生物还原钒酸盐过程中的电子转移途径和钒同位素分馏

工程（英文） ›› 2025, Vol. 46 ›› Issue (3) : 271 -281. DOI: 10.1016/j.eng.2025.01.001

研究论文

闫文月 ^a ,
张宝刚 ^a^,^* ,
李依娜 ^a ,
路建平 ^a ,
费扬眉 ^a ,
周顺桂 ^b ,
董海良 ^c ,
黄方 ^d^,^*

作者信息 +

Electron Transfer Pathways and Vanadium Isotope Fractionation During Microbially Mediated Vanadate Reduction

Wenyue Yan ^a ,
Baogang Zhang ^a^,^* ,
Yi’na Li ^a ,
Jianping Lu ^a ,
Yangmei Fei ^a ,
Shungui Zhou ^b ,
Hailiang Dong ^c ,
Fang Huang ^d^,^*

Author information +

文章历史 +

Received	Accepted	Published
2024-08-21	2025-01-09
Issue Date
2025-03-14

PDF (5033K)

摘要

微生物对钒酸盐[V(V)]的还原是环境地球化学和钒（V）解毒的关键过程。然而，对于在此过程中涉及的电子转移途径和V同位素分馏情况尚未明确。本文揭示了革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和革兰氏阴性菌陶厄氏菌（Thauera humireducens）的V(V)还原机制以及相应过程中发生的V同位素分馏。研究结果表明，两种菌株都能有效地还原V(V)，在分别接种B. subtilis和T. humireducens后的10天内，初始浓度为50 mg∙L^-1的V(V)分别被还原了90.5% ± 1.6%和93.0% ± 1.8%。五价钒被生物还原为非溶性的四价钒，并发现其分布在细胞内外。通过细胞色素c、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和谷胱甘肽的电子转移在V(V)还原中起着关键作用。代谢组学分析表明，具有富集差异的代谢物（醌、生物素和核黄素）在两种菌株中均介导了电子转移。随着V(V)生物还原的进行，存留在水相中的同位素V表现出变得更重的趋势。V 的同位素组成动态变化遵循瑞利分馏模型，B. subtilis 的同位素富集因子（ε）为-0.54‰ ± 0.04‰，T. humireducens的为-0.32‰ ± 0.03‰，两者并无显著差异。本研究为V(V)生物还原的电子转移提供了分子层面的见解，并揭示了该生物过程中的V同位素分馏情况，这有助于理解V的生物地球化学过程并为V的修复开发新的策略。

Abstract

Microbial vanadate (V(V)) reduction is a key process for environmental geochemistry and detoxification of vanadium (V). However, the electron transfer pathways and V isotope fractionation involved in this process are not yet fully understood. In this study, the V(V) reduction mechanisms with concomitant V isotope fractionation by the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis (B. subtilis) and the Gram-negative bacterium Thauera humireducens (T. humireducens) were investigated. Both strains could effectively reduce V(V), removing (90.5% ± 1.6%) and (93.0% ± 1.8%) of V(V) respectively from an initial concentration of 50 mg·L⁻¹ during a 10-day incubation period. V(V) was bioreduced to insoluble vanadium (IV), which was distributed both inside and outside the cells. Electron transfer via cytochrome C, nicotinamide adenine dinucleotide, and glutathione played critical roles in V(V) reduction. Metabolomic analysis showed that differentially enriched metabolites (quinone, biotin, and riboflavin) mediated electron transfer in both strains. The aqueous V in the remaining solution became isotopically heavier as V(V) bioreduction proceeded. The obtained V isotope composition dynamics followed a Rayleigh fractionation model, and the isotope enrichment factor (ε) was (–0.54‰ ± 0.04‰) for B. subtilis and (–0.32‰ ± 0.03‰) for T. humireducens, with an insignificant difference. This study provides molecular insights into electron transfer for V(V) bioreduction and reveals V isotope fractionation during this bioprocess, which is helpful for understanding V biogeochemistry and developing novel strategies for V remediation.

关键词

钒 / 生物修复 / 钒同位素分馏 / 电子转移

Key words

Vanadate / Bioreduction / Vanadium isotope fractionation / Electron transfer

引用本文

引用格式 ▾

闫文月,张宝刚,李依娜,路建平,费扬眉,周顺桂,董海良,黄方. 生物还原钒酸盐过程中的电子转移途径和钒同位素分馏[J]. 工程（英文）, 2025, 46(3): 271-281 DOI:10.1016/j.eng.2025.01.001

登录浏览全文

4963

注册一个新账户忘记密码

1 引言

钒（V）是一种氧化还原敏感性金属元素，广泛存在于多种天然矿物中[1]。其在地壳中的平均含量（97 mg∙kg^-1）高于铜、镍等常见金属[2]。钒具有独特的物理化学性质[3]，既能在钢中形成合金碳化物以提升韧性，又可催化烟气脱硝，因此在高新技术产业中被大量应用[4]。自然风化作用与日益加剧的人为排放导致钒在环境中广泛分布[5]。例如，美国奇斯曼溪超级基金场地地下水中溶解态钒浓度最高达58.6 mg∙L^-1 [6]，远超美国加利福尼亚州公共卫生部规定的饮用水通报阈值（50 μg∙L^-1）。南非西北省与我国攀枝花市工业区周边土壤中也检测到显著的钒累积现象[4]。由于高剂量钒可引发肺部肿瘤并危害生物体[7]，钒的健康与生态风险日益凸显，现已在全球范围内重新引发关注[5,7]。表生环境主要存在三价、四价和五价钒，即V(III)、V(IV)和V(V) [8‒9]，其中V(III)仅存在于缺氧硫化物环境中[10]。钒酸盐形式的V(V)毒性最强且迁移性高，而V(IV)毒性较低且在中性条件下可自然沉降[7,11]。钒的地球化学循环涵盖吸附/解吸、氧化/还原等多重过程[4]。

V(V)在厌氧条件下可通过微生物催化还原为V(IV)，这一过程被学界视为生态系统应对钒胁迫的解毒机制[12‒13]。目前已在地下水、地表水、土壤及钒矿开采活动导致的尾矿堆积区等多种环境中观察到微生物介导的V(V)还原现象[4,14]。既往研究证实，含革兰氏阳性菌与阴性菌的微生物群落均具有将V(V)生物还原为V(IV)的能力[4,15]，但已分离鉴定的V(V)还原微生物仍十分有限[4]，且主要集中于具有革兰氏阴性特征的变形菌门（Proteobacteria）[15‒17]，这严重制约了对V(V)还原过程的认知及其生物修复应用。微生物实现V(V)还原依赖胞外与胞内电子传递双重途径[18]，在纯培养细胞中已发现细胞色素c、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）等介导电子传递的特异性活性化合物[18]。微生物代谢产物也可能参与电子穿梭，但其对V(V)还原的具体贡献及相关机制尚不明确。

钒存在两种稳定同位素：⁵⁰V（0.24%）和⁵¹V（99.76%）[19]。理论研究表明，钒同位素分馏主要发生于氧化还原反应过程中[20]。由于这两种稳定同位素的比例差异显著（⁵⁰V含量极低），导致⁵⁰V的精确测量存在困难，因此钒同位素分馏分析极具挑战性。直到近年分析技术取得突破后，才实现钒同位素比值的准确测定[21]。钒的分馏效应可用于解析自然环境中氧化还原波动的变化规律[19]。目前针对钒同位素分馏的研究[22]主要集中于地幔熔融、矿物结晶等高温地球化学过程。最新研究发现，来自水、土壤、沉积物等环境介质及植物、地衣、蘑菇等生物群落的样本均呈现系统性差异的钒同位素组成[21,23]，这暗示生物过程可能引发钒同位素分馏。已有研究证实微生物还原作用会导致铬（Cr）、硒（Se）、铀（U）、锑（Sb）、碲（Te）等氧化还原敏感金属的同位素分馏[24]。微生物介导的V(V)还原作为钒地球化学循环的关键环节，其转化过程中是否引发同位素分馏尚缺乏研究证据。

为填补上述知识空白，本研究选取钒污染场地中广泛分布的革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和革兰氏阴性陶厄氏菌（Thauera humireducens）作为研究对象[14]，旨在探究微生物V(V)还原的代谢机制及其伴生的钒同位素分馏效应。本文通过过程监测与产物表征，评估了两种菌株的V(V)还原能力；结合电子显微镜观察、抑制实验和代谢组学分析，系统解析了其分子水平的V(V)还原途径。实验首次发现这两种菌株在V(V)生物还原过程中均能引发钒同位素分馏，该现象可为理解钒的生物地球化学循环提供新视角。

2 材料与方法

2.1 菌株培养与溶液制备

本研究使用的枯草芽孢杆菌和陶厄氏菌菌株均源自福建农林大学。这两种兼性厌氧异养菌适宜在温和环境生存，在厌氧条件下能以Fe(III)和硝酸盐作为电子受体[25]，并具有多种环境污染物的解毒能力[9]。具体培养方法如下：将10 mL菌悬液接种于Luria-Bertani（LB）培养基（酵母提取物5 g∙L^-1、胰蛋白胨10 g∙L^-1、NaCl 10 g∙L^-1），于30 ℃、135 r∙min^-1摇床培养24 h。取40 mL培养液经离心处理（4000g, 20 min；g表示重力加速度），弃上清后用无菌水洗涤沉淀两次，最终接种至100 mL含以下成分的水溶液中（含量以每升溶液计）：CaCl₂ 0.2460 g、MgCl₂·6H₂O 1.0572 g、NaCl 0.4459 g、KCl 0.0283 g、NaHCO₃ 0.8082 g、NH₄Cl 0.1557 g、KH₂PO₄ 0.0299 g，调整600 nm处光密度（OD₆₀₀）值为0.50。使用1 mmol∙L^-1 HCl调节溶液pH至7.00，并通过氮气吹扫去除溶解氧。实验所用V(V)以分析纯NaVO₃（上海阿拉丁生化科技公司）形式添加，超纯水（18.2 MΩ∙cm）由Milli-Q Synthesis超纯水系统（Millipore，美国）制备，其余化学试剂均为分析纯且直接使用。

2.2 实验步骤

本文首先在10天周期内研究了枯草芽孢杆菌和陶厄氏菌的V(V)还原性能，实验设定初始V(V)浓度为50 mg∙L^-1，以乙醇作为碳源，控制总有机碳（TOC）浓度为300 mg∙L^-1。使用灭菌后的生物质作为对照。所有实验均在(30 ± 2) ℃培养箱中以三重平行密封血清瓶进行。每2天监测一次V(V)浓度的降低、TOC消耗和生物量增长情况。以不含V(V)的实验组微生物代谢特性作为对照。培养10天后对V(V)还原过程中产生的蓝色沉淀物进行成分表征。分离不同细胞组分，并通过监测V(V)去除率比较它们的V(V)还原能力[18]。培养菌株经离心收集后，剩余溶液为无细胞提取物。获得的生物质经超声破碎后离心，沉淀物为膜组分，所得溶液为胞质可溶组分[26]。使用电子显微镜表征还原产物在细胞内的分布。最后进行电子转移特性和代谢组学分析，以研究与V(V)还原相关的代谢途径。最后测定V同位素比值（δ⁵¹V）随时间的变化，以研究微生物诱导的分馏效应。

2.3 物理化学性质的表征

每个水样（2 mL）用注射器采集，经0.22 μm滤膜过滤后于4 °C保存待测。使用2-（5-溴-2-吡啶偶氮）-5-二乙氨基苯酚（5-Br-PADAP）作为显色剂，采用分光光度法（检测限为2.2 μg∙L^-1）在601 nm波长处测定可溶性V(V)浓度[27]。钒形态分析采用HSC Chemistry（版本6.0，Outotec，芬兰）软件结合Visual MINTEQ（版本3.1，瑞典皇家理工学院）数据库进行模拟。使用多功能仪器（S400，Mettler-Toledo公司，瑞士）测定pH和氧化还原电位（Eh）。TOC采用Multi N/C 3000总有机碳分析仪（Analytik Jena AG，德国）进行检测。

沉淀物通过离心（6000g, 10 min）收集并冷冻干燥。使用配备能量色散X射线光谱仪（EDS）的扫描电子显微镜（SEM；JEOL JAX-840，日立公司，日本）分析沉淀物成分。沉淀物的结构通过配备X射线管（18 kW）的X射线衍射仪（XRD；Rigaku-D/MAX-PC 2500，理学公司，日本）测定。沉淀物中V的价态通过X射线光电子能谱仪（XPS；XSAM-800，Kratos公司，英国）分析。使用场发射高分辨透射电子显微镜（TEM；JEM-2100F，日立公司，日本）观察细胞形态，并通过元素分布图分析元素分布。洗涤后的细胞用戊二醛溶液（2.5%, w/w）和四氧化锇（1%, w/w）固定，然后用丙酮脱水并聚合[18]。使用超薄切片机（EM UC6，徕卡公司，德国）制备50~60 nm厚的细胞超薄切片。通过线扫描的方式评估细胞内还原产物的分布。将生物还原后的样品，用2 mol∙L^-1 H₂SO₄洗涤和超声处理并收集细胞内外的V进行测定[17]。

2.4 微生物分析

微生物生物量通过分光光度计（DR6000，HACH公司，美国）测定OD₆₀₀值来确定。分别在415 nm和340 nm波长处通过分光光度法测定细菌外膜上的细胞色素c和细胞内NADH的含量。细胞内谷胱甘肽（GSH）采用Ellman法测定。这些指标均以挥发性悬浮固体（VSS）进行归一化处理，并通过在103 °C马弗炉中加热微生物样品12 h后测定重量损失来定量VSS [28]。菌株的电子传递系统活性（ETSA）通过将外源电子受体2-（对碘苯基）-3-（对硝基苯基）-5-苯基氯化四氮唑还原为甲臜来评估[26]。通过添加针对相应活性化合物的特异性抑制剂（细胞色素c用抗霉素A、NADH用鱼藤酮、GSH用卡莫司汀）进行抑制试验[29]。胞外聚合物（EPS）的官能团通过傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet 5700，赛默飞世尔科技公司，美国）进行表征。

为进行代谢组学研究，将不含V(V)和含V(V)培养物的上清液通过0.22 μm膜过滤，并使用超高效液相色谱-傅里叶变换质谱联用仪（Exactive HF-X，赛默飞世尔科技公司）检测上清液中的代谢物。在ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（Waters公司，美国）上进行分析，进样量为2 μL，温度为40 ℃。流动相A由95%水和5%乙腈（含0.1%甲酸）组成，而流动相B由47.5%乙腈、47.5%异丙醇和5%水（含0.1%甲酸）组成。微生物细胞内的代谢物采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS; 8890B-5977B，安捷伦公司，美国）进行分析。衍生化后，将1 μL样品以分流模式进样至GC-MS系统，经DB-5MS毛细管柱（安捷伦公司，美国）分离后，采用电子轰击离子源的质谱进行检测。根据投影变量重要性值大于1.00且代谢物被鉴定为差异代谢物（p < 0.05）的标准，筛选出差异代谢物。代谢物的代谢途径信息来自京都基因与基因组百科全书（KEGG）表达数据库。

2.5 钒同位素的测定和计算

在两种菌株进行V(V)还原过程中，于选定时间点采集水样。所得溶液通过色谱法纯化以去除其他元素，初级分离使用Bio-Rad AG50W-X12（200~400目）阳离子树脂，后续分离使用AG1-X8阴离子树脂（Biorad公司，美国）[30]，化学纯化程序在超净实验室中进行。随后使用Neptune Plus多接收电感耦合等离子体质谱仪（MC-ICP-MS；赛默飞世尔科技公司）测量高精度V稳定同位素，采用中国科学技术大学钒标准（USTC-V）作为空白样，其质量（< 1.5 ng）与用于测量的V（5~10 μg）相比可忽略不计[31]。采用Aridus II（CETAC Technologies公司，美国）膜溶解系统的干等离子体进样方法，在中分辨率模式下选择喷射样品和X截取锥，以提高V同位素测量的灵敏度[24]。每次V同位素分析均进行峰值零位校正。钒同位素组分在连接10¹⁰ Ω电阻的Faraday杯上测量，MC-ICP-MS的所有其他Faraday杯均连接10¹¹ Ω的电阻。基于对BDH标准品[δ⁵¹V = -1.24‰ ± 0.08‰，两倍标准偏差（2SD），n = 292]和USTC-V标准品（δ⁵¹V = 0.06‰ ± 0.08‰, 2SD, n = 186）的重复分析，所采用的V同位素（δ⁵¹V）分析方法的外部精密度优于± 0.08‰（2SD）[32]。

钒同位素数据以相对于标准参考物质的千分偏差（‰）表示：

δ 51 V = 51 V 50 V S a m p l e 51 V 50 V A A × 1000 ‰

（1）

式中，Alfa Aesar（AA）是广泛接受的零δ⁵¹V标准，用于V同位素测量[33]。

V同位素分馏因子（α）表示产物与反应物之间的分馏程度，其定义为：

α= R_product/R_reactant（2）

式中，R_product和R_reactant分别代表产物和反应物的V同位素比值（⁵¹V/⁵⁰V）。

采用适用于封闭系统（如批量实验）的瑞利分馏模型，通过以下方程计算α值：

δ_t = (δ₀+ 1000)f ^α^-1-1000（3）

式中，δ_t 表示实验进行到t时溶液中溶解态V的δ⁵¹V值；δ₀为初始δ⁵¹V值；f为溶液中残留溶解态V的比例。

为方便起见，动力学分馏因子α通过以下公式转换为同位素富集因子（ε）：

ε ≈ (α-1) × 1000‰（4）

采用SPSS（版本25.0，IBM公司，美国）软件进行统计分析，先进行单因素方差分析，再采用Duncan多重范围检验（p < 0.05）。同位素数据以2SD表征不确定度（n = 3），浓度数据以1SD表征不确定度（n = 3）。

3 结果

3.1 V(V)的生物还原及产物

在初始V(V)浓度为50 mg∙L^-1的条件下，B. subtilis和T. humireducens培养体系中的可溶性V(V)浓度随时间逐渐降低[图1（a）]。经过10天培养后，B. subtilis和T. humireducens对V(V)的去除率分别达到90.5% ± 1.6%和93.0% ± 1.8%。经三次培养循环后，灭菌处理的B. subtilis和T. humireducens对V(V)的去除量极低。TOC浓度随时间下降，而OD₆₀₀值逐渐升高[图1（b）]。与B. subtilis相比，T. humireducens表现出更高的有机物消耗量和生物量产量，这与其更快的V(V)去除速率相对应。

SEM图像显示培养后沉淀物紧密附着在细菌细胞上[附录A中的图S1（a）]。EDS分析表明这些沉淀物含有V元素[附录A中的图S1（b）]。XRD谱图中检测到的V化合物特征峰极少[图2（a）]，表明沉淀物呈非晶态。通过XPS分析了沉淀物中V的价态[图2（b）]，在两个菌株中均检测到结合能峰值为515.9 eV的子峰；XPS谱图中还检测到517.1 eV和523.7 eV处的V 2p峰。

3.2 V(V)生物还原的活性位点

两种菌株的膜组分、胞质可溶组分和无细胞提取物组分均显示出V(V)还原能力[图3（a）]。在10天培养期间，B. subtilis的胞质可溶组分表现出最高的V(V)还原能力，其V(V)去除效率达到了38.0% ± 4.8%。相比之下，T. humireducens的膜组分拥有最高的V(V)还原效率，在10天周期内V(V)去除率为37.3% ± 3.2%。

TEM图像显示，V(V)还原后B. subtilis和T. humireducens的完整细胞周围存在明显沉淀物[图3（b）]。元素分布图结果显示固体V沉积在细胞表面及周围环境中，在完整的T. humireducens细胞上观察到更高的V信号强度。在B. subtilis和T. humireducens的超薄切片中也发现了小的黑色颗粒[图3（c）]。线扫描结果表明，两种菌株细胞内V的能量强度均高于细胞外。而T. humireducens细胞内V能量强度较弱，表明其更倾向于在细胞外还原V(V)。

3.3 V(V)生物还原的电子转移途径

与不含V(V)的对照组相比，添加V(V)后细胞色素c含量显著增加[p < 0.01；图4（a）]。NADH含量也随V(V)暴露而增加，特别是在革兰氏阳性菌B. subtilis中，从(82.0 ± 7.8) mg∙g^-1增至(156.1 ± 7.1) mg∙g^-1（以VSS归一化）。本文还检测了细胞内还原物质GSH，但在B. subtilis和T. humireducens中添加V(V)后其含量分别降低了25.4%和22.3%。B. subtilis和T. humireducens添加V(V)后相应ETSA得到了提升[图4（b）]，分别平均提高了2.86倍和3.35倍。当添加相应的抑制剂时，10天周期内的V(V)去除率显著降低[p < 0.001；图4（c）]。然而，这两种菌株对相应抑制剂的抗性存在差异：NADH对B. subtilis更为关键；而T. humireducens更依赖GSH进行V(V)还原[图4（a）]。在B. subtilis和T. humireducens的EPS傅里叶变换红外光谱中检测到羟基（‒OH）和羧基（‒COO^-）基团[图4（d）]。

代谢组学分析表明，当两种菌株暴露于50 mg∙L^-1 V(V)时，与不含V(V)的条件相比，其细胞内和细胞外电子传递相关代谢途径的表达存在差异。泛醌和其他萜烯醌生物合成途径呈现差异表达（附录A中的图S2）。在相应途径中也检测到了差异代谢物[图5（a）]。对于生物素代谢，在两种菌株的上清液中检测到相同的富集代谢物[图5（b）]。含V(V)与不含V(V)的B. subtilis上清液之间的核黄素代谢存在显著差异（p < 0.05），黄素单核苷酸（FMN）的丰度显著增加[p < 0.05；图5（c）]。相比之下，这一途径在T. humireducens中的表达并不显著（p > 0.05），但核黄素显著富集（p < 0.05）。除T. humireducens上清液外，GSH代谢在测试样品中也显示出不同的表达水平。B. subtilis暴露于V(V)后，谷氨酸的丰度显著增加[p < 0.05；图5（d）]。关于氧化磷酸化，当B. subtilis受到V(V)胁迫时，可观察到FMN和琥珀酸盐的显著积累[p < 0.05；图5（e）]。

3.4 钒同位素的动态变化

国药集团生产的NaVO₃的δ⁵¹V值为-0.97‰ ± 0.05‰。在细菌介导的V(V)还原过程中，剩余溶解态V的δ⁵¹V值呈现上升趋势，B. subtilis达到0.14‰ ± 0.03‰，T. humireducens达到-0.15‰ ± 0.08‰，如图6（a）所示。此外，表生环境（包括环境介质，如土壤和沉积物）及生物群中的V同位素比值存在变化，范围约为-2.0‰~2.0‰ [图6（b）]。本研究获得的δ⁵¹V值均在此范围内。考虑到实验体系的封闭性[无V(V)输入输出]和充分混合条件，根据瑞利分馏模型假设V同位素分馏因子恒定，得出B. subtilis和T. humireducens的ε值分别为-0.54‰ ± 0.04‰和-0.32‰ ± 0.03‰，如图6（a）所示。两种菌株间的V同位素分馏差异不显著（p > 0.05）。

形态模拟结果表明，在V(V)生物还原过程中（pH为7.00~7.93，Eh为-120.0~-32.0 mV），原始V(V)以HVO

4 2 -

为主要形态，而生成的V(IV)主要以固体VO(OH)₂形式存在，水溶液中存在微量VO²⁺（附录A中的图S3）。

4 讨论

4.1 V(V)生物还原的性能与机制

实验组和灭菌组的V(V)浓度监测结果表明，B. subtilis和T. humireducens可通过微生物代谢还原V(V)。它们的V(V)去除率优于既往报道的菌株，例如，乳球菌（Lactococcus raffinolactis）在10天运行期间的V(V)去除率约为86.5% [34]。T. humireducens表现出相对更高的V(V)还原速率，这归因于革兰氏阴性菌较薄的细胞壁结构更有利于电子传递[35]。TOC浓度下降伴随OD₆₀₀值升高，表明两种菌株在V(V)还原过程中均存在生长代谢。沉淀物的形成说明V(V)还原产物难溶于水。XPS谱图中结合能峰值为515.9 eV的子峰对应V(IV) [26]，证实微生物介导了V(V)向不溶性V(IV)的转化。XPS谱图中检测到的517.1 eV和523.7 eV处V 2p峰分别归属于V(V)的V 2p_3/2和V 2p_1/2结合能，这可能是测试过程中V(IV)发生再氧化所致[36]。

所有分离的细胞组分均具有还原V(V)的能力，综合TEM图像中固体V的分布，表明两种菌株均在细胞内和细胞外发生V(V)还原。在B. subtilis中，胞质可溶组分更高的V(V)还原能力以及细胞内更强的V能量强度表明该菌株主要在细胞内还原V(V)，这与先前报道的革兰氏阳性菌L. raffinolactis的V(V)还原方式一致[34]。相比之下，T. humireducens主要在细胞外还原V(V)，因为其膜组分表现出最高的V(V)还原性能，且完整T. humireducens细胞显示出更高的V信号强度。

电子传递体含量的增加证明V(V)还原通过电子转移实现。细胞色素c嵌入细胞膜中，可将电子从细胞内传递至细胞外[37]。NADH被氧化为NAD⁺，NADH/NAD ⁺ 氧化还原对是细胞中普遍存在的电子传递体[38]。作为还原剂，NADH也可能参与细胞内V(V)还原为V(IV)的过程[39‒40]。另一种细胞内还原物质GSH通过形成二硫键二聚体被氧化为谷胱甘肽二硫化物（GSSG）[41]。GSH/GSSG作为氧化还原对参与多种细胞代谢过程的电子传递[38]。GSH在V(V)还原中的作用已在嗜热微生物群落中得到证实[42]。暴露于V(V)后GSH含量的下降可能源于GSH与NADH之间的相互转化[43]。ETSA的提升进一步表明V(V)还原通过增强的电子传递实现。抑制剂试验结果说明这些电子传递体在V(V)还原中起重要作用。微生物分泌的EPS也可传递电子，因其还原性基团（‒OH和‒COO^-）能向V(V)提供电子，促进V(V)还原[26]。此外，EPS还能螯合产生的V(IV)。

如代谢组学分析结果所示，差异表达途径及其富集的差异代谢物表明可能有额外的电子传递途径参与V(V)还原。醌类作为氧化还原介质，通过细胞外电子传递参与重金属的生物还原[44]。在生物素代谢过程中，已在生物素修饰金电极界面观察到生物素的电子传递活动[45]。生物素被用作改变电极间电导分布的桥梁，表明其具有电化学活性[46]。FMN是参与微生物代谢的电子载体[47]。核黄素参与代谢中心的各种氧化还原反应，并作为微生物还原重金属的电子穿梭体[48]。这些途径可能有助于V(V)生物还原过程中的细胞外电子传递。B. subtilis中谷氨酸丰度的增加表明，细胞内合成了GSH以用于电子传递和V(V)还原。B. subtilis中FMN和琥珀酸盐的显著积累表明，电子通过氧化磷酸化传递来还原V(V)。这两种途径可能通过细胞内电子传递促进V(V)生物还原。

总之，这两种菌株的V(V)生物还原存在两种电子传递方式。细胞外电子通过外膜上的细胞色素c和可溶性代谢物（如醌类、生物素和核黄素）传递给V(V)。此外，V(V)也可通过NADH和GSH介导的细胞内电子传递被还原为V(IV)。

4.2 V(V)生物还原过程中的钒同位素分馏

国药集团NaVO₃的δ⁵¹V值与钒钛磁铁矿（-0.72‰ ± 0.10‰）[49]略有差异，后者是我国钒生产的主要原料[50]。矿石冶炼和试剂生产过程中的钒同位素分馏可能是造成这种差异的原因。根据先前研究[21,23]，与土壤（-0.7‰）和沉积物（-0.5‰）相比，最高δ⁵¹V值出现在毒蝇伞蕈子实体（1.7‰）中，最低值出现在貂肝脏（-1.7‰），这进一步证明了生物作用下的V同位素分馏现象。

溶液中剩余溶解态V的δ⁵¹V值随V(V)还原而增加，表明较轻同位素在微生物催化V(V)还原过程中优先反应。生物吸收、吸附和氧化还原反应是控制V迁移的主要低温地球化学过程[2]，这些过程可能伴随V同位素分馏。钒的生物可利用性和动力学同位素效应（较轻同位素反应速率更快）共同决定了生物吸收过程中的V同位素分馏[21]。理论计算也表明，轻V同位素（⁵⁰V）优先吸附在针铁矿表面[20]，这是吸附过程中V同位素分馏的原因。对于氧化还原反应，较轻的金属同位素在代谢反应中更受青睐，导致剩余反应物中较重同位素的存在[51]。这也可能适用于V(V)生物还原，从而产生显著的V同位素分馏。在本研究中，微生物还原是V同位素分馏的主要原因，而V同位素动态变化可能受到微生物吸附V(V)产生沉淀物的影响[20]。T. humireducens的V同位素分馏因子略低，可能是由于具有较薄细胞壁的革兰氏阴性菌对V的吸收和V(V)还原更高效。

V(V)向V(IV)的转化与控制V同位素分馏的V‒O键变化有关。因为轻同位素物种具有更高的零点振动能，导致反应需要克服的势垒更小，所以它的键断裂更易发生[52]。当V(V)转化为V(IV)过程中V‒O键断裂时，相对于过渡态，基态V(IV)中V‒O键演化过程中轻同位素的活化能更低。研究表明，在微生物参与的Cr和Se的环境相关氧化还原反应中，也发现了强烈的同位素分馏因子[53‒54]。考虑到这两种菌株V(V)还原反应位点的差异，可以推断代谢途径对V同位素分馏的影响可能较小。Shewanella oneidensis还原Cr(VI)的实验结果也证明了这一点[55]。

4.3 环境与地球化学意义

尽管已有微生物还原V(V)的报道[4]，但催化这一过程的功能菌种仍然有限。本研究发现B. subtilis和T. humireducens能够还原V(V)，扩充了还原V(V)的微生物家族。这些细菌在环境中普遍存在，其去除污染物的能力已得到证实[56‒57]。在地球表生环境的V氧化还原循环中，微生物V(V)还原作用不可忽视，并为V解毒提供了一条有前景的途径。因此，微生物制剂可用于有毒V(V)污染环境的修复[4]。V(V)一旦被还原为V(IV)，就会被固定在细胞内并被EPS螯合，即使细胞死亡也可具有长期稳定性。在实际应用中，应充分考虑地质结构和地球化学因素，以实现可持续修复且不产生二次污染，特别是需要谨慎管理氧化还原条件以防止V(IV)再氧化，因此需要精心设计功能微生物和营养物质的注入方案。有关菌株V(V)还原途径的阐释表明，多种化合物可以促进电子传递，特别是先前研究中未被识别的生物素。可在应用过程中添加可溶性和固态电子传递体[26]，以加速V(V)还原解毒。需要注意的是，V(V)生物还原的电子传递可能具有物种依赖性，因此应研究更广泛类别的细菌以进一步阐明相关机制。

本文首次通过实验准确评估了生物化学反应过程中的V同位素分馏，这对地球表生环境具有地球化学意义。这支持了变价金属在氧化还原过程中会发生大同位素分馏的观点[58]，因此，V同位素分馏可用于识别污染源和追踪污染过程。V(V)还原可由生物和微生物介导，因此产生的V同位素分馏可能不同。其他地球化学和水动力因素（如电子供体和流速）也可能在V(V)生物还原过程中诱导同位素分馏，这需要进一步研究。此外，在其他地球化学过程（如吸附/解吸）中，可能也影响V同位素分馏；在此类生物过程中，不同价态V之间可能存在的弱同位素交换作用也应通过实验评估。

5 结论

本文探究了B. subtilis和T. humireducens对V(V)的还原作用，包括相关电子传递过程及伴随的V同位素分馏效应。在钒初始浓度为50 mg∙L^-1条件下，经过10天培养，B. subtilis和T. humireducens分别去除了90.5% ± 1.6%和93.0% ± 1.8%的V(V)。不溶性V(IV)是V(V)生物还原的主要产物，分布于细胞内外。化合物（细胞色素c、NADH和GSH）浓度的升高与代谢物（醌类、生物素和核黄素）的富集共同介导了V(V)还原的电子传递。随着V(V)生物还原的进行，δ⁵¹V值按照瑞利分馏模型逐渐升高，本文测得B. subtilis和T. humireducens的同位素富集因子分别为-0.54‰ ± 0.04‰和-0.32‰ ± 0.03‰。本文深化了对V生物地球化学循环中V(V)生物还原电子传递机制及V同位素分馏的理解。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用

[1]	Bellenger JP, Wichard T, Kustka AB, Kraepiel AML. Uptake of molybdenum and vanadium by a nitrogen-fixing soil bacterium using siderophores. Nat Geosci 2008;1:243‒6. . 10.1038/ngeo161

[2]	Schlesinger WH, Klein EM, Vengosh A. Global biogeochemical cycle of vanadium. Proc Natl Acad Sci 2017;114:E11092‒100. . 10.1073/pnas.1715500114

[3]	Lu Z, Zhang Y, Wang H, Xia C, Liu Y, Dou S, et al. Transparent thermally tunable microwave absorber prototype based on patterned VO₂ film. Engineering 2023;29:198‒206. . 10.1016/j.eng.2022.10.005

[4]	Zhang B, Zhang H, He J, Zhou S, Dong H, Rinklebe J, et al. Vanadium in the environment: biogeochemistry and bioremediation. Environ Sci Technol 2023;57:14770‒86. . 10.1021/acs.est.3c04508

[5]	Watt JAJ, Burke IT, Edwards RA, Malcolm HM, Mayes WM, Olszewska JP, et al. Vanadium: a re-emerging environmental hazard. Environ Sci Technol 2018;52:11973‒4. . 10.1021/acs.est.8b05560

[6]	Jia L, Anthony EJ, Charland JP. Investigation of vanadium compounds in ashes from a CFBC firing 100% petroleum coke. Energy Fuels 2002;16:397‒403. . 10.1021/ef010238o

[7]	Gustafsson JP. Vanadium geochemistry in the biogeosphere-speciation, solid-solution interactions, and ecotoxicity. Appl Geochem 2019;102:1‒25. . 10.1016/j.apgeochem.2018.12.027

[8]	Huang JH, Huang F, Evans L, Glasauer S. Vanadium: global (bio)geochemistry. Chem Geol 2015;417:68‒89. . 10.1016/j.chemgeo.2015.09.019

[9]	Zhang H, Jiao S, Xing Y, Jiang B, Zhou S, Zhang B. Unveiling soil microbiome adaptation and survival strategy under vanadium stress in nationwide mining environments. J Geophys Res: Biogeosci 2024;129:e2023JG007655. . 10.1029/2023jg007655

[10]

Shaheen SM, Alessi DS, Tack FMG, Ok YS, Kim K, Gustafsson JP, et al. Redox chemistry of vanadium in soils and sediments: interactions with colloidal materials, mobilization, speciation, and relevant environmental implications—a review. Adv Colloid Interface Sci 2019;265:1‒13. . 10.1016/j.cis.2019.01.002

[11]	He J, Zhang B, Tan C, Tang Y, Shen Z, Wu S, et al. Distinguishing contributions of diverse sediment components to vanadium transport, immobilization and transformation in aquifer. Water Res 2024;265:122248. . 10.1016/j.watres.2024.122248

[12]	Lai C, Dong Q, Chen J, Zhu Q, Yang X, Chen W, et al. Role of extracellular polymeric substances in a methane based membrane biofilm reactor reducing vanadate. Environ Sci Technol 2018;52:10680‒8. . 10.1021/acs.est.8b02374

[13]

Yan G, Sun X, Dong Y, Gao W, Gao P, Li B, et al. Vanadate reducing bacteria and archaea may use different mechanisms to reduce vanadate in vanadium contaminated riverine ecosystems as revealed by the combination of DNA-SIP and metagenomic-binning. Water Res 2022;226:119247. . 10.1016/j.watres.2022.119247

[14]	Sun X, Qiu L, Kolton M, Häggblom M, Xu R, Kong T, et al. Reduction by Polaromonas spp. in vanadium mine tailings. Environ Sci Technol 2020;54:14442‒54. . 10.1021/acs.est.0c05328

[15]	Ortiz-Bernad I, Anderson RT, Vrionis HA, Lovley DR. Vanadium respiration by Geobacter metallireducens: novel strategy for in situ removal of vanadium from groundwater. Appl Environ Microb 2004;70:3091‒5. . 10.1128/aem.70.5.3091-3095.2004

[16]	Carpentier W, Sandra K, De Smet I, Brigé A, De Smet L, Van Beeumen J. Microbial reduction and precipitation of vanadium by Shewanella oneidensis . Appl Environ Microbiol 2003;69:3636‒9. . 10.1128/aem.69.6.3636-3639.2003

[17]	Zhang J, Dong H, Zhao L, McCarrick R, Agrawal A. Microbial reduction of precipitation of vanadium by mesophilic and thermophilic methanogens. Chem Geol 2014;370:29‒39. . 10.1016/j.chemgeo.2014.01.014

[18]	Wang G, Zhang B, Li S, Yang M, Yin C. Simultaneous microbial reduction of vanadium (V) and chromium (VI) by Shewanella loihica PV-4. Bioresour Technol 2017;227:353‒8. . 10.1016/j.biortech.2016.12.070

[19]	Wu F, Owens JD, Scholz F, Huang L, Li S, Riedinger N, et al. Sedimentary vanadium isotope signatures in low oxygen marine conditions. Geochim Cosmochim Acta 2020;284:134‒55. . 10.1016/j.gca.2020.06.013

[20]	Wu F, Qin T, Li X, Liu Y, Huang J, Wu Z, et al. First-principles investigation of vanadium isotope fractionation in solution and during adsorption. Earth Planet Sci Lett 2015;426:216‒24. . 10.1016/j.epsl.2015.06.048

[21]	Chételat J, Nielsen SG, Auro M, Carpenter D, Mundy L, Thomas PJ. Vanadium stable isotopes in biota of terrestrial and aquatic food chains. Environ Sci Technol 2021;55:4813‒21. . 10.1021/acs.est.0c07509

[22]	Chen Z, Ding X, Kiseeva ES, Lin X, Huang J, Huang F. Vanadium isotope fractionation of alkali basalts during mantle melting. Lithos 2023;107082:442‒3. . 10.1016/j.lithos.2023.107082

[23]	Dong L, Wei W, Xu L, Lin Y, Liu Z, Pan S, et al. Vanadium isotope evidence for seawater contribution to V enrichment/mineralization in early Cambrian metalliferous black shales. Sci Bull 2024;69:1006‒10. . 10.1016/j.scib.2024.02.006

[24]

Johnson TM, Jennifer D, Basu A, Jemison N, Wang XL, Kathrin S, et al . A review of the development of Cr, Se, U, Sb, and Te isotopes as indicators of redox reactions, fatecontaminant, and contaminant transport in aqueous systems. In: Kenneth WWS, editor. Isotopic constraints on earth system processes. New York City: John Wiley & Sons; 2022. p. 237‒69. . 10.1002/9781119595007.ch10

[25]	Ma C, Yu Z, Lu Q, Li Z, Zhou S. Anaerobic humus and Fe(III) reduction and electron transport pathway by a novel humus-reducing bacterium, Thauera humireducens SgZ-1. Appl Microbiol Biotechnol 2015;99:3619‒28. . 10.1007/s00253-014-6254-x

[26]	Fei Y, Zhang B, Chen D, Liu T, Dong H. The overlooked role of denitrifying bacteria in mediating vanadate reduction. Geochim Cosmochim Acta 2023;361:67‒81. . 10.1016/j.gca.2023.10.015

[27]	Deng J, Huang KH, An L, Hu CH, Ju SQ, Xiao N. Cloud point extraction and simultaneous spectrophotometric determination of V(V), Co(II) and Cu(II) ions in water samples by 5-Br-PADAP using partial least squares regression. J Radioanal Nucl Chem 2014;300:835‒42. . 10.1007/s10967-014-3062-9

[28]	Bridgewater LL, Baird RB, Eaton AD, Rice EW, American public health association, In: Standard methods for the examination of water and wastewater. 23rd edition. Washington, DC: American Public Health Association; 2017.

[29]	Wang S, Zhang B, Fei Y, Liu H, Zhao Y, Guo H. Elucidating multiple electrontransfer pathways for metavanadate bioreduction by actinomycetic Streptomyces microflavus . Environ Sci Technol 2023;57:19921‒31. . 10.1021/acs.est.3c07288

[30]	Qi YH, Wu F, Ionov DA, Puchtel IS, Carlson RW, Nicklas RW, et al. Vanadium isotope composition of the bulk silicate earth: constraints from peridotites and komatiites. Geochim Cosmochim Acta 2023;259:288‒301.

[31]	Wu F, Qi Y, Yu H, Tian S, Hou Z, Huang F. Vanadium isotope measurement by MC-ICP-MS. Chem Geol 2016;421:17‒25. . 10.1016/j.chemgeo.2015.11.027

[32]	Wu F, Qi Y, Yu H, Tian S, Hou Z, Huang F. Coupled variations in V‒Fe abundances and isotope compositions in latosols: implications for V mobilization during chemical weathering. Geochim Cosmochim Acta 2022;320:26‒40. . 10.1016/j.gca.2021.12.028

[33]	Prytulak J, Nielsen SG, Ionov DA, Halliday AN, Harvey J, Kelley KA, et al. The stable vanadium isotope composition of the mantle and mafic lavas. Earth Planet Sci Lett 2013;365:177‒89. . 10.1016/j.epsl.2013.01.010

[34]	Zhang B, Li Y, Fei Y, Cheng Y. Novel pathway for vanadium (V) biodetoxification by Gram-positive Lactococcus raffinolactis . Environ Sci Technol 2021;55:2121‒31. . 10.1021/acs.est.0c07442

[35]	Zhou X, Kang F, Qu X, Fu H, Alvarez P, Tao S, et al. Role of extracellular polymeric substances in microbial reduction of arsenate to arsenite by Escherichia coli and Bacillus subtilis . Environ Sci Technol 2020;54:6185‒93. . 10.1021/acs.est.0c01186

[36]	Elmouwahidi A, Bailón-García E, Pérez-Cadenas AF, Fernández-Sáez N, Carrasco-Marín F. Development of Vanadium-coated carbon microspheres: electrochemical behavior as electrodes for supercapacitors. Adv Funct Materials 2018;28:1802337. . 10.1002/adfm.201802337

[37]	Zhao Y, Hsieh HS, Wang M, Jafvert CT. Light-independent redox reactions of graphene oxide in water: electron transfer from NADH through graphene oxide to molecular oxygen, producing reactive oxygen species. Carbon 2017;123:216‒22. . 10.1016/j.carbon.2017.07.048

[38]

Henke AH, Laudadio ED, Orbeck JKH, Tamijani AA, Hoang KNL, Mason SE, et al. Reciprocal redox interactions of lithium cobalt oxide nanoparticles with nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and glutathione (GSH): toward a mechanistic understanding of nanoparticle-biological interactions. Environ Sci Nano 2021;8:1749‒60. . 10.1039/d0en01221a

[39]	Carpentier W, Sandra K, De Smet I, Brigé A, De Smet L, Van Beeumen J. Microbial reduction and precipitation of vanadium by Shewanella oneidensis . Appl Environ Microbiol 2003;69:3636‒9. . 10.1128/aem.69.6.3636-3639.2003

[40]	Islam MK, Tsuboya C, Kusaka H, Aizawa S, Ueki T, Michibata H, et al. Reduction of vanadium (V) to vanadium (IV) by NADPH, and vanadium (IV) to vanadium (III) by cysteine methyl ester in the presence of biologically relevant ligands. BBA-Gen Subjects 2007;1770:1212‒8. . 10.1016/j.bbagen.2007.05.003

[41]	Kretzschmar J, Strobel A, Haubitz T, Drobot B, Steudtner R, Barkleit A, et al. Uranium(VI) complexes of glutathione disulfide forming in aqueous solution. Inorg Chem 2020;59:4244‒54. . 10.1021/acs.inorgchem.9b02921

[42]	Zheng X, Zhao B, Liu C. Bio-reduction mechanism of V(V) by thermophilic hydrogen-producing bacteria under acidic conditions. Environ Sci Wat Res 2021;7:1657‒65. . 10.1039/d1ew00355k

[43]	Maiti M, Murali VP, Selvakumar D, Podder A, Maiti KK, Bhuniya S. NADH-induced “kick-on” fluorescent probe validates crosstalk with redox regulator GSH. Sens Actuators B Chem 2019;299:126964. . 10.1016/j.snb.2019.126964

[44]	Newman DK, Kolter RA. Role for excreted quinones in extracellular electron transfer. Nature 2000;405:94‒7. . 10.1038/35011098

[45]	Kar P, Tatard F, Lamblin G, Banet P, Aubert PH, Plesse C, et al. Silver nanoparticles to improve electron transfer at interfaces of gold electrodes modified by biotin or avidin. J Electroanal 2013;692:17‒25. . 10.1016/j.jelechem.2012.12.020

[46]	Zhang B, Song W, Pang P, Lai H, Chen Q, Zhang P, et al. Role of contacts in long-range protein conductance. Proc Natl Acad Sci 2019;116:5886‒91. . 10.1073/pnas.1819674116

[47]	Light SH, Su L, Rivera-Lugo R, Cornejo JA, Louie A, Iavarone AT, et al. A flavin-based extracellular electron transfer mechanism in diverse Gram-positive bacteria. Nature 2018;562:140‒4. . 10.1038/s41586-018-0498-z

[48]	Suzuki Y, Kitatsuji Y, Ohnuki T, Tsujimura S. Flavin mononucleotide mediated electron pathway for microbial U(VI) reduction. Phys Chem Chem Phys 2010;12:10081‒7. . 10.1039/c0cp00339e

[49]	Huang Y, Long Z, Zhou D, Wang L, He P, Zhang G, et al. Fingerprinting vanadium in soils based on speciation characteristics and isotope compositions. Sci Total Environ 2021;791:148240. . 10.1016/j.scitotenv.2021.148240

[50]	Leaching characteristics of vanadium in mine tailings and soils near a vanadium titanomagnetite mining site. J Hazard Mater 2014;264:498‒504. . 10.1016/j.jhazmat.2013.09.063

[51]	Wiederhold JG. Metal stable isotope signatures as tracers in environmental geochemistry. Environ Sci Technol 2015;49:2606‒24. . 10.1021/es504683e

[52]	DePaolo DJ. Surface kinetic model for isotopic and trace element fractionation during precipitation of calcite from aqueous solutions. Geochim Cosmochim Acta 2011;75:1039‒56. . 10.1016/j.gca.2010.11.020

[53]	Basu A, Johnson TM, Sanford RA. Cr isotope fractionation factors for Cr (VI) reduction by a metabolically diverse group of bacteria. Geochim Cosmochim Acta 2014;142:349‒61. . 10.1016/j.gca.2014.07.024

[54]	Schilling K, Basu A, Wanner C, Sanford RA, Pallud C, Johnson TM, et al. Mass-dependent selenium isotopic fractionation during microbial reduction of seleno-oxyanions by phylogenetically diverse bacteria. Geochim Cosmochim Acta 2020;276:274‒88. . 10.1016/j.gca.2020.02.036

[55]	Han J, Chen G, Qin L, Mu Y. Metal respiratory pathway-independent Cr isotope fractionation during Cr(VI) reduction by Shewanella oneidensis MR-1. Environ Sci Technol Lett 2017;4:500‒4. . 10.1021/acs.estlett.7b00471

[56]	Wu S, Lu S, Liu J, Yang S, Yan Q, Jiang Z. Physicochemical properties and bioactivities of rice beans fermented by Bacillus amyloliquefaciens . Engineering 2021;7:219‒25. . 10.1016/j.eng.2020.10.010

[57]	Ma J, Wang F, Fan H, Li E, Chu H, Zhou X, et al. Metagenomic insight reveals the microbial structure and function of the full-scale coking wastewater treatment system: gene-based nitrogen removal. Engineering 2024;36:76‒89. . 10.1016/j.eng.2023.06.019

[58]	Wen H, Carignan J. Selenium isotopes trace the source and redox processes in the black shale-hosted Se-rich deposits in China. Geochim Cosmochim Acta 2011;75:1411‒27. . 10.1016/j.gca.2010.12.021