基于声流控技术的细胞内纳米颗粒递送系统

Zhishang Li ,  Zhenhua Tian ,  Jason N. Belling ,  Joseph T. Rich ,  Haodong Zhu ,  Zhehan Ma ,  Hunter Bachman ,  Liang Shen ,  Yaosi Liang ,  Xiaolin Qi ,  Liv K. Heidenreich ,  Yao Gong ,  Shujie Yang ,  Wenfen Zhang ,  Peiran Zhang ,  Yingchun Fu ,  Yibin Ying ,  Steven J. Jonas ,  Yanbin Li ,  Paul S. Weiss ,  Tony J. Huang

工程（英文） ›› 2025, Vol. 47 ›› Issue (4) : 139 -148.

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工程（英文） ›› 2025, Vol. 47 ›› Issue (4) : 139 -148. DOI: 10.1016/j.eng.2024.11.030
研究论文

基于声流控技术的细胞内纳米颗粒递送系统

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Acoustofluidics-Based Intracellular Nanoparticle Delivery

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摘要

将生物分子物质高效递送入细胞对于靶向治疗药物研发及细胞重编程至关重要。传统递送方法（如纳米载体的内吞作用、显微注射和电穿孔），通常存在摄取过程耗时、操作流程烦琐和（或）专用设备昂贵等问题。因此，本研究提出一种基于声流控技术的细胞内递送系统，可高效地将多种功能性纳米材料递送至不同类型的细胞中（如贴壁癌细胞和悬浮癌细胞）。本方法通过调节玻璃毛细管内的驻声波，利用声辐射力推动流经毛细管的细胞至毛细管壁。声辐射力还会增加膜应力，使细胞轻微变形并增强膜的通透性。此外，通过在毛细管上包覆纳米颗粒涂层，可实现细胞与纳米颗粒之间的可控接触，相比布朗运动，更有利于纳米材料的递送。基于上述机制，本研究已成功将装载小分子或蛋白类物质的纳米颗粒递送至人组织细胞淋巴瘤细胞（U937细胞）和人宫颈癌细胞（HeLa细胞）中。结果显示，与不使用声流控技术的递送方式相比，本方法递送效率显著提高。此外，本方法不需要气泡或特殊的声学对比剂，这些通常是传统声孔技术中所需的。这种基于声流控技术的细胞内递送方法为实现生物分子物质的可控细胞内递送提供了一种新选择，未来有望应用于治疗领域及生物物理学研究中。

Abstract

Controlled intracellular delivery of biomolecular cargo is critical for developing targeted therapeutics and cell reprogramming. Conventional delivery approaches (e.g., endocytosis of nano-vectors, microinjection, and electroporation) usually require time-consuming uptake processes, labor-intensive operations, and/or costly specialized equipment. Here, we present an acoustofluidics-based intracellular delivery approach capable of effectively delivering various functional nanomaterials to multiple cell types (e.g., adherent and suspension cancer cells). By tuning the standing acoustic waves in a glass capillary, our approach can push cells in flow to the capillary wall and enhance membrane permeability by increasing membrane stress to deform cells via acoustic radiation forces. Moreover, by coating the capillary with cargo-encapsulated nanoparticles, our approach can achieve controllable cell-nanoparticle contact and facilitate nanomaterial delivery beyond Brownian movement. Based on these mechanisms, we have successfully delivered nanoparticles loaded with small molecules or protein-based cargo to U937 and HeLa cells. Our results demonstrate enhanced delivery efficiency compared to attempts made without the use of acoustofluidics. Moreover, compared to conventional sonoporation methods, our approach does not require special contrast agents with microbubbles. This acoustofluidics-based approach creates exciting opportunities to achieve controllable intracellular delivery of various biomolecular cargoes to diverse cell types for potential therapeutic applications and biophysical studies.

关键词

声流控 / 声孔效应 / 纳米载体 / 金属有机骨架

Key words

Acoustofluidics / Sonoporation / Nanocarriers / Metal-organic frameworks

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Zhishang Li,Zhenhua Tian,Jason N. Belling,Joseph T. Rich,Haodong Zhu,Zhehan Ma,Hunter Bachman,Liang Shen,Yaosi Liang,Xiaolin Qi,Liv K. Heidenreich,Yao Gong,Shujie Yang,Wenfen Zhang,Peiran Zhang,Yingchun Fu,Yibin Ying,Steven J. Jonas,Yanbin Li,Paul S. Weiss,Tony J. Huang. 基于声流控技术的细胞内纳米颗粒递送系统[J]. 工程（英文）, 2025, 47(4): 139-148 DOI:10.1016/j.eng.2024.11.030

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1 引言

将生物分子物质高效递送入细胞是多个生物医学研究领域的关键环节，包括基因治疗、细胞重编程、疫苗研发、药物递送、纳米医学等，它可促进治疗和（或）基因工程试剂进入细胞的工程学解决方案发展，在加深我们对细胞过程的理解以及开发治疗性干预手段方面发挥着重要作用[1‒2]。要将目标物质成功递送至靶细胞，物质必须穿过细胞外层的半透性脂质膜。迄今为止，研究人员已开发出多种递送方法，包括基于病毒[3]或非病毒载体[4]的被动递送法（可促进摄取过程），以及能在细胞膜上形成微孔的主动递送法（如声穿孔[5]、电穿孔[6]、机械性膜破坏[7‒9]、热诱导膜破坏[10‒11]和显微注射[12]等）。

在各类基于载体的方法中[13]，多种病毒载体因其高效性与特异性，被广泛应用于临床及转化研究[14]。然而，临床级病毒载体存在诸多局限，如制备成本高、加工流程复杂、具有潜在的插入性基因毒性和免疫原性，且封装容量相对较低[15]。鉴于上述缺陷，以聚合物[16‒18]、无机材料[19]、脂质[20]以及外泌体为基础的纳米载体[21‒22]等非病毒载体成为了极具吸引力的替代方案。不同物质类型（如治疗性分子、基因编辑工具、重编程因子和蛋白质等）可被装载于纳米载体中，进而递送至靶细胞[23]。纳米载体进入细胞后，通常需借助额外刺激触发物质释放过程[24]。尽管在开发各类纳米载体以提升递送效率方面已取得显著进展[25‒28]，但仍有多项挑战亟待解决。这些难题包括纳米载体聚集[29]、物质进入细胞质的摄取速度缓慢、残留纳米载体（即滞留于细胞外培养基中的载体）比例高，以及缺乏高效且可控的机制以促进细胞与纳米载体的接触、膜与纳米载体的结合，最终实现纳米载体跨细胞膜转运[30]。

无载体递送法可主动促进细胞膜形成孔道，使物质扩散进入细胞，因此备受关注[23]。然而，这类方法通常存在诸多局限，如细胞回收率低、依赖特定细胞类型，以及（或）使用设备昂贵[31]。此外，这些技术还容易损伤关键细胞成分，降低细胞存活率，和（或）削弱递送物质的有效性或功能[32]。例如，传统基于微泡的声孔法中，微泡内通常含有特殊声学对比剂[5]，可能对靶细胞造成不可逆损伤，导致细胞存活率下降（部分研究中存活率低于50%）[33‒34]。

声波与微流控技术的融合（即声流控技术）为纳米材料的主动操控和递送提供了强大工具[22,35‒50]。已有多个研究团队致力于开发各类无泡声穿孔法[51]，以解决与微泡对比剂相关的问题。这些方法借助了聚焦声波[33]、表面声波[52‒53]、螺旋声镊[54]或超高频声流[55]等技术。但它们局限于聚焦声波靶向的小区域细胞、小型微流控腔室或超高频声源附近区域的细胞，上述方法的通量仍较低。为提高声穿孔通量，近期我们以在毛细管中应用体驻声波为基础开发了一个系统，实现了向人造血干细胞和其他原代细胞类型高通量递送表达质粒[56]。以往的方法中，微流控通道的物理狭窄结构可使细胞发生形变，而细胞碎片导致通道堵塞[56‒57]，我们开发此系统旨在克服这一问题。既往的声穿孔法诱导细胞膜孔开放[23,58‒59]，但物质进入细胞仍依赖基于扩散的转运方式。这种基于扩散的机制不仅要求细胞外培养基中含有高浓度物质，还会导致物质利用率低（即递送至细胞的物质与残留于细胞外培养基中的物质之比偏低），这是递送昂贵物质时必须考虑的关键因素。

本研究提出一种基于声流控技术的细胞内递送方法，可将封装于金属有机框架基纳米颗粒中的功能性物质高效递送至永生化癌细胞系（如U937细胞和HeLa细胞），并保持生物相容性。本方法利用封装递送物质的纳米颗粒涂层玻璃毛细管中产生的驻声波。通过调节声波频率，使生成的声压节线沿毛细管壁对齐，借助声辐射力将流经毛细管的细胞推向纳米颗粒涂层的毛细管壁，实现细胞与纳米颗粒之间的可控接触，并促进纳米颗粒附着到细胞膜上。这一特性减少了因布朗运动导致的细胞与纳米颗粒相互作用的随机性，而这种随机性限制了传统纳米载体递送[55,60]。这一方法通过将细胞压向纳米颗粒涂层的毛细管壁，并借助声辐射力增加细胞膜应力，促进纳米颗粒的摄取。此外，与传统声穿孔法不同，本文所述方法无需气泡或特殊声学对比剂。

为深入研究此方法的机制和性能特征，我们开展了有限元模拟及一系列实验，向U937和HeLa两种癌细胞系递送不同类型的物质。本研究所用纳米载体以沸石咪唑酯骨架-8（ZIF-8）纳米颗粒为基础，这类多孔纳米材料可负载多种生物分子物质，如喜树碱、阿霉素（DOX）[61]、DNA [62]和成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9 [63]。为研究小分子和蛋白基物质的递送效果，本研究选用了两种物质，DOX和荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的牛血清白蛋白（FBSA）。模拟和实验结果表明，我们的声流控方法可实现细胞与纳米颗粒的主动接触，促进二者结合，同时可提升细胞膜通透性，辅助纳米颗粒的摄取。此外，本方法成功将不同类型物质更高效地递送至细胞内。综上，本文所述声流控技术无需对比剂，为未来开发高效、可控且具有生物相容性的细胞内递送技术提供了思路，有望应用于治疗领域及生物物理学研究。

2 实验方法

2.1 装载递送物质的ZIF-8纳米颗粒合成

按文献[50]所述流程制备装载DOX的ZIF-8纳米颗粒（标记为DOX@ZIF-8）。合成过程中，使用不同浓度DOX可实现不同负载率。本实验使用1 mL浓度为6 mg∙mL-1的DOX溶液。将DOX溶液与200 μL浓度为0.8 mol∙L-1的硝酸锌[Zn(NO3)2]溶液（用氢氧化钠调节pH至8.0）混合，剧烈搅拌10 min，随后逐滴加入2 mL浓度为3 mol∙L-1的2-甲基咪唑溶液。15 min后，经3次8000 r∙min-1离心收集封装DOX的纳米颗粒，用去离子水洗涤，于60 ℃下烘干过夜。装载FBSA的ZIF-8纳米颗粒（标记为FBSA@ZIF-8）的制备流程如下。在2 mL浓度为3 mol∙L-1的2-甲基咪唑溶液中加入100 μL浓度为2 mg∙mL-1 FBSA，搅拌30 min。随后在混合液中加入200 μL浓度为0.4 mol∙L-1的Zn(NO3)2溶液，磁力搅拌15 min。将所得黄色溶液以8000 r∙min-1离心，用去离子水洗涤3次，于65 ℃烘干过夜。

2.2 器件制备

基于声流控技术的细胞内递送器件由锆钛酸铅（PZT）平板型换能器（美国Steminc-Piezo公司）和方形毛细管（美国VitroCom公司）组成。将两片双面胶黏在聚氨酯垫片（厚度为2 mm）上，并用其把换能器固定于载玻片（美国VWR公司）。随后，用环氧树脂（美国Permatex公司）将毛细管贴在换能器顶部。要产生驻声波，需重点考虑声波频率和玻璃毛细管尺寸[64]。本研究选用共振频率为710~720 kHz的换能器，在200 μm × 200 μm × 50 mm的玻璃毛细管中产生体驻声波。在上述频率下，仪器可沿毛细管壁生成声压节线。毛细管两端分别连接一根导管。为了将合成的纳米颗粒（如ZIF-8、DOX@ZIF-8、FBSA@ZIF-8）包覆在玻璃毛细管内壁，先将纳米颗粒溶液注入毛细管，再将毛细管水平放入烘箱中；于65 ℃烘干过夜后，毛细管壁底部会残留一层纳米颗粒。

2.3 器件运行

制备完成的器件被安装于倒置显微镜（日本尼康公司）上。将细胞装入1 mL注射器（美国BD生物科学公司），用自动注射泵（neMESYS，德国Cetoni公司）控制流速，将细胞泵入玻璃毛细管。用函数信号发生器（美国安捷伦公司）生成压电换能器的发射信号，再由功率放大器（美国Amplifier Research公司）放大。在递送实验过程中，用风扇对声流控器件进行降温。

2.4 ZIF-8纳米颗粒中FBSA和DOX的释放

为评估封装于ZIF-8纳米颗粒的物质释放情况，将2 mg纳米颗粒分散于10 mL pH值为5.0或7.2的磷酸盐缓冲液（PBS）中。在不同时间点（1 h、3.5 h、4.5 h、5.5 h、15.5 h、18.5 h、36 h、72 h、96 h、120 h、140 h、160 h、180 h和240 h），从溶液中取出1 mL样品，以6000 r∙min-1离心。每次测量时，取200 μL上清液加入96孔板中，用酶标仪进行检测。每次检测完成后，将样品放回主体溶液，用于后续分析。

2.5 细胞培养和存活率检测

U937和HeLa细胞购自美国典型培养物保藏中心；（ATCC；美国弗吉尼亚）。U937和HeLa细胞分别用RPMI-1640培养基（美国赛默飞世尔公司）和DMEM培养基（美国赛默飞世尔公司）培养。两种培养基均添加10%（V/V）胎牛血清，每两天更换一次培养基。细胞存活率评估方法如下：用钙黄绿素；（AM; C3100MP，美国Life Technologies公司）对细胞进行染色，呈绿色荧光的细胞计为活细胞，计算活细胞数与细胞总数的比值得出细胞存活率。

2.6 递送效率

计算获取的显微镜图像中荧光细胞的数量可得出递送效率。用ImageJ软件（美国国立卫生研究院）计算细胞荧光强度。用流式细胞仪（FACSCanto II，美国BD公司）对纳米颗粒递送效率进行定量评估。进行流式细胞仪测试前，需将收集的细胞洗涤后重悬于PBS中。对每个特征组测量3个样本计算标准差，用FlowJo（美国BD生物科学公司）分析数据。

3 结果与讨论

3.1 基于声流控技术的细胞内递送器件的机制和设计

图1（a）为基于声流控技术的细胞内递送器件示意图，由封装载体的纳米颗粒涂层的方形玻璃毛细管，以及用于产生入射声波的压电换能器组成。器件制备详细步骤见第2节。值得注意的是，毛细管内部尺寸小于换能器所产生声波波长的四分之一。这种几何结构约束可促使沿毛细管内壁形成声压节线[横截面示意图见图1（b）]。当细胞流经封装载体的纳米颗粒涂层的毛细管时[图1（c）]，声辐射力会将细胞推向声压节线，使其紧贴毛细管壁。此过程中细胞可与涂层纳米颗粒直接接触。这种可控的细胞-纳米颗粒相互作用有助于纳米颗粒转移并附着于细胞膜。此外，施加于细胞膜的声辐射力，以及通过细胞膜与毛细管壁相互作用产生的反作用力，会增大细胞膜应力并使细胞发生轻微形变。这些作用力共同促进纳米颗粒穿过细胞膜进入细胞内部。基于上述特性，我们开发的声流控细胞内递送器件可实现封装载体的纳米颗粒向细胞的可控递送。

本研究用ZIF-8纳米颗粒作为纳米载体，主要因其具备封装多种分子物质的能力，且可通过内吞作用将递送物质递送至细胞内[61,65]。封装递送物质的ZIF-8纳米颗粒递送和释放流步骤程图详见图1（d）。声波开启时，流经器件的细胞会被推向玻璃毛细管壁，从而实现细胞与纳米颗粒的接触。这一过程有助于细胞与纳米颗粒结合，并促使纳米颗粒通过内吞作用进入细胞内部。当封装递送物质的ZIF-8纳米颗粒随核内体进入细胞质后，内体的酸性环境会使ZIF-8纳米载体逐渐降解，递送物质便通过内体逃逸而释放[63,66]。需注意，释放过程中并未对细胞施加声波，声波能否促进释放是一个有趣的问题，后续研究中将进行分析。

3.2 封装递送物质的ZIF-8纳米颗粒涂层毛细管

本研究开展了一系列实验，旨在表征封装递送物质的ZIF-8纳米颗粒的性能，并深入理解物质的封装和释放过程。为研究器件对小分子物质和蛋白类物质的递送能力[61,67]，实验选用了DOX和FBSA两种物质。参照第2节所述方法，我们合成了DOX@ZIF-8和FBSA@ZIF-8纳米颗粒，并采用多种技术对其进行表征，包括透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、粉末X射线衍射（PXRD）及紫外-可见（UV-Vis）光谱法（图2）。

TEM图像[图2（a）、（b）]可见，DOX@ZIF-8和FBSA@ZIF-8纳米颗粒的直径均约为150 nm。数量加权DLS测量的粒径分布结果[图2（c）]显示，ZIF-8、DOX@ZIF-8和FBSA@ZIF-8纳米颗粒中，分别有60%、83%和82%的颗粒粒径处于100~250 nm范围内。与ZIF-8相比，装载递送物质的ZIF-8纳米颗粒粒径分布更宽。这可能是由于在ZIF-8成核阶段，封装的FBSA和DOX引发了无定形前驱体的聚集[67]。ZIF-8、DOX@ZIF-8和FBSA@ZIF-8纳米颗粒的PXRD图谱[图2（d）]呈现类似的变化趋势，表明这三种纳米颗粒具有相似的晶体结构。用UV-Vis光谱法表征物质在ZIF-8纳米载体中的封装情况，结果显示FBSA@ZIF-8纳米颗粒在500 nm处出现吸收峰[图2（e）]，表明FBSA蛋白封装成功[67]；DOX@ZIF-8纳米颗粒在490 nm处出现吸收峰[图2（f）]，表明DOX分子装载成功[68]。为探究递送物质释放的pH依赖性，我们将装载递送物质的纳米颗粒分散于不同pH值的溶液中，通过UV-Vis光谱法监测吸收光谱变化。结果（附录A图S1）显示，在非酸性环境（pH = 7.4）中，物质可在ZIF-8纳米颗粒内稳定保留至少10天；而在酸性环境（pH = 5.0）中，ZIF-8纳米颗粒会逐渐降解。

随后，将制备好的DOX@ZIF-8和FBSA@ZIF-8纳米颗粒在玻璃毛细管内壁进行包覆操作（具体方法见第2节）。未包覆纳米颗粒的毛细管内壁光滑[图2（g）]，通道内无荧光信号[图2（j）]。用明场显微镜和荧光显微镜观察，分别证实了DOX@ZIF-8 [图2（h）、（k）]和FBSA@ZIF-8 [图2（i）、（l）]纳米颗粒已成功包覆在毛细管壁上。这些ZIF-8纳米颗粒涂层的毛细管随后被用于细胞内递送实验。

3.3 声流控作用下的细胞运动、形变和通透性变化

我们开展了有限元模拟和细胞追踪实验，研究器件在声波诱导细胞运动、形变和通透性变化等方面的能力，用COMSOL Multiphysics 5.4（瑞典斯德哥尔摩）进行有限元模拟，激发频率为710 kHz，振幅为20~25 Vpp（与实验参数一致，Vpp为电压峰-峰值），模拟结果如图3（a）~（d）所示。位移场图[图3（a）]显示，在此激发频率下呈现共振模式，且以z方向位移为主导。流体域内驻声压场[图3（b）]显示，顶壁边界附近存在低压区域。模拟声辐射力[图3（c）]呈现出较强的+z方向分量，因此毛细管内随机分布的细胞会被推向顶壁，声波诱导的细胞运动轨迹可直观展示这一过程[图3（d）和附录A视频S1]。我们进一步由实验验证有限元模拟预测的细胞运动情况。将细胞载入毛细管，通过显微镜观察声波诱导的细胞运动。捕获的图像[图3（e）~（g）]显示，声波产生时，毛细管内随机分布的细胞可快速向顶壁移动。图3（f）通过叠加录制视频的多帧图像呈现了细胞轨迹，实验获得的细胞轨迹与图3（d）模拟结果一致。除了在系统中不流入细胞培养基的情况外，我们还进行了类似实验，将细胞悬液以5 μL∙min-1流速流经毛细管。附录A视频S2显示，器件可利用声波将流的细胞推向毛细管壁。

为研究器件提升细胞膜通透性的能力，我们将含U937细胞和DOX@ZIF-8纳米颗粒的混合溶液载入两根未包覆纳米颗粒的毛细管中（分别关闭和开启声波）。实验结束后，收集并洗涤待测细胞，用荧光显微镜成像观察。在无声波对照组中，细胞荧光强度明显较弱[图3（h）]。而在开启声波的实验组中，DOX荧光强度明显更高[图3（i）]，表明DOX@ZIF-8纳米颗粒的细胞摄取大幅提升。上述结果证实，我们的声流控器件可促进纳米颗粒的细胞摄取。所见纳米颗粒内化增强现象，可能与声流控处理过程中细胞膜应力增大及细胞轻微形变相关（附录A图S2）[58,69]。这些变化由多种作用力共同诱导产生，包括直接施加于细胞的声辐射力、细胞间相互作用的反作用力，以及细胞与毛细管壁相互作用的反作用力。

数值和实验结果表明，我们的声流控器件能克服纳米颗粒与靶细胞间的布朗运动，促进细胞与纳米颗粒结合，并改变细胞膜的通透性。这些功能的协同作用实现了细胞内纳米颗粒的有效转运。随后，我们进一步研究声流控器件能否将装载不同物质（即FBSA和DOX）的ZIF-8纳米颗粒递送至多种细胞（即U937和HeLa细胞）。

3.4 封装递送物质的ZIF-8纳米颗粒递送至不同类型的细胞

我们开展了补充实验，验证基于声流控技术，封装递送物质的ZIF-8纳米颗粒递送效果。为研究负载不同物质（如FBSA和DOX）的ZIF-8纳米颗粒递送情况，本实验将两组U937细胞（浓度：2 × 106个∙mL-1，流速：5 μL∙min-1）分别流经两种声流控器件，一组为FBSA@ZIF-8纳米颗粒涂层，另一组为DOX@ZIF-8纳米颗粒涂层。收集细胞后，用PBS洗涤3次，接种于培养皿培养30 min，随后用荧光显微镜（TE2000-U，日本尼康公司）成像，如图4（a）~（d）所示，无声波对照组的细胞荧光较弱[图4（a）、（c）]，而暴露于声波的实验组细胞的荧光较强[图4（b）为绿色荧光，图4（d）为红色荧光]，表明实验组纳米颗粒递送效率更高。为表征声波开启组和关闭组的荧光强度差异，我们用ImageJ软件计算了各组细胞的平均荧光强度（附录A图S3）。对比DOX@ZIF-8纳米颗粒的递送结果可知，声波开启组的平均荧光强度至少为关闭组的2倍。由声波介导的FBSA@ZIF-8纳米颗粒递送，其荧光强度提升效果更显著。

为研究纳米载体（仅ZIF-8）降解及声波对细胞存活率的影响，本实验用钙黄绿素细胞存活率检测法（详细步骤见第2节），对经三种不同条件处理的U937细胞进行检测，具体条件如下：①关闭声波，无ZIF-8涂层；②开启声波，无ZIF-8涂层；③开启声波，有ZIF-8涂层。检测结果如图4（e）所示，对比条件①和②结果可见，在无ZIF-8纳米载体的器件中施加声波后，细胞存活率从93%小幅降至85%；对比条件②和③结果可见，在第24 h，细胞存活率从85%进一步小幅降至78%；24 h后，ZIF-8涂层组的细胞存活率约为80%。上述结果表明，ZIF-8纳米载体的降解和所用声波对细胞存活率影响甚微。

为验证声流控器件能否将封装递送物质的ZIF-8纳米颗粒递送至细胞内，且进入细胞的物质是否仍具有功效，我们对U937细胞在不同递送条件下（即关闭或开启声波、有DOX@ZIF-8涂层）开展实验。实验所用物质为DOX——一种常用化疗药物，可诱导细胞凋亡[70]。将U937细胞流经声流控器件后，分别于0.5 h、2 h、8 h和24 h表征细胞存活率，以检测纳米颗粒递送引发的DOX相关细胞毒性。收集的细胞经PBS洗涤并培养后，用钙黄绿素法进行存活率检测。图4（f）结果显示，声波关闭组在0.5~24 h内的细胞存活率约为90%，而声波处理组在第24 h的细胞存活率降至53%，体现了声流控介导的递送效果。声波开启组和关闭组对比结果表明，DOX@ZIF-8纳米颗粒已被递送至细胞内，并释放出DOX。此外，进入细胞的DOX仍具功效[61]。

我们还进行了DOX@ZIF-8递送和DOX释放过程实验。用包覆DOX@ZIF-8纳米颗粒涂层的声流控器件处理悬浮于PBS的HeLa细胞。我们对HeLa细胞流经毛细管的过程进行了视频记录（细胞浓度：2 × 106个∙mL-1，流速：5 μL∙min-1），以确认细胞和涂层的纳米颗粒在毛细管壁的相互作用。结果[图5（a）和附录A视频S3]显示，安装在毛细管底部的PZT换能器产生的声波可迫使细胞沿毛细管顶壁流过。当1 mL细胞悬液流经器件后，我们观察到原纳米颗粒涂层（厚约5 μm）变薄[图5（b）]。这一现象是由于毛细管壁上的纳米颗粒转移至靶细胞的细胞膜上，正如实验结束5 min后的明场显微镜图像所示[图5（c）]，上述实验结果证实，我们的声流控器件可促进细胞和纳米颗粒的接触。

为研究DOX@ZIF-8纳米颗粒中的递送物质的释放，我们将收集的HeLa细胞用PBS洗涤后培养6 h，经染色处理后用荧光显微镜成像。获得的荧光图像显示，DOX（呈红色）在细胞质中均匀分布[图5（d）]。所见DOX由成功递送的DOX@ZIF-8纳米颗粒经内体逃逸过程释放。当ZIF-8骨架暴露于成熟内体的酸性环境时，会开始降解。为验证释放入HeLa细胞的DOX是否仍有功效，我们在递送完成8 h后拍摄了显微镜图像（附录A图S4）。结果显示，与未暴露于声波的对照组[图S4（a）]相比，声波处理组[图S4（b）]的细胞凋亡更多，且贴附于培养皿的细胞数量更少。HeLa细胞存活率随时间推移显著下降（如2 h、8 h和24 h后分别降至73%、55%和42%），这进一步证实了细胞毒性化疗药物的释放降低了处理组的细胞存活率[图S4（c）]。为量化评估声流控器件的递送效率，我们研究了DOX@ZIF-8纳米颗粒向HeLa细胞的递送情况，并用流式细胞仪对递送效率进行表征（具体步骤见第2节）。图5（e）、（f）结果显示，声波关闭组和开启组的递送效率分别约为18%和91%。结果还表明，测得的平均荧光强度由2 × 102（声波关闭组）提升至5 × 102（声波开启组），表明更多DOX@ZIF-8纳米颗粒被递送至细胞。

如上所述，本研究从多方面分析并表征了声流控法的细胞内递送性能。结果表明，负载小分子与蛋白类物质的ZIF-8纳米颗粒可被成功递送至声流控细胞内。实验验证了这一方法对悬浮细胞和贴壁细胞（如U937细胞、HeLa细胞）均具有可行性。细胞存活率检测结果[图4（e）]证实，声波和ZIF-8降解对细胞存活率的影响甚微。流式细胞术研究数据[图5（e）、（f）]显示，引入声波可显著提升递送效率。此外，我们还研究了封装递送物质的ZIF-8纳米颗粒的递送机制以及功能性物质的释放过程。结果[图5（a）~（d）]表明，声流控器件可实现流经细胞与器件微毛细管壁上涂层纳米颗粒的可控接触，促进纳米颗粒附着到细胞上。

4 结论与展望

本文提出了一项有效的基于声流控技术的细胞内纳米颗粒递送系统。本方法无需传统声孔技术中所需的气泡或特殊的声学对比剂[71]。具体而言，利用玻璃毛细管内产生的驻声波，将流经的细胞导向包覆封装递送物质的纳米颗粒涂层的玻璃毛细管壁，促进纳米颗粒附着到细胞膜上。实验结果显示，细胞被推向毛细管壁，发生轻微形变并沿管壁移动。这表明细胞受声辐射力与剪切力的作用。这些作用力会增大细胞膜应力，可能改变细胞膜的通透性。此外，研究结果证实，ZIF-8纳米颗粒可封装小分子及蛋白类物质，在细胞内摄取后可实现这些物质的可控释放。上述机制的协同作用有助于此技术实现有效细胞内递送。

我们应用声流控法进行了一系列实验，将装载不同物质（DOX或FBSA）的ZIF-8纳米颗粒递送至两种永生化癌细胞系（U937细胞和HeLa细胞）。纳米颗粒的细胞内递送结果[图5（e）、（f）]显示，声波可通过诱导细胞膜形变及细胞膜与纳米颗粒的持续接触，显著提升纳米材料的递送效率。此外，研究结果[图4（a）~（d）]证实，两种物质（DOX和FBSA）均可被成功递送至细胞，说明此方法在微流控系统中可突破布朗运动的限制，在向细胞递送小分子和蛋白类物质方面具有潜在应用价值。通过研究、表征和验证，本研究建立了一种不依赖微气泡的声流控细胞内递送方法，推动了声孔效应前沿技术的发展[72]。未来，我们将探究此技术递送其他类型物质的可能性，包括核酸、基于CRISPR/Cas9的基因编辑构件等其他载体。此外，我们将利用难以转染的原代人类细胞（如造血干祖细胞和T细胞）对此技术进行测试，并用经处理的细胞分析其用于体内研究的可行性。本文基于声流控的细胞内递送技术提出了一种可控、灵活的方法，并具备生物相容性。我们期望此技术可应用于工程细胞产品的高效制备，为细胞力学的基础生物物理研究作出贡献。

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