研究均未将生殖细胞编辑用于再生医学应用，这与近期签署的全球暂停令以及再生医学联盟等组织的立场（不赞成当前将生殖细胞编辑用于临床[
250]）一致。这一谨慎态度旨在防范利用现有技术进行生殖细胞突变可能带来的不安全和无效问题，而现有技术仍需进一步改进。对于用于治疗目的的体细胞基因编辑，患者可对此放心，此类干预需获得知情同意，不会导致可遗传的DNA修改，其最终目的是治疗疾病。尽管生殖细胞基因编辑可能通过预防儿童出生时携带严重遗传病而体现优势，但除了已存在的道德和心理顾虑外，其效率和安全性也是关键考量因素。尽管如此，生殖细胞编辑仍是基因编辑领域（包括其在再生医学中的潜在应用）的一个前瞻性方向。
6.1 加强CRISPR递送的时空调控
基因编辑的主要局限性之一在于递送方式，尤其体现在体内环境中。除了电穿孔等特定的体外递送方法外，病毒载体和非病毒载体均存在各自的局限性，这凸显了对具有时空调控能力的CRISPR递送系统的需求。通常，一种递送系统的优势往往是另一种系统的劣势，反之亦然，这限制了体内基因编辑的临床应用机会。
关于空间控制及减少体内脱靶编辑，应开展更多研究以改进聚合物和脂质递送系统。对于包裹基因编辑组件的聚合物或金属纳米颗粒，研究人员可通过偶联组织特异性肽或CPP来增强递送效果[
251]。此外，可利用生物材料与基因编辑的交叉优势，借助对特定刺激有响应的材料或重建目标细胞类型的微环境。例如，研究人员已开发出基于金纳米颗粒的激光控制CRISPR/Cas9递送系统[
252]，或利用近红外响应型纳米载体释放CRISPR/Cas9 [
253]。另一项研究中，研究者使用模拟BM微环境的支架，负载趋化因子和RNP，以吸引并编辑白血病干细胞[
254]。这些应用展示了研究人员利用新型生物材料实现的CRISPR时空调控递送。尽管如此，与病毒载体介导的CRISPR递送相比，生物材料在临床试验中的应用进展仍十分缓慢，这主要归因于其编辑效率较低，尽管部分生物材料的编辑效率已超过商业标准试剂Lipofectamine CRISPRMAX [
255‒
256]。在脂质纳米颗粒介导的递送方面，一项研究表明，在原有四种组分的基础上简单额外添加一种脂质，通过内部电荷调控即可实现对上皮细胞、B细胞、T细胞、肺基底细胞和肝细胞的组织特异性递送[
257‒
258]。然而，脂质纳米颗粒的设计空间广阔，配体偶联、物理性质、化学性质、脂质摩尔比、环境响应性等参数均需优化，因此需要高效的高通量测试方法来筛选大量配方变体。通过利用非病毒生物材料和纳米颗粒增强CRISPR技术的时空控制性，其优势可能会超过编辑效率较低的劣势，从而证明这些载体相比病毒载体更具竞争力。
6.2 优化CRISPR敲入技术
本文涉及的诸多研究均依赖于通过HDR实现外源序列的CRISPR敲入。然而，HDR在作用时机、插入片段大小、供体模板设计及最终效率方面均存在局限。例如，我们在第4.1.1节中讨论过，CF患者的
CFTR基因敲入受限于修复通路本身的低效性。之前的方法通过化学抑制剂使细胞周期同步停滞于S/G2期，然后使用CRISPR技术递送[
259]，但这类方法技术难度高且临床转化性差。研究者已开展研究对供体模板进行改造，包括调整同源臂长度、优化切割位点与修饰位点间距、选用单链或双链供体DNA及引入化学修饰等[
260‒
261]。此外，为了阻断Cas9重复切割，研究人员在供体模板中引入阻断突变，并以RNP代替pDNA递送，来提高HDR效率[
262]。其他包括修复通路调控，即通过瞬时抑制剂阻断NHEJ和微同源介导末端连接（MMEJ）修复通路，促进HDR通路[
263‒
264]。此外，该领域还探索了药物协同策略，利用小分子药物与CRISPR联用的协同效应增加敲入效率[
265]。这些参数调整形成了许多设计规范，必须考虑这些规范才能将HDR效率最大化。未来须努力创建一个参数库进行筛选，并最终整合这些设计限制，以创建可广泛应用的工具。引导编辑可能可以替代HDR介导的编辑。引导编辑的编辑纯度比HDR高得多，可实现多种高精度编辑，且不受靶点附近PAM序列限制[
266]。虽然最初的引导编辑效率不稳定，但经工程化pegRNA等改进后已取得突破性进展[
267]。HDR效率的提升与引导编辑技术的进步共同推动了基因敲入技术的发展，而这正是组织工程与再生医学应用的所需的编辑。
6.3 减少脱靶编辑
脱靶编辑是CRISPR/Cas9技术的一个实际缺陷，且存在严重的安全隐患。目前已开发出多种计算方法（包括计算机模拟工具和深度学习模型）来识别脱靶结合位点（如DISCOVER-Seq+），以及预测sgRNA的效率（如CRISPRon）[
35,
268‒
270]。深度学习模型在该领域的应用正快速发展，但仍存在依赖大量数据才能保证可靠性的问题[
271]。为缓解这一问题，部分研究人员采用迁移学习方法，先在较大的数据集上训练模型，再将其适配到较小的数据集[
272]。
此外，靶基因的可及性（由其染色质环境决定）是影响编辑效率的重要因素。例如，若靶基因位于核小体二分体中而无法被访问，内切核酸酶便无法定位到该靶基因[
273]。一些研究人员在其机器学习模型中引入了特征参数进行工程化优化，以纳入可及性相关因素，从而提高模型的可靠性和性能[
274]。这些特征包括表观遗传状态、染色质可及性、微同源性特征以及DNA形状，其中，引入DNA形状特征经发现可显著提升预测性能[
275‒
276]。总体而言，在机器学习模型中纳入能反映切割位点生物学背景的特征，已成功提升了这些模型的预测能力，而这一做法应被推广以减少脱靶效应。
尽管上述许多解决脱靶效应的方案都涉及计算筛选的方法，但还有其他生物学方法可减少脱靶效应。这既可以通过修改sgRNA和（或）内切核酸酶来实现，也可以通过改用RNP递送而非pDNA来达成（可减少细胞与核酸酶的接触）。sgRNA的鸟嘌呤和胞嘧啶含量占比（GC）、长度、截短情况以及化学修改，均能提高其靶向活性并降低脱靶效应[
33]。近期研究发现，由于R环形成不充分导致Cas9失活，在gRNA间隔区5
'端引入短核苷酸延伸，可有效形成发夹结构，进而降低脱靶效应[
277]。研究人员将这种方法与筛选技术相结合来筛选性能最佳的延伸序列，从而解决了其技术中存在的靶向活性受抑制和脱靶风险增加的问题[
278]。此外，新型Cas9变体通过靶向其他更广泛的PAM，实现了更高的靶向特异性[
279]。要构建一个脱靶效应极低的一体化编辑系统，需要采用联合策略：既利用广泛的计算方法验证sgRNA的靶向性，又通过体外筛选确认模型结果。
6.4 未来其他研究方向
前文提及的未来研究方向并不全面，还需大力增强基因编辑（尤其是再生医学领域）的效能。一项研究[
142]提到在动物模型中诱导受伤前注射经基因编辑的干细胞，我们认为这是基因编辑在再生医学中极具潜力的应用。这类应用大致可归为预防性医疗范畴，可用于增强个体自身的细胞和组织的功能，从而降低未来患病的风险。这在多种单基因或多基因疾病中展现出良好的预防前景，既可用于增强免疫功能低下者的免疫系统，也能在损伤发生前增强个体干细胞的活性及其分化潜能。
7 结论
CRISPR技术是一种多功能的专用基因编辑工具，已被应用于再生医学领域。借助CRISPR技术，我们能修复病变组织及易退化组织，还可筛选基因功能并构建相关疾病模型。多年来，经不断优化的各类CRISPR技术，使CRISPR的独特性和效能均得到提升。本文阐述了现有技术及其局限性，强调未来仍需努力，充分发挥专用、安全、可靠且有效的基因编辑疗法在组织再生中的转化潜力。
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