连翘苷通过调节P38 MAPK通路抗SARS-CoV-2所致炎症的作用机制

马钦海 ,  谢佩芳 ,  占扬清 ,  陈瑞晗 ,  刘斌 ,  苏泳杰 ,  丘婉俐 ,  李璇璇 ,  赵婷婷 ,  钟南山 ,  杨子峰

工程（英文） ›› 2025, Vol. 54 ›› Issue (11) : 202 -218.

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工程（英文） ›› 2025, Vol. 54 ›› Issue (11) : 202 -218. DOI: 10.1016/j.eng.2025.01.020
Research

连翘苷通过调节P38 MAPK通路抗SARS-CoV-2所致炎症的作用机制

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Elucidating Forsythin’s Anti-Inflammatory Action Through Modulation of the P38 MAPK Pathway in SARS-CoV-2 Infection

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摘要

严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）感染通过激活与疾病严重程度相关的炎症通路来破坏免疫功能。明确病毒诱导的炎症对于开发抗新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的治疗策略至关重要。本研究使用主成分分析、热图等工具，对丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的基因表达进行了检测，结果发现MAPK通路基因的改变与免疫反应的变化存在关联。进一步分析将P38相关基因的表达与临床症状联系起来，转录组数据表明MAPK基因表达的变化与SARS-CoV-2感染之间存在紧密联系。在受感染的细胞模型中，磷酸化P38（P-P38）蛋白和炎症因子显著上调。对GSE217948数据集的分析显示，血浆标志物[干扰素诱导蛋白10（IP-10）和白细胞介素-6（IL-6）]与症状（发热和疲劳）之间存在显著相关性。P38的激活似乎会释放与上述症状相关的炎症因子，这提示P38可能是病毒引发炎症过程中的关键通路。连翘苷（KD-1）是一种从连翘中提取的抗炎化合物，在细胞和动物模型中均显示出对SARS-CoV-2的抑制效果，它能够抑制病毒复制，降低P38水平，并减少炎症标志物[IL-6、IL-8、IP-10、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）]的产生。在特定的细胞模型中，KD-1可阻断P38的激活，从而减轻炎症。在P38过表达模型中，KD-1降低了P38的磷酸化水平以及下游炎症蛋白的含量。本研究确定P38通路为COVID-19的治疗靶点，证实了KD-1在减轻病毒引发的炎症方面具有潜在作用，并为进一步研究针对呼吸道病毒的抗炎治疗方法提供了指导。

Abstract

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) infection disrupts immune function by activating inflammatory pathways related to disease severity. Understanding virus-induced inflammation is crucial for developing anti-coronavirus disease 2019 (COVID-19) therapies. This study used principal component analysis, heatmaps, and other tools to examine mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway gene expression, and found that alterations in MAPK pathway genes were correlated with immune response changes. Further analysis linked P38-related gene expression to clinical symptoms, with transcriptomic data showing a strong association between MAPK gene expression changes and SARS-CoV-2 infection. In infected cell models, P-P38 protein and inflammatory factors were significantly upregulated. Analysis of the GSE217948 dataset showed a significant correlation between plasma markers (interferon inducible protein 10 (IP-10) and interleukin (IL)-6) and symptoms (fever and fatigue). Activation of P38 appears to release inflammatory factors tied to these symptoms making P38 as a key pathway in virus-induced inflammation. Forsythin (KD-1), an anti-inflammatory compound from forsythia showed efficacy against SARS-CoV-2, inhibiting replication, reducing P38 levels, and lowering inflammatory markers (IL-6, IL-8, IP-10, tumor necrosis factor-α (TNF-α), and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1)) in both cell and animal models. In specific cell models, KD-1 blocked P38 activation, thereby reducing inflammation. In a P38 overexpression model, KD-1 decreased P38 phosphorylation and downstream inflammatory proteins. This study identifies the P38 pathway as a therapeutic target for COVID-19, supporting KD-1’s potential in mitigating virus-induced inflammation and guiding further research into anti- inflammatory treatments for respiratory viruses.

Graphical abstract

关键词

SARS-CoV-2 / P38 MAPK通路 / 抗炎 / 连翘苷（KD-1） / 临床症状

Key words

SARS-CoV-2 / P38 MAPK pathway / Anti-inflammatory / Forsythin (KD-1) / Clinical symptoms

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马钦海,谢佩芳,占扬清,陈瑞晗,刘斌,苏泳杰,丘婉俐,李璇璇,赵婷婷,钟南山,杨子峰. 连翘苷通过调节P38 MAPK通路抗SARS-CoV-2所致炎症的作用机制[J]. 工程（英文）, 2025, 54(11): 202-218 DOI:10.1016/j.eng.2025.01.020

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1 引言

严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）是新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情的罪魁祸首，近几年来严重影响了全球公共卫生。尽管针对COVID-19的防控措施稳定，但SARS-CoV-2病毒持续发生变异，增强了其免疫逃逸能力，降低了疫苗的有效性，也限制了现有治疗方案的可选择性[1‒2]。因此，亟须开发具有不同作用机制的创新型抗冠状病毒疗法。

COVID-19的症状（如发烧、咳嗽和疲劳）是与人体免疫和生化反应直接相关的量化指标。白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）和IL-10水平的升高，与咳嗽、疲劳、不适、神经认知障碍以及情绪障碍等症状密切相关[3‒5]。而这些炎症介质的过度产生是生化信号通路[包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路]放大的结果[6]，MAPK信号通路在SARS-CoV-2的复制以及细胞因子的产生过程中都起着核心作用[7‒8]。然而，在SARS-CoV-2感染过程中，MAPK信号通路的确切激活机制仍十分复杂。确定一条能够在不同感染阶段显著调节由COVID-19诱导的炎症的通路至关重要。

MAPK通路主要由细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和P38 MAPK亚通路组成。P38α在介导炎症反应方面尤为关键，它通过促进促炎细胞因子（如IL-6、TNF-α和IL-1β）的激活来发挥作用[9‒11]。尽管大量研究致力于开发具有选择性、高效的P38α抑制剂，但目前尚无一款能成功上市[12]。针对COVID-19的选择性P38/MAPK抑制剂的临床试验，如洛批莫德（losmapimod）和KIN001，由于治疗格局的变化以及招募受试者的困难而被迫终止或未能完成[13‒14]。尽管如此，研究人员仍将P38抑制剂视为有前景的COVID-19治疗候选药物，这凸显了持续探索新型P38抑制剂作为COVID-19潜在治疗药物的必要性。

连翘是木犀科的一种药用植物，长期以来一直被用于治疗风热感冒、痈肿疮毒等病症。临床医生也将其用于治疗发热、普通感冒、肿瘤、高血压以及其他疾病[15]。连翘苷（KD-1）是连翘中的主要活性成分，以其抗炎与解热特性而闻名。它在退热、减轻炎症以及对抗病毒与细菌感染方面表现出显著疗效[15]。在先前的研究中，KD-1在治疗呼吸道病毒感染方面已进入三期临床试验阶段，显示出其在减轻流感引起的发热和肺部炎症方面颇为有效，且证明了其毒理学安全性[16‒18]。然而，其在治疗COVID-19患者或感染SARS-CoV-2变异株的动物模型中的有效性及其确切的作用机制，仍有待明确。

基于上述背景，本研究旨在阐明COVID-19患者体内促炎介质释放的主要机制，并探究P38通路、炎症标志物与COVID-19症状之间的关系。此外，本研究还力求深入了解KD-1通过靶向P38通路，在治疗COVID-19引发的炎症方面的治疗潜力。

2 方法

2.1 试剂

KD-1（批号：20190201）由大连富生天然药物开发有限公司提供；羧甲基纤维素钠（批号：9004-32-4）购自上海源叶生物技术有限公司；Paxlovid（PF-332）（批号：2628280-40-8）购自上海鸿永生物科技有限公司；达马莫德（BIRB 796）（批号：285983-48-4）由美国MedChemExpress公司提供；SARS-Cov-2刺突糖蛋白一抗（ab272504）由英国Abcam公司提供，磷酸化P38抗体（#4511）、P38抗体（#9212）和山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）H&L二抗（批号：7074）由美国Cell Signaling Technology公司提供。

2.2 细胞系和病毒

非洲绿猴肾上皮细胞（Vero E6）、RAW264.7、人肺腺癌细胞（Calu3）以及人急性单核细胞白血病细胞（THP-1）均购自美国模式培养物保藏中心（ATCC）。细胞在含有10%胎牛血清（FBS）、100 U∙mL-1青霉素和100 μg∙mL-1链霉素的杜氏改良Eagle培养基（DMEM）和RPMI 1640培养基中进行培养。SARS-CoV-2变异株Omicron BA.1（B.1.1.529）从广州医科大学附属第一医院的临床样本中分离得到。参照文献[19]所述的Reed-Muench方法测定病毒滴度，即半数组织培养感染剂量（TCID50），测定结果为10-6（每100 μL）。

2.3 细胞病变效应（CPE）抑制试验

将100 TCID50的SARS-CoV-2接种到长满单层Vero E6细胞的培养皿中，作用2 h，随后加入不同浓度的KD-1进行孵育。72 h后，在显微镜下观察被感染的细胞，并记录CPE。用Reed-Muench法计算KD-1对病毒诱导的细胞病变效应的半数抑制浓度（IC50）。

2.4 空斑减少试验

将Vero E6细胞接种到12孔板中，分为6组：正常对照组（NC）、病毒感染组（Virus）、PF-332（10 μmol∙L-1）组，以及3个不同浓度的KD-1组（935.00 μmol∙L-1、467.50 μmol∙L-1和233.75 μmol∙L-1）。在感染SARS-CoV-2后，向细胞中覆盖一层含有琼脂（0.6%琼脂、2% FBS以及指定浓度的KD-1）的培养基，然后孵育72 h。去除覆盖的琼脂层并固定细胞单层后，对空斑进行计数并拍照记录。

2.5 KD-1的体外抗病毒和抗炎活性

如2.4节所述，将12孔板中培养的Calu3细胞分为6组，用SARS-CoV-2（100 TCID50）感染2 h，然后用特定的化合物进行处理。孵育48 h后，提取总蛋白和RNA，用于蛋白质印迹（Western blot）分析或逆转录-实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析[20]。

2.6 KD-1的体内抗病毒和抗炎活性

本动物实验经广州医科大学动物实验伦理委员会批准（2021061），严格按照美国国家研究委员会指南和中国动物保护法（GZL0008）进行。购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司的8周龄雄性K18-hACE2转基因C57BL/6小鼠（18~22 g）被随机分为5组（每组n = 7）。除了NC组接受50 μL不含病毒的磷酸盐缓冲液（PBS）处理外，其余小鼠均经鼻内接种50 μL SARS-CoV-2 [105个空斑形成单位（PFU）∙mL-1]，并连续5天每天接受KD-1（40 mg∙kg-1或80 mg∙kg-1）、PF-332（600 mg∙kg-1）或PBS的治疗。监测小鼠的存活情况，并在第5天收集肺组织，检测病毒滴度、炎症标志物信使RNA（mRNA）水平（RT-qPCR）和MAPK蛋白表达[苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组化（IHC）分析]情况[21]。

2.7 刺突蛋白刺激THP-1模型和脂多糖（LPS）刺激RAW264.7模型的建立

将THP-1细胞接种到6孔板中，在添加100 ng∙mL-1 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）的完全培养基中培养36 h。将THP-1和RAW264.7细胞分为6组：NC组、刺突蛋白感染组、LPS感染组、达马莫德（BIRB）组以及用三种不同浓度的KD-1（467.50 μmol∙L-1、233.75 μmol∙L-1和116.88 μmol∙L-1）处理的三组。在共刺激之前，THP-1细胞和RAW264.7细胞用KD-1或BIRB预处理12 h。随后细胞用200 μg∙mL-1 LPS或20 μg∙mL-1刺突蛋白与KD-1处理细胞24 h。

2.8 体外模拟SARS-CoV-2感染实验

将在6孔板中培养的Calu3细胞分为4组：NC组、轻度感染组、中度感染组和重度感染组，分别对应感染100 TCID50、1000 TCID50和10 000 TCID50的SARS-CoV-2。感染48 h后，提取总蛋白和RNA进行后续分析。

2.9 MAPK14过表达实验

将MAPK14基因的编码序列克隆到EX-y0202-M14载体中，构建MAPK14过表达质粒。然后使用Lipo 3000转染试剂将构建成功的质粒转染到Calu3细胞中。转染后，用100 TCID50剂量的SARS-CoV-2感染细胞。使用KD-1（1 μg）干预48 h后，采用RT-qPCR检测炎症因子的mRNA表达水平。用Primer 5.0软件设计目标基因的引物（引物信息见表A附录中的表S1）。此外，进行蛋白质印迹分析，以检测P38信号通路中关键蛋白的表达情况。

2.10 转录组分析

用SARS-CoV-2（100 TCID50）感染6孔板中培养的Calu3细胞2 h，随后用新鲜培养基替换病毒悬液。持续孵育48 h后，收集来自NC组和Virus组的细胞用于RNA测序分析。构建文库并在Illumina HiSeq平台上进行测序。使用DESeq（2012）R包的估计大小因子估计函数进行数据标准化。基于P小于0.05和|log2倍变化（FC）|大于1来鉴定差异表达基因（DEGs）。使用DAVID数据库进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，P小于0.05被认为具有统计学意义。

2.11 COVID-19患者样本数据分析

分别从Pathcards和KEGG数据库分别获取共245个和247个与MAPK通路相关的基因。此外，从综合基因表达数据库（GEO）获得GSE217948微阵列的基因表达数据。共收集了274个血浆转录本样本，并根据世界卫生组织（WHO）的COVID-19疾病严重程度量表进行分类（0：健康；1~5：轻度至重度；6~9：重度），其中包括71个健康样本、139个中度样本和64个重度样本。差异表达基因的筛选标准设定为|log2FC|大于1且校正P小于0.05。进行主成分分析（PCA）以分析样本之间的关系，并使用heatmap和ggplot2 R包生成差异表达基因的热图和火山图。随后，基于已鉴定的差异表达基因进行KEGG和基因集富集分析（GSEA）。

2.12 免疫景观分析

使用CIBERSORT算法确定样本中22种免疫细胞的相对比例。采用Kruskal-Wallis检验用来比较这22种不同类型免疫细胞的水平，同时使用Spearman相关性分析来研究免疫细胞浸润与MAPK通路相关基因之间的关系。

2.13 筛选关键基因或炎症细胞因子

对GSE217948数据集应用了三种不同的分析方法。曲线下面积（AUC）大于0.7的基因被认为对疾病诊断具有指示意义。利用岭回归（ridge regression）来评估疾病严重程度评分，将DEGs视为自变量，通过受试者工作特征（ROC）曲线分析，能够将与疾病相关的基因分为健康组和患病组。识别并交叉分析关键基因，使用STRING数据库（置信度得分≥ 0.4）构建相互作用网络，并在Cytoscape软件中进行可视化展示。

2.14 炎症因子与临床症状评分的相关性

使用Shapiro-Wilk检验评估血浆中细胞因子的正态分布情况。采用Spearman相关系数来评估炎症因子表达水平与临床症状评分之间的关系，同时使用Pearson相关系数来分析血浆样本中炎症因子水平之间的关联。运用逐步回归分析方法来评估炎症因子水平与临床症状评分之间的关系。

2.15 分子对接验证

从PubChem数据库获取KD-1的三维（3D）结构，从RCSB蛋白质数据库获取由蛋白质数据库（PDB）编号为3PY3标识的MAPK14的三维结构。使用AutoDock v1.5.6软件进行分子对接及结果处理，并使用PyMOL v2.4.0软件对结果进行可视化展示。结合能阈值小于-5 kcal∙mol-1被认为具有高结合活性和结合效率。

2.16 随机、双盲和安慰剂对照试验

2.16.1 患者

2021年10月23日至2022年9月6日，广州医科大学附属第一医院筛选并招募入组了102例COVID-19患者。入选标准包括：①鼻咽拭子SARS-CoV-2 RT-PCR检测呈阳性；②年龄在18~65岁之间；③腋温在37.5 ℃以上（发热在24 h内出现，持续时间≤ 72 h）；④胸部影像学检查证实为肺炎。本研究遵循《赫尔辛基宣言》和药物临床试验质量管理规范（good clinical practice）指南，并获得广州医科大学附属第一医院伦理委员会批准[EC-2021-037(YW)-01]。研究收集了基线数据[如年龄、性别、种族、体重指数（BMI）、体温、临床症状、病毒株和COVID-19疫苗接种状况]。

2.16.2 研究治疗方案

KD-1胶囊和安慰剂由大连富生天然药物开发有限公司生产。使用SAS 9.4软件通过分层区组随机化方法以1∶1的比例将患者随机分组，分别接受4粒KD-1胶囊（每粒50 mg）或安慰剂治疗，每日口服3次，疗程14天。在整个随访过程中，每天记录临床症状并进行评分。

2.16.3 疗效评估

主要终点是14天内主要临床症状的缓解率，定义为腋温在37 ℃以下、无咳嗽且疲劳评分小于1分，且全天症状稳定。次要终点包括：体温恢复正常后发热的复发率、14天内呼吸道症状缓解率与缓解时间、所有临床症状的缓解率与缓解时间、咳嗽/疲劳/鼻塞/咽痛/咽干症状缓解时间、14天内病毒核酸阴性率与时间、第2天鼻咽拭子中SARS-CoV-2病毒载量的变化、继发感染发生率以及全因死亡率。

2.16.4 临床症状和血浆炎症因子浓度分析

选取13名患者进行4个时间点的随访：筛选期、第3天（D3）、第7天（D7）和末次给药时。记录筛选和随访期间的基线特征、临床症状及其评分。采用Kruskal-Wallis H检验来比较和评估治疗后临床症状评分的改善情况。使用Bio-Plex检测在上述4个时间点测量血浆炎症标志物的水平。

2.17 统计分析

结果以平均值±标准差（SD）表示。所有数据均为至少三次独立实验的平均值。使用SPSS v19.0软件进行单因素方差分析（ANOVA）以开展统计分析。组间差异采用单因素方差分析，随后进行Tukey显著性差异检验。对于非正态分布数据，则采用Wilcoxon秩和检验。计数数据以百分比表示，组间比较采用卡方（χ2）检验。P小于0.05被认为具有统计学意义。

3 结果

3.1 确定并验证P38 MAPK通路是SARS-CoV-2感染的主要炎症机制

3.1.1 COVID-19患者MAPK通路基因表达的改变和免疫学特征

为了研究COVID-19患者的MAPK通路基因表达，我们分析了GSE217948数据集中的298个MAPK相关基因。PCA显示，在健康人群、中度和重度COVID-19病例之间存在显著的个体间差异和明显的聚类现象[图1（a）]。与健康对照组相比，在中度COVID-19患者中鉴定出了12个DEGs，其中5个下调，7个上调[图1（b）]。在重度病例中，基因表达谱显示出更显著的变化，有61个DEGs，包括33个下调基因和28个上调基因[图1（c）]。重度病例中上调的DEGs与细胞增殖增加和趋化因子活性、血管内皮生长因子活性、炎症通路（如MAPK和PI3K信号通路）的激活有关。相反，下调的DEGs与钙离子通道活性降低、多细胞发育过程受抑制以及膜蛋白活性下降有关[图1（d）和（e）]。这些发现支持了COVID-19患者病情进展可能受MAPK通路改变影响这一假设。

为了进一步研究MAPK通路基因与免疫图谱之间的关系，我们使用了CIBERSORT工具。在重症患者的微环境中，中性粒细胞、活化的肥大细胞、活化的树突状细胞、M0巨噬细胞、γδT细胞、活化的CD4记忆T细胞和浆细胞等免疫细胞显著富集。相比之下，中度病例中活化树突状细胞、M0巨噬细胞、单核细胞、休眠状态的自然杀伤（NK）细胞和活化CD4记忆T细胞浓度较高[图2（a）]。特定的MAPK通路基因（包括MAP3K14和MAP4K1）以及PI3K/AKT通路、钙离子调节和信号传导基因与免疫细胞（如静息NK细胞、单核细胞和活化的CD4记忆T细胞）呈正相关。

相反，与P38通路[如MAP2K6、MAPK1和MAPK相互作用的丝氨酸/苏氨酸激酶1（MKNK1）]、细胞应激反应、DNA损伤修复（GADD45A家族）和炎症介质（IL1家族）相关的基因与中性粒细胞、M0巨噬细胞、活化树突状细胞、γδT细胞和活化肥大细胞呈正相关。使用Cytoscape工具对数据进行可视化后，在限定标准下[P < 0.05，通路预测置信度（|PPC|）> 0.3]，结果显示，MAPK14、MAP4K1、MKNK1等可以调节免疫细胞类型（degree > 10）。MAPK14、MKNK1、双特异性磷酸酶1（DUSP1）、细胞分裂周期25B（CDC25B）、FMS样酪氨酸激酶3配体（FLT3LG）、RNA聚合酶II相关蛋白2（RPAS2）和热休克70 kDa蛋白6（HSPA6）与P38通路激活、炎症介质[包括TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和IL-8]的表达显著相关[图2（b）和（c）]。这些发现凸显了MAPK通路相关基因（尤其是参与P38 MAPK信号通路的基因）在调节COVID-19免疫反应中的作用。

3.1.2 COVID-19严重程度与MAPK通路基因表达/炎症因子的相关性

应用逐步线性回归、岭回归和ROC分析（AUC > 0.7）来确定与疾病严重程度相关的MAPK通路DEGs。这些方法分别发现了19个、11个和16个与疾病严重程度评分密切相关的基因（P < 0.05）[图3（a）~（c）]。综合结果后，得到32个关键基因，并据此构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。利用Cytoscape的cytoHubba插件确定了10个核心基因（按度数排名前10）：MAPK14、胰岛素样生长因子1（IGF1）、肝细胞生长因子（HGF）、电压门控钙通道辅助亚基β4（CACNB4）、FMS样受体酪氨酸激酶3（FLT3）、间充质-上皮转化因子（MET）、环磷腺苷（cAMP）依赖性蛋白激酶催化亚基β（PRKACB）、成纤维细胞生长因子8（FGF8）、成纤维细胞生长因子9（FGF9）和电压门控钙通道辅助亚基γ6（CACNG6）[图3（d）]。这些发现表明，疾病严重程度可能与MAPK通路基因（尤其是MAPK14）的变化有关。为了进一步阐明炎症因子与疾病严重程度之间的关系，我们在GSE217948数据集上使用了3种机器学习方法来识别与疾病严重程度相关的细胞因子，并参考Yuan等[22]的研究，确定了在病毒感染中常见的上调细胞因子子集。这种方法确定了27种与疾病严重程度相关的细胞因子，包括IL-6、IL-10、趋化因子配体2（CCL-2）、CCL-4、CCL-5和趋化因子（C-X-C基序）配体9（CXCL-9）[图3（e）~（h）]。结果突出表明，IL-6、IL-10和相关炎症标志物是COVID-19严重程度的潜在指标。

3.1.3 COVID-19感染中MAPK通路基因表达与炎症变量之间的关系

为了证实MAPK通路基因表达变化与体外感染SARS-CoV-2之间的密切联系，我们进行了转录分析。PCA显示，COVID-19和对照组之间存在明显的分组聚类现象以及个体差异[图4（a）]。筛选DEGs并进行KEGG富集和GSEA分析显示，感染后MAPK通路显著上调[图4（b）]，这与GSE217948数据集的结果一致。这些体外结果初步证实了SARS-CoV-2感染与MAPK通路基因表达改变之间的联系。为了进一步探究不同疾病严重程度下P38 MAPK通路的变化和相关炎症因子情况，本文在体外使用不同滴度病毒感染细胞，以模拟疾病进展过程[图4（c）和（d）]。P38 MAPK通路的激活程度与感染严重程度成正比，同时，与感染相关的炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8和γ干扰素诱导蛋白10（IP-10）也随之增加。研究结果表明，轻度、中度和重度感染会通过P38 MAPK通路触发和调节炎症反应。

3.2 KD-1通过调节P38 MAPK通路发挥抗炎作用

3.2.1 KD-1在轻度至中度COVID-19患者中的临床疗效和安全性

根据排除标准，102名轻度至中度COVID-19患者被纳入随机、双盲、安慰剂对照临床试验。参与者被分配到KD-1治疗组（n = 52）或安慰剂组（n = 50），最终有100名患者接受了干预治疗（KD-1组52名，安慰剂组48名）。两组患者的基线人口统计学和临床特征无明显差异（附录A表S2）。在为期14天的研究期间，系统地收集了主要和次要疗效指标。主要终点（临床症状缓解率）在治疗开始后14天内使用全分析集进行评估。虽然14天内的主要疗效指标（症状缓解率）显示KD-1组和安慰剂组之间没有显著差异[图5（a）]，但KD-1治疗显著改善了特定的呼吸道症状。14天后，KD-1组呼吸道症状缓解率显著高于安慰剂组（57.7% vs 37.0%, P < 0.05），症状缓解的中位时间缩短（6.33 d vs 未定义，P < 0.05）[图5（b）]。进一步分析表明，KD-1治疗可使疲劳持续时间缩短约2天（P < 0.05），流鼻涕和咽痛/咽干持续时间分别缩短了2.86天和2.60天[图5（c）]。附录A表S3总结了安全性结果，表明参与者对KD-1的耐受性良好，KD-1组未发生严重不良事件，因不良反应而退出研究的比例较低（1.9%），与安慰剂组相当。总体而言，本实验表明KD-1是一种有效且安全的干预措施，可缓解轻度至中度COVID-19患者的呼吸道症状和疲劳情况。

3.2.2 血浆炎症标志物与症状之间的关联性及KD-1对炎症因子表达的调节作用

为了评估KD-1治疗与康复之间的关系，本研究对13名患者在4个时间点进行了分析，分别是筛选期、D3、D7以及治疗的最后一天。使用Kruskal-Wallis H检验评估临床症状的改善情况，并采用Bio-plex检测定量测定血浆炎症标志物。附录A中的表S4和表S5列出了这13名患者在筛选期的基线特征和临床症状评分改善情况，以及在用药期间的改善情况。KD-1治疗显著减轻了鼻塞、喉咙痛、咳嗽、疲劳、肌肉酸痛、头痛、发冷、发热和恶心等症状，而呼吸急促、呕吐和腹泻等症状的改善则不明显（附录A表S5）。为了探究临床症状与炎症因子表达之间的关系，我们分析了4个时间点的症状评分与炎症标志物水平之间的相关性。基于之前的研究结果（第3.1.4节）以及现有文献，本研究选择了粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子2（CSF-2）、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17、IP-10、CCL-2、CCL-4、TNF-α、血管内皮生长因子α（VEGF-α）和IL-18，并测量了它们在血浆中的水平。逐步线性回归分析发现，症状评分与IP-10、IL-10、CSF-2和CCL-2的水平之间存在显著相关性（所有P < 0.01）[图6（a）]。进一步的Pearson和Spearman相关性分析确定了特定的关联，结果显示IP-10与头痛呈正相关，IL-6和IP-10与发热、发冷和疲劳呈正相关，CCL-2与发热呈正相关，而IL-10与喉咙痛的严重程度呈负相关（|PPC| < 0.3, P < 0.05）[图6（b）]。这些数据表明，患者的症状（如发热、头痛和疲劳）与血浆中炎症标志物（特别是IP-10和IL-6）之间存在关联。箱式图分析进一步表明，KD-1治疗显著降低了血浆中IL-6和IP-10的水平（P < 0.05）[图6（c）]，这表明KD-1可有效下调这些标记物的水平，与症状的缓解相关。

3.2.3 KD-1在体外和体内模型中均具有抗SARS-CoV-2及抗炎特性

本研究分别在体外和体内对KD-1的抗SARS-CoV-2和抗炎作用进行了评估。在Vero E6细胞中，KD-1抑制病毒复制的IC50值为419.5 μmol∙L-1，且以剂量依赖的方式减少病毒噬斑形成[图7（a）和（b）]。在感染病毒的小鼠中，KD-1提高了小鼠存活率（80 mg∙kg-1时存活率为57.12%，40 mg∙kg-1时为42.86%），降低了肺部病毒滴度，并改善了肺部病理状况[图7（c）~（e））。受感染的Calu3细胞和接受KD-1治疗的小鼠体内与炎症相关的mRNA水平（IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1和TNF-α）均有所下降[图8（a）和（b）]。KD-1治疗还降低了体外磷酸化P38蛋白和体内P38抗原表达水平[图8（c）和（d）]，这表明KD-1通过抑制P38 MAPK通路蛋白和相关炎症因子表达，来减轻SARS-CoV-2诱导的炎症反应。此外，SARS-CoV-2感染会使Calu3细胞中IL-6、IL-8、IP-10、MCP-1和TNF-α的mRNA水平上调，而KD-1则以剂量依赖的方式（233.75 μmol∙L-1、467.50 μmol∙L-1和935.00 μmol∙L-1）显著下调这些标志物的表达水平。在感染病毒的小鼠体内，40 mg∙kg-1和80 mg∙kg-1剂量的KD-1可显著降低TNF-α、IL-1β、IL-6和IP-10的mRNA水平。蛋白质印迹分析证实，KD-1（935.00 μmol∙L-1）可降低体外磷酸化P38蛋白水平；免疫组化结果显示，在40 mg∙kg-1和80 mg∙kg-1的剂量下，体内P38抗原表达减少。这些结果表明，KD-1通过抑制P38 MAPK信号通路来减轻SARS-CoV-2诱导的炎症，从而降低体外和体内的炎症标志物IP-10、TNF-α、IL-6和IL-8水平。

3.2.4 SARS-CoV-2刺突蛋白介导的P38通路激活及KD-1的抗炎作用

图9显示，在被SARS-CoV-2刺突蛋白感染的THP-1细胞中，KD-1处理显著降低了磷酸化P38（P-P38）的水平，并抑制了炎症因子（IL-6、IL-8、IL-10、IP-10、MCP-1和CCL-5）的过度表达[图9（a）和（b）]。同样，在LPS诱导的模型中，KD-1抑制了P-P38蛋白表达，并降低了炎症标志物（IL-6、IP-10、TNF-α和MCP-1）的水平[图9（c）和（d）]。这些研究结果表明，KD-1通过直接阻断刺突蛋白或LPS诱导的P38通路激活来阻断与SARS-CoV-2相关的炎症，从而减轻促炎因子的过度表达。

3.2.5 分子对接和体外过表达研究揭示KD-1通过P38通路发挥抗炎作用并缓解症状

我们进一步研究了P38通路与KD-1对SARS-CoV-2复制和炎症的抑制作用之间的关系。分子对接研究显示，KD-1与MAPK14（P38）的结合能为-8.9 kJ∙mol-1，表明这两者之间存在良好的相互作用。KD-1与MAPK-14的ARG-5、PHE-90和ILE-346形成疏水相互作用，与GLN-3和GLU-4形成氢键，并与ARG-23和LYS-45形成盐桥[图10（a）]。这表明KD-1可能通过调节P38通路来抑制SARS-CoV-2。为了进一步阐明KD-1如何缓解临床症状和减轻炎症，我们构建了MAPK14的过表达质粒并将其转染到Calu3细胞中。结果显示，KD-1（500 μg∙mL-1）和P38抑制剂（10 μmol∙L-1）都显著降低了过表达细胞中的P-P38和相关炎症标志物（IL-6、IL-8、IP-10和TNF-α）的表达水平[图10（b）和（c）]。值得注意的是，与P38抑制剂相比，KD-1对P-P38表达的抑制作用更强。在感染SARS-CoV-2后，KD-1和P38抑制剂均能有效抑制P-P38蛋白和相关炎症因子的表达增加，而KD-1表现出更优的抑制效果[图10（d）和（e）]。这些发现表明，KD-1下调了P38通路中的关键蛋白P-P38，从而防止下游炎症因子的过度表达。

4 讨论

COVID-19的变异株（如Omicron毒株）传播速度极快，给疫情的防控工作带来了巨大挑战。深入了解COVID-19患者体内促炎性介质释放的关键机制，对于指导该疾病的治疗策略至关重要。

病毒的感染与复制会激活致病性1型辅助性T细胞（Th1），促使其分泌IL-6和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等促炎性细胞因子。随后，GM-CSF会刺激CD14+ CD16+炎性单核细胞，使其释放出更多的IL-6、TNF-α等细胞因子[23]。这些细胞因子能够通过激活细胞内的MAPK通路等途径，进一步引发更多促炎性介质的产生。这可能会对气道上皮细胞造成损害，进而导致通气功能障碍和急性肺损伤[24]。本研究通过对临床数据的分析发现，与健康人相比，中重度COVID-19患者的MAPK基因表达表现出明显的群体偏倚性聚集，尤其是在重症患者中更为显著。在观察到MAPK通路发生改变的同时，与细胞生长、黏附和免疫相关的炎症因子对细胞运动产生了显著影响，其增强了趋化因子和血管内皮生长因子的活性，从而引发了炎症反应。此外，我们还发现，MAP4K1主要参与JNK通路的激活，对P38或ERK通路的影响极小；而MAP3K14编码核因子κB（NF-κB）诱导激酶（NIK），主要参与非经典的NF-κB信号通路[25‒26]。

回归分析显示，在感染和未感染患者中，DEGs的表达（尤其是与P38通路相关的基因表达）与疾病的临床严重程度密切相关。受试者ROC曲线分析确定了16个具有诊断意义的关键基因（AUC > 0.7），其中包括IGF1、MAPK14、MET和VEGFA。值得注意的是，MAPK14编码P38α蛋白，该蛋白是P38信号通路的关键组成部分，负责调节TNF-α、IL-1和IL-6等炎性细胞因子的释放[27]。已知IGF1能够激活依赖P38的Janus激酶-信号转导和转录激活因子1（JAK-STAT1）轴，而VEGF可通过增加磷酸化来增强炎症反应并促进P38激活[28‒29]。P38通路的激活程度与COVID-19的严重程度相关，P38通路的激活可能会引发炎症细胞因子风暴。此外，我们利用GSE217948数据集进对临床炎症因子与疾病严重程度进行了相关性分析。结果显示，IL-6、IL-10、CCL-2、CCL-4、CCL-5、CXCL-9等细胞因子与疾病严重程度显著相关。IL-6作为一种与发热相关的经典炎症标志物，已被确定为重症SARS-CoV-2肺炎进展的生物标志物[27]。我们的研究发现，感染SARS-CoV-2的患者体内IL-6水平显著升高。为了进行初步验证，我们进行了转录组分析，结果显示SARS-CoV-2感染后，细胞内与MAPK通路相关的基因显著上调，这一观察结果与GSE217948数据集的数据一致。此外，我们还发现，在感染不同滴度病毒的细胞中，无论病毒载量如何，P38通路均保持激活状态。与此同时，TNF-α、IL-6、IL-8和IP-10等炎症因子增多，这表明P38通路在COVID-19患者的炎症反应中起着关键作用。

传统中药因其性质温和、副作用小以及抗药性潜力大，为P38抑制剂的开发提供了极具前景的方向。KD-1在缓解呼吸道病毒性炎症方面已显示出令人鼓舞的效果，且在临床上具有解热和抗炎特性。先前的研究表明，KD-1在体外可减轻由SARS-CoV-2野生型毒株感染引发的炎症，但具体机制仍不清楚[18]。我们开展了一项涉及102名参与者的小规模临床试验，以研究KD-1在轻度至中度COVID-19患者中的安全性和有效性。结果表明，连续14天服用KD-1胶囊可缓解疲劳、流鼻涕等临床呼吸道症状，且副作用不明显，这表明KD-1对于COVID-19患者来说是一个相对安全的选择。为了进一步探究临床症状与血浆中炎症因子表达之间的关系，我们分析了13名患者在4个阶段（筛选期、D3、D7以及末次给药）的样本。结果显示，头痛与IL-6和IP-10表达呈正相关，发热与IP-10和CCL-2（MCP-1）呈正相关，乏力、寒颤、恶心与IP-10表达呈正相关；相反，咽喉痛与IL-10表达呈负相关（|PPC| < 0.3, P < 0.05）。这表明，除了IL-10外，临床症状评分越高，疾病越严重，炎症因子的表达水平也越高，反之亦然。随着KD-1治疗的推进，炎症因子的表达逐渐降低，临床症状也相应得到缓解。

临床症状与炎症因子的表达密切相关。冠状病毒可能会诱导外周神经系统和中枢神经系统中的神经元过度兴奋，通过持续的炎症反应或细胞因子的过度激活而引发疼痛[30‒32]。IL-6是病理性疼痛的关键调节因子，它的合成可直接使伤害感受器敏感化，从而导致身体不适。除了刺激P38通路外，IL-6还能激活脑膜传入神经和三叉神经尾侧核。P38抑制剂可有效减轻这一级联反应引发的疼痛[33]。我们的研究揭示了与COVID-19相关的疼痛与P38和IL-6的存在密切相关。此外，我们还发现头痛的发生与IL-6和IP-10的表达之间存在显著关联[34]。在重症COVID-19病例中，出现胃肠道症状的患者外周细胞因子水平显著升高，尤其是IL-6 [35]。血清中IL-6的存在也与恶心感相关。越来越多的证据表明，疲劳可能是过度抗炎反应的结果[36]。此外，IP-10的表达与COVID-19患者头痛和疲劳的严重程度高度相关[37]。

基于箱式图分析，这些初步研究结果表明，KD-1可有效降低与SARS-CoV-2感染相关的炎症标志物水平，并缓解相关症状，包括头痛、疲劳和恶心。进一步分析显示，炎症因子的产生与P38通路密切相关，P38通路的激活会使IL-6、IL-1β和TNF-α的表达水平升高，从而加剧SARS-CoV-2感染引发的炎症反应[10]。P38通路还会影响COVID-19患者体内各种微小核糖核酸（miRNA）或长链非编码核糖核酸（lncRNA）以及相关转录因子的表达，而这些转录因子对于介导无菌性炎症、巨噬细胞成熟、促炎症编程和M2/Th2极化至关重要[11]。发热、头痛和疲劳等临床症状与P38通路所调控的失调性炎症反应密切相关。因此，抑制P38通路可能会减缓疾病的进展。

为了阐明KD-1的抗炎作用与其在P38通路中的作用之间的关系，我们利用体内和体外模型来评估KD-1对SARS-CoV-2变异株的疗效及其抗炎特性。结果表明，KD-1能有效抑制SARS-CoV-2的感染和复制，降低炎症标志物水平并改善肺部病理状况。在先前研究的基础发现KD-1可抑制SARS-CoV-2及其变异株的传播，并减轻两种模型环境下的炎症反应。具体而言，KD-1能显著降低IL-6、IL-8、IP-10和TNF-α的表达水平，并减少P38通路中的蛋白表达，这表明P38通路的调节与KD-1在减轻COVID-19相关炎症中的作用密切相关。

为了确定KD-1对SARS-CoV-2的抗炎作用是否与刺突蛋白感染激活P38 MAPK通路有关，我们用刺突蛋白或LPS处理THP-1/RAW264.7细胞，然后给予KD-1干预治疗。LPS激活的P38 MAPK通路已被广泛证实，LPS感染的RAW264.7细胞是研究P38通路激活的标准模型[38]。SARS-CoV-2的刺突蛋白对受体识别和膜融合至关重要，它由两个亚基组成，即刺突蛋白的S1亚基（S1）和刺突蛋白的S2亚基（S2）。S1亚基的受体结合域（N端域和C端域）与宿主受体血管紧张素转换酶2（hACE2）结合，促进病毒进入宿主细胞，尤其是上皮细胞。先前的研究表明，SARS-CoV-2的S1刺突蛋白可诱导人单核细胞中与COVID-19相关的细胞因子分泌[39]。此外，它还能激活P38激酶，通过Toll样受体4触发IL-1和TNF-α的产生[40]。

我们的研究显示，刺突蛋白感染的THP-1细胞和LPS感染的RAW264.7细胞均会上调细胞内P38蛋白磷酸化，并刺激下游炎症因子（IL-6、IL-8、IL-10、IP-10、MCP-1和CCL-5）的表达。这两种模型表明，KD-1治疗可有效减少P-P38蛋白的表达，并减轻相关炎症因子的过度产生。这些研究结果表明，KD-1可通过直接抑制刺突蛋白诱导的P38通路激活，来抑制SARS-CoV-2感染引发的炎症过程。

此外，我们还对KD-1与MAPK14（3PY3）进行了分子对接分析，结果表明两者通过疏水作用力、氢键和盐桥相互作用[图10（a）]。此外，我们还构建了一个研究KD-1如何通过干扰P38通路来减轻临床症状并发挥抗炎作用的模型。我们选择构建MAPK14过表达模型，因为MAPK14编码P38α蛋白，该蛋白是抗炎和促炎细胞因子的关键调节因子，在人体细胞中广泛表达[41]。BIRB是一种强效的P38抑制剂，具有较低的解离常数（Kd = 0.046 nmol∙L-1），已被证明能够抑制人血浆中LPS刺激的THP-1细胞产生炎性细胞因子[42]。因此，我们在体外研究中使用了BIRB作为阳性对照。

当MAPK14水平升高或存在SARS-CoV-2时，KD-1能显著降低P-P38蛋白表达水平以及下游炎症因子的过表达。值得注意的是，KD-1的抑制作用超过了BIRB单独抑制P38的效果。这表明KD-1可减轻与P38通路激活相关的炎症成分的上调，从而在SARS-CoV-2感染期间发挥抗炎作用。最终，临床应用KD-1可缓解发热、咳嗽、疲劳等症状和其他相关表现，同时缩短病程。其抗炎机制包括限制P38通路中关键蛋白的产生，从而防止IL-6、IL-8、IP-10和TNF-α等炎症因子的过度释放，有助于减轻肺部炎症并改善临床预后。

5 结论

总之，本研究证实了MAPK通路基因的表达与对SARS-CoV-2的易感性和疾病的严重程度之间存在紧密且正向的关联。这种关系已通过临床数据库分析、体外实验和临床数据得到了验证。P38通路的激活与SARS-CoV-2的感染和病情进展密切相关，而炎症标志物IL-6和IP-10的存在与疲劳、发热和咳嗽等临床症状相关。实验结果表明，使用KD-1治疗可以缩短病程，并缓解疲劳、鼻塞和流涕等症状，同时降低IL-6和IP-10的水平，减轻肺部炎症。值得注意的是，这些症状的缓解与KD-1对P38通路的抑制有关。因此，KD-1通过阻断P38通路的激活，显示出作为治疗SARS-CoV-2感染及相关炎症药物的潜力。

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