雷公藤甲素-美迪紫檀素联合用药通过抑制METTL3-YTHDF1轴减轻类风湿关节炎骨破坏的协同作用

王晨然 ,  谭霖 ,  黄茂华 ,  林宇宁 ,  蔡明详 ,  邓丽娟 ,  胡欣朋 ,  邱胜辉 ,  陈晓婷 ,  张益铭 ,  罗小美 ,  史长征 ,  陈敏锋 ,  叶文才 ,  张君秋 ,  张冬梅 ,  刘湘宁 ,  焦谊 ,  王朝冉 ,  刁文雅 ,  耿其顺 ,  王星 ,  曹晓雪 ,  石彤 ,  徐加和 ,  赵璐 ,  王子涵 ,  邓甜甜 ,  杨磊 ,  邓婷婷 ,  肖诚

Engineering ›› 2025, Vol. 48 ›› Issue (5) : 277 -291.

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Engineering ›› 2025, Vol. 48 ›› Issue (5) : 277 -291. DOI: 10.1016/j.eng.2025.03.014
研究论文

雷公藤甲素-美迪紫檀素联合用药通过抑制METTL3-YTHDF1轴减轻类风湿关节炎骨破坏的协同作用

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Increased Alleviation of Bone Destruction in Individuals with Rheumatoid Arthritis via the Coinhibition of the METTL3 and YTHDF1 Axis by the Combination of Triptolide and Medicarpin

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摘要

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种进行性自身免疫性疾病，骨破坏是其主要的病理特征之一，主要由破骨细胞（osteoclasts, OCs）的过度激活引起，因此OCs是关键的治疗靶点。雷公藤甲素（triptolide, TP）具有显著的抗RA作用，但治疗窗窄和相关毒性限制了其临床应用，因此亟须与其他药物联用以达到减毒增效的目的。美迪紫檀素（medicarpin, Med）是一种具有抗炎和抗骨破坏特性的黄酮类化合物，已显示出抑制破骨细胞生成的潜力。然而，TP和Med联用治疗RA的协同作用机制尚不清楚。为探究此问题，我们在胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis, CIA）大鼠模型中评估了TP、Med及其联用的治疗效果，并将骨侵蚀作为研究重点。同时，在体外OCs分化模型中进行实验验证，以评估各治疗方式对OCs形成及功能的影响。基于RA患者的聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）芯片数据，我们进一步聚焦于N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine, m6A）甲基化及其调控因子，鉴定出甲基转移酶样蛋白3（methyltransferase-like 3, METTL3）和YT521-B同源性结构域家族蛋白1（YT521-B homology domain family protein 1, YTHDF1）可能是TP与Med的作用靶点。研究结果表明，低剂量的TP与Med联用即可显著缓解骨破坏，并抑制OCs分化，其效应强于单药作用。就机制而言，TP与Med协同调控METTL3和YTHDF1，经m6A甲基化通路联合抑制OCs生成，进而减轻RA相关的骨破坏。综上，本研究揭示了m6A修饰在TP与Med联合治疗RA中的重要作用，并为中药活性成分的联合应用提供了理论依据，具有潜在的临床转化价值。

Abstract

Rheumatoid arthritis (RA) is a progressive autoimmune disease characterized by bone destruction that is primarily caused by the overactivation of osteoclasts (OCs), which are critical therapeutic targets. Triptolide (TP) has strong anti-RA effects but is limited by its narrow therapeutic window and associated toxicity, necessitating combination therapy to increase its efficacy and reduce side effects. Medicarpin (Med), a flavonoid with anti-inflammatory and anti-bone destruction properties, has shown potential in reducing osteoclastogenesis. However, the mechanisms underlying the synergistic effects of TP and Med on RA treatment remain unclear. We addressed this issue by evaluating the effects of TP, Med, and their combination on a collagen-induced arthritis (CIA) rat model, with a focus on bone erosion as the primary research endpoint. We subsequently performed experimental validation in an in vitro OC differentiation model to assess the impacts of these treatments on OC formation and function. Based on polymerase chain reaction (PCR) microarray data from RA patients, further investigations focused on N6-methyladenosine (m6A) methylation and its regulatory factors, methyltransferase-like 3 (METTL3) and YT521-B homology domain family protein 1 (YTHDF1), which have been identified as potential targets of TP and Med. Key findings revealed that the TP and Med combination significantly alleviated bone destruction and inhibited OC differentiation, exerting stronger effects at lower doses than either drug alone. Mechanistically, TP and Med synergistically modulated METTL3 and YTHDF1 to suppress osteoclastogenesis through distinct m6A methylation pathways, contributing to the mitigation of RA-associated bone destruction. Overall, our data highlight the potential of the m6A modification as a therapeutic mechanism for the combined use of TP and Med for RA treatment, providing a theoretical basis for the clinical application of herbal active ingredient combinations.

关键词

雷公藤甲素 / 美迪紫檀素 / 破骨细胞 / 类风湿关节炎 / 甲基转移酶样蛋白3 / YT521-B同源性结构域家族蛋白1

Key words

Triptolide / Medicarpin / Osteoclast / Rheumatoid arthritis / Methyltransferase-like 3 / YT521-B homology domain family protein 1

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王晨然,谭霖,黄茂华,林宇宁,蔡明详,邓丽娟,胡欣朋,邱胜辉,陈晓婷,张益铭,罗小美,史长征,陈敏锋,叶文才,张君秋,张冬梅,刘湘宁,焦谊,王朝冉,刁文雅,耿其顺,王星,曹晓雪,石彤,徐加和,赵璐,王子涵,邓甜甜,杨磊,邓婷婷,肖诚. 雷公藤甲素-美迪紫檀素联合用药通过抑制METTL3-YTHDF1轴减轻类风湿关节炎骨破坏的协同作用[J]. 工程（英文）, 2025, 48(5): 277-291 DOI:10.1016/j.eng.2025.03.014

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1 引言

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）影响着全球约0.5%~1%的人口，其主要特征为关节的炎症反应和骨破坏，最终可导致关节畸形及功能丧失[1‒2]。据报道，超过60%的RA患者在发病2年内即出现骨侵蚀，而骨侵蚀性损伤是决定患者长期功能预后的关键因素之一[3]。随着改善病情的抗风湿药（disease-modifying antirheumatic drugs, DMARDs）不断发展，RA患者的症状预防与缓解已取得显著成效。然而，这些药物往往难以逆转既有的关节破坏。即便采用如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）或白细胞介素-6受体（interleukin-6 receptor, IL-6R）阻断等强效抗炎治疗策略，骨侵蚀修复的效果仍十分有限[4‒5]。相比之下，尽管破骨细胞（osteoclasts, OCs）过度生成和（或）活性增强在骨吸收过程中发挥病理作用，但直接针对OCs的治疗策略却较少受到关注[6]。当前虽有部分治疗药物可通过抑制OCs介导的骨吸收来治疗关节破坏，但常伴有严重的不良反应，如卒中、股骨非典型性骨折及下颌骨坏死等[7‒8]。这些临床挑战凸显出我们对RA相关骨侵蚀机制（尤其是调控OCs生成、分化及骨吸收的分子和细胞通路）的认识仍不充分。因此，将治疗重点从传统的以抑制炎症为中心的策略，转向关注骨细胞生物学的治疗方法，有望为干预RA患者中OCs介导的局灶性关节破坏提供新的治疗方向。

N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine, m6A）甲基化是一种表观遗传修饰，也是最常见的RNA甲基化形式之一，在调控RA成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes, FLSs）和免疫细胞的功能中发挥着关键作用[9‒11]。m6A甲基化主要由甲基转移酶样3（methyltransferase-like 3, METTL3）/METTL14/Wilms肿瘤1相关蛋白（Wilms tumor 1-associated protein, WTAP）甲基转移酶复合物调控，并可被去甲基化酶脂肪和肥胖蛋白（fat mass and obesity-associated protein, FTO）及ALK同系物5（AlkB homolog 5, ALKBH5）所逆转。该修饰由m6A识别蛋白识别，包括YT521-B同源性（YT521-B homology, YTH）家族成员[YTH结构域家族蛋白1（YTH domain family protein 1, YTHDF1）、YTHDF2、YTHDF3、含YTH结构域蛋白1（YTH domain containing protein 1, YTHDC1）和YTHDC2]以及胰岛素样生长因子2结合蛋白（insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein, IGF2BP）家族（IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3），可调控RNA的稳定性、转录、翻译及降解等过程，从而在多种细胞功能中发挥核心作用[12‒13]。既往研究发现，RA患者的FLSs中ALKBH5表达升高，可通过调节胆固醇-25-羟化酶（cholesterol-25-hydroxylase, CH25H）的m6A修饰促进滑膜侵袭及炎症反应[14]。多种机器学习方法已证实IGF2BP3可调控G2/M期转换，促进RA-FLSs增殖，并影响M1型巨噬细胞极化，提示其有望成为RA诊断的潜在标志物[13]。此外，研究还发现甲基转移酶METTL14可促进FLSs的迁移与侵袭，并增强TNF-α诱导的炎症反应[15]。在RA患者的外周血单个核细胞（periphral blood mononuclear cells, PBMCs）中，METTL14及m6A水平均降低，且与28关节疾病活动度评分（disease activity score according to a 28 joint count, DAS28）呈负相关[11]。近年来，关于m6A修饰在OCs中的作用的报道也逐渐增多。在原代骨髓单个核细胞和RAW264.7细胞中，敲除METTL3可抑制OCs特异性基因（如Nfatc1、c-Fos、Ctsk和Dc-stamp）的表达。METTL3敲除可通过YTHDF2上调Atp6v0d2 mRNA的表达与稳定性，从而形成核多但骨吸收能力下降的巨大多核OCs [16]。在RAW264.7细胞中，METTL14通过甲基化NFATc1的特定位点调控OCs介导的骨吸收，随着m6A水平的升高，YTHDF1与YTHDF2在Nfatc1的转录后调控中表现出拮抗作用[17]。最新研究表明，m6A修饰广泛存在于RA发病相关的关键细胞类型中，调控这些细胞的功能并促进疾病进展。然而，关于OCs中m6A修饰的研究仍较为有限，且多数研究对其调控RA相关骨侵蚀的探讨较为间接。因此，深入研究m6A在OCs分化与功能中的调控作用，将有助于揭示RA相关骨侵蚀的机制，并推动新型治疗靶点的发现。

联合治疗是一种新型的RA治疗策略，药物之间的协同作用可进一步增强疗效，发挥互补优势[18]。以中药单体（中药活性成分）为代表的组合应用具有良好发展前景[19‒20]。作为基础治疗药物，雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. f., TwHF）是治疗RA非常有效且关键的中药，常单用或与甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）联用[21]。然而，TwHF过量使用可导致多器官毒性，这限制了其在临床上的广泛应用[22‒23]。因此，越来越多的研究尝试将TwHF与其他药物联用，以弥补其不足[24]。雷公藤甲素（triptolide, TP）是TwHF的主要活性成分之一，已有研究证实其可调控m6A甲基化并抑制OCs分化，从而缓解RA症状[25]。鸡血藤（Spatholobus suberectus Dunn）是一种常用的中药，被认为对RA具有良好的安全性[26]。临床研究显示，鸡血藤与TwHF联用具有协同治疗效果[27]，其活性成分美迪紫檀素（medicarpin, Med）具有抑制OCs分化的作用[28]。初步研究提示，Med不仅可抑制OCs分化，还可增强TP的治疗效果，实现剂量减半从而降低其相关毒性。本研究旨在探讨TP与Med联用治疗RA的协同效应，并筛选其可能作用的m6A甲基化靶点。因此，明确TP与Med联用对OCs生成与分化的抑制作用及其潜在机制，对于缓解RA相关骨侵蚀具有重要的临床意义与研究价值。

本研究分析了TP和Med单独及联合应用对胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis, CIA）大鼠模型的影响，结果发现联合治疗对OCs形成和骨破坏具有显著抑制作用。通过对临床样本中m6A甲基化靶点及药物分子靶标的系统分析，我们筛选出METTL3和YTHDF1是TP与Med发挥协同效应的关键调控因子。进一步的体内外实验均证实，TP与Med联合治疗可通过作用于m6A甲基化相关通路，协同抑制OCs的形成与功能（图1）。本研究为深入理解这两种药物的协同作用机制提供了理论依据和实验支持。

2 材料与方法

2.1 关节炎模型建立与药物处理

50只6~8周龄，平均体重为180~200 g的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠购自国家食品药品监督管理局实验动物中心[许可证号：SCXK（北京）2024-0001]。所有动物在特定病原体清除环境下饲养[温度为(25 ± 2) ℃，湿度为(55 ± 5)%，12 h光照/12 h黑暗]，实验前适应性饲养3天。

适应后，大鼠被随机分为6组：正常对照组、模型对照组、MTX组、TP组、Med组及1/2 TP + 1/2 Med（T + M）联合组。除正常对照组外，其余组大鼠于第1天在尾根一侧皮内注射100 μL牛II型胶原（Chondrex，美国）与弗氏不完全佐剂（IFA; Chondrex）按1∶1比例乳化的混合物进行免疫。第7天在另一侧再次注射50 μL上述乳剂进行加强免疫。实验流程参照文献[29]。本研究共纳入50只大鼠，除去正常组的8只，共42只用于建立CIA模型，其中40只成功建模，建模成功率为95%。

第10天开始，将建模成功的大鼠随机分为5组，并连续口服给药21天：MTX组给予1.5 mg∙kg-1 MTX（MTX片；上海信谊药厂）；TP组给予18.62 μg∙kg-1 TP（B01216；永健药业）[30]；Med组给予2 mg∙kg-1 Med（B01086）；T + M组给予9.31 μg∙kg-1 TP和1 mg∙kg-1 Med；CIA模型组给予0.9%生理盐水（BL158, Biosharp）。所有实验均经中日友好医院临床医学研究所伦理委员会批准（伦理批准号：zryhyy11-23-04-02）。

2.2 关节炎评估

从加强免疫（第7天）和开始给药（第10天）起，每3天记录大鼠体重和后肢关节炎指数（arthritis index, AI）。每条后肢根据炎症程度评分（0~4分）：0分为正常，1分为发红或轻度肿胀，2分为中度肿胀，3分为明显肿胀，4分为畸形或不能使用该肢。第10天评分为0者视为建模失败并予以剔除。实验流程参照文献[31]。

2.3 微型计算机断层扫描

使用SKYSCAN 1174 微型计算机断层扫描（micro-computed tomography, micro-CT；Bruker，比利时）以10.2 μm的分辨率扫描踝关节和膝关节，以评估骨侵蚀情况。使用N-Recon软件进行三维重建，并用CT-AN软件分析骨体积（bone volume, BV）、骨表面积（bone surface, BS）、BS/BV比值以及BV/总体积（total volume, TV）比值，最终用CTvox软件处理图像。

2.4 组织学与免疫组织化学分析

第31天，使用异氟烷气体（瑞沃德生命科技有限公司）麻醉并处死大鼠，分离左侧踝关节与膝关节，用4%多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司）固定1周，再以10% 乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetric acid, EDTA；国药集团）脱钙2个月，制备石蜡切片。切片经苏木精-伊红（hematoxylin and eosin, HE；北京索莱宝科技有限公司）染色，依据炎性细胞浸润、滑膜组织增生、血管翳生成、软骨和骨破坏等情况评分，范围为0~4分。

免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）实验中，切片在99 ℃枸橼酸钠缓冲液中热修复20 min，然后与METTL3（1∶1000稀释，15073-1-AP；武汉三鹰生物技术有限公司）和YTHDF1（1∶1000稀释，17479-1-AP；武汉三鹰生物技术有限公司）一抗于4 ℃孵育过夜，继之加入二抗处理，并用DAB试剂盒（PV-6000D，北京中杉金桥生物技术有限公司）显色。

2.5 酒石酸抗性酸性磷酸酶与异硫氰酸四甲基罗丹明-鬼笔环肽染色

酒石酸抗性酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP）染色按照试剂说明书（387A; Sigma，美国）进行，用以评估OCs形成。异硫氰酸四甲基罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC）-鬼笔环肽（phalloidin）染色用于观察F-肌动蛋白（F-actin）环结构，评估OCs的骨吸收功能（HB221130；翌圣生物科技股份有限公司）。使用3DHISTECH Pannoramic SCAN扫描图像并用Case Viewer和ImageJ分析OCs数量和面积。

2.6 流式细胞术与酶联免疫吸附试验

新鲜脾脏组织经滤器研磨并用70 μm滤网过滤，以去除红细胞。使用荧光素异硫氰酸酯-分化簇4（fluorescein isothiocyanate-cluster of differentiation 4, FITC-CD4）、别藻蓝蛋白（allophycocyanin, APC）-CD25及藻红蛋白-叉头框蛋白P3（phycoerythrin-forkhead box protein P3, PE-FoxP3）抗体（eBioscience，美国）染色调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs），FoxP3抗体染色需经专用缓冲液（FoxP3/转录因子染色缓冲液，eBioscience）固定与通透后进行。使用Beckman流式仪器检测并用FACSDiva软件分析数据。流程参考文献[32]。

血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10与转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）水平使用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒检测（E-EL-R0012、R0015、R2856、R0016、0162；武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）。

2.7 破骨细胞制备

取6~8周龄C57BL/6J小鼠[查士利华微生物应用技术（上海）有限公司]双侧股骨与胫骨，髓腔冲洗所得细胞经70 μm滤网过滤并去除红细胞。用含20 ng∙mL-1 M-CSF（Peprotech，美国）的α-MEM培养过夜，收集悬浮细胞继续培养3天以获得骨髓单核细胞（bone marrow monocytes, BMMs）。诱导OCs时，向培养基中加入50 ng∙mL-1 RANKL（Peprotech）与10 nmol∙L-1 TP和10 μmol∙L-1 Med，培养4~6天，每2天更换一次培养液[33]。

2.8 细胞活力检测

将BMMs接种于96孔板，用0~80 nmol∙L-1 TP和0~80 μmol∙L-1 Med诱导OCs分化5天。然后每孔加入10% 细胞计数试剂盒（cell-counting kit, CCK）-8工作液（GK10001; Glpbio，美国），37 ℃孵育2 h后，用酶标仪（赛默飞世尔科技公司）测量450 nm处吸光度。

2.9 扫描电子显微镜检测

通过扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）对骨吸收陷窝进行成像，首先清洁骨样本去除软组织，样本在磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline, PBS）中用2.5%戊二醛在4 ℃下固定。用导电胶将骨片正面朝上黏在金属台上，喷金处理后置入SEM腔室拍照。骨吸收陷窝面积用ImageJ分析。

2.10 实时荧光定量聚合酶链反应

用Fast Pure细胞/组织总RNA提取试剂盒（RN001；上海奕杉生物科技有限公司）提取总RNA，经NanoDrop 2000分光光度计测定浓度后，使用Evo M-MLV逆转录试剂盒（AG11706；湖南艾科瑞生物工程有限公司）合成互补DNA（complementary DNA, cDNA）。聚合酶链反应使用SYBR Green Pro Taq HS预混定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）试剂盒（AG11701；湖南艾科瑞生物工程有限公司）在QuantStudioTM 5系统上进行。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）为内参，采用2-ΔΔCt法分析相对表达量。引物序列详见表S1。

2.11 蛋白质印迹（western blotting）

将放射免疫沉淀测定（radioimmunoprecipitation assay, RIPA）裂解液（PC101；上海雅酶生物医药科技有限公司）与蛋白酶抑制剂（GRF101；上海雅酶生物医药科技有限公司）按1∶100比例混合进行细胞裂解。裂解液经超声裂解5 min后，在4 ℃下以12 000 r∙min-1离心15 min。蛋白浓度采用二辛可宁酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白定量试剂盒（ZJ101；上海雅酶生物医药科技有限公司）测定，并使用5×十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）蛋白上样缓冲液进行稀释，95 ℃加热5 min变性。等量蛋白样本在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，随后通过湿转法转膜至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride, PVDF）膜。膜以5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，于4 ℃孵育过夜，加入以下一抗：METTL3，YTHDF1，WTAP（1∶2000稀释，10200-1-AP；武汉三鹰生物技术有限公司），IGF2BP1（1∶5000稀释，22803-1-AP；武汉三鹰生物技术有限公司），IGF2BP3（1∶1000稀释，14642-1-AP；武汉三鹰生物技术有限公司），NFATC1（1∶1000稀释，32303；SAB，美国），c-Fos（1∶1000稀释，66590-1-Ig；武汉三鹰生物技术有限公司），CTSK（1∶500稀释，sc-48353；Santa Cruz Biotechnology，美国），DC-STAMP（1∶1000稀释，MABF39-I；Millipore，美国），ATP6V0d2（1∶1000稀释，SAB2103220；Sigma，美国）。膜用Tris缓冲盐溶液（Tris-buffered saline, TBS）-Tween洗涤后，加入相应的二抗孵育，并通过化学发光检测系统显影。

2.12 总m6A甲基化水平检测

比色法：从BMMs中提取总RNA，并使用EpiQuik m6A RNA甲基化定量试剂盒（P-9005; EpiGentek，美国）对200 ng RNA样本中的总m6A水平进行检测，按说明书操作。

m6A点杂交：使用TRIzol试剂（AG21102，湖南艾科瑞生物工程有限公司）提取总RNA，在95 ℃下加热3 min变性后迅速冰浴冷却。将RNA点样于Biodyne尼龙膜（RPN303B; Cytiva，美国），并在254 nm紫外线下交联2 min。采用抗-m6A抗体（ab284130; Abcam，英国）进行免疫印迹检测。

2.13 RNA免疫沉淀-qPCR

RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation, RIP）-qPCR操作参照RIP试剂盒（广州伯信生物科技有限公司）说明书进行。细胞在完整裂解缓冲液中裂解以获得RNA-蛋白复合物。将METTL3或YTHDF1抗体加入IP组，向免疫球蛋白G（immunoglobulin G, IgG）对照组加入IgG抗体，并置于立式匀浆器中4 ℃孵育过夜。加入平衡后的蛋白A/G磁珠继续孵育1 h，随后洗涤5次。最终通过酚-氯仿法提取RNA，并用于qPCR分析。富集结果相对于输入RNA进行标准化，计算公式为%Input = 1/10 × 2Ct[IP]-Ct[input]。

2.14 细胞转染

BMMs按照上述方法获取，并以每孔1 × 106个的密度接种于6孔板的α-MEM培养基（含10%胎牛血清）中。使用CALNPTM RNAi转染试剂（D-Nano Therapeutics公司）按说明进行siRNA转染。将siRNA、试剂A和试剂B混合后于室温孵育5 min，加入α-MEM培养基，再添加至细胞中。细胞继续培养24 h后进行后续实验和分析。siRNA序列如附录A中表S2所示。

2.15 药物靶点预测与分子对接

通过在线数据库PubChem、Swiss Target Prediction和GeneCards，获取TP与Med的潜在靶点蛋白信息，并结合RA相关基因（来源于PCR芯片数据，结果将另行发表）进行网络相互作用分析。

关键靶蛋白的三维结构信息来源于蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB），并利用AutoDock Vina（版本1.1.2）软件对TP和Med与关键靶蛋白进行分子对接分析。

2.16 临床样本

我们共收集来自中日友好医院的3份RA和3份骨关节炎（osteoarthritis, OA）患者的关节组织样本。每份样本分为两部分，一部分采用TRIzol试剂按标准操作流程提取总RNA，用于总m6A水平检测；另一部分则用于组织固定、脱钙、石蜡包埋及IHC分析。本研究已获得中日友好医院伦理委员会批准，伦理批准编号为2024-KY-019。

2.17 统计学分析

统计分析及图形绘制使用GraphPad Prism软件（美国）完成。两组之间的比较采用Student t检验；多组之间的比较采用单因素方差分析（analysis of variance, ANOVA）。所有实验均重复3次，计量数据以均值±标准误（standard errors of the mean, SEM）表示，P < 0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 TP与Med单用及联合用药可抑制CIA大鼠关节炎进展并延缓疾病发作

我们采用CIA大鼠模型模拟RA，建模成功率为95%，验证了模型的可靠性。在此模型中研究了TP与Med的治疗潜力及联合用药效果。加强免疫后第7天，大鼠出现关节炎症状，表现为足爪和踝部肿胀[图2（a）、（b）]。MTX、TP和Med治疗均抑制了关节炎进展，而半剂量的联合用药则延缓了疾病发作[图2（a）~（c）]。踝关节的组织学分析显示，CIA组出现严重软骨损伤和关节破坏，表现为滑膜增生侵袭、血管翳形成及炎症细胞浸润[图2（d）、（e）]；而MTX组的病理改变有所缓解。值得注意的是，TP与Med单用及联合治疗均改善了骨破坏及相关病理改变，且联合用药效果优于单药。联合治疗还改善了CIA大鼠体重下降的情况[图2（f）]。此外，HE染色和脏器指数结果表明，各药物对CIA大鼠的肝脏、肾脏及结肠组织均未产生毒性影响[图2（g）~（i）]。

3.2 TP和Med单独或联合用药可抑制骨侵蚀及破骨细胞生成

OCs的过度活化是RA患者骨吸收和关节破坏的主要原因[34]。我们进一步通过对踝关节和膝关节进行micro-CT扫描并进行TRAP染色，评估TP和Med单独及联合治疗对骨侵蚀和破骨细胞生成的影响。micro-CT和三维分析显示，CIA组踝关节骨破坏严重[图3（a）]，而MTX、TP、Med及联合治疗组均明显缓解了骨侵蚀，表现在BS/BV值降低，其中联合治疗效果优于单药治疗[图3（b）]。TRAP染色显示，CIA组OCs数量增加，主要位于侵入软骨和关节的增生性滑膜中，参与骨侵蚀[图3（c）]。MTX、TP、Med及联合治疗均显著减少了OCs的数量和面积，且联合治疗组效果最显著[图3（d）]。此外，CIA大鼠膝关节的骨吸收程度升高，骨密度下降[图3（e）]，而MTX、TP、Med及联合治疗组均可降低膝关节BS/BV值，提高BV/TV值，其中联合治疗组效果最显著[图3（f）]。膝关节的组织学分析显示，CIA大鼠存在严重的软骨破坏和炎性细胞浸润[图3（g）]，而各治疗组病理表现均得到缓解[图3（h）]。

3.3 TP和Med调控CIA大鼠的炎症反应

Tregs和炎症因子是破骨细胞生成和分化的重要调控因素[3]。Tregs通过分泌抗炎因子（如IL-10和TGF-β）维持骨组织动态稳态，抑制OCs前体的增殖与分化，防止骨过度吸收[32‒33,35]。而IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子是促进OCs分化的主要因子，在RA的炎症环境中，这些因子推动OCs的分化、成熟并增强其功能活性，进而导致RA相关的骨侵蚀[36]。为此，我们评估了TP和Med的联合作用是否也体现在Tregs和炎症因子上。流式细胞术结果显示，CIA组大鼠脾脏中Tregs占比下降[图4（a）]，而MTX和Med可一定程度恢复Tregs比例，但差异无统计学意义。TP和Med联合治疗可补充Tregs，且联合组与单药组无显著差异[图4（b）]。ELISA检测结果显示，CIA组促炎因子水平显著升高，抗炎因子显著下降，而MTX、TP、Med及联合治疗均可调节炎症反应。尤其是联合治疗组在降低IL-1β和IL-6方面效果优于单药组[图4（c）、（d）]。但对于TNF-α、IL-10和TGF-β1表达，联合组与单药组差异不显著[图4（e）~（g）]。因此，TP和Med联合治疗对CIA大鼠的作用体现在消除关节骨破坏方面。

3.4 TP和Med在体外协同抑制OCs分化与功能

体内实验显示TP与Med联合作用抑制CIA大鼠骨侵蚀，因此我们进一步在体外实验中研究其机制。原代BMMs分离并诱导分化为OCs后，TRAP染色结果显示，TP或Med单独使用可剂量依赖性抑制RANKL诱导的破骨细胞生成，减少OCs数量[图5（a）]。联合使用10 nmol∙L-1 TP和10 μmol∙L-1 Med时抑制效果最佳[图5（b）]，其组合指数（combination index, CI）小于1，提示存在协同效应[图5（c）]。OCs的功能性标志为骨吸收活性，可通过F-actin环染色及骨吸收陷窝检测进行量化。TRITC-鬼笔环肽染色显示，TP或Med单用可剂量依赖性抑制F-actin环形成[图5（d）、（e）]，药物处理条件下细胞存活率未见明显下降[图5（f）~（h）]。SEM观察显示，TP或Med单用可抑制骨吸收陷窝形成，联合用药效果更显著[图5（i）、（j）]。

此外，TP与Med下调OCs特异性标志基因的mRNA和蛋白水平，包括Nfatc1、c-Fos、Dc-stamp、Ctsk和Atp6v0d2。联合用药对Nfatc1、Atp6v0d2、Dc-stamp、Ctsk转录及c-Fos、DC-STAMP、CTSK蛋白表达的抑制效果更强（图6）。因此，体外结果还表明，TP和Med对OCs分化、骨再吸收和F-actin环形成具有协同抑制作用。

3.5 TP和Med调控OCs中METTL3/YTHDF1表达

我们收集临床膝关节置换术患者的膝关节样本，提取RNA并进行比色法和点杂交检测。结果显示RA患者m6A水平高于OA患者[图7（a）、（b）]，提示m6A甲基化在RA相关骨破坏中上调，有望成为药物靶点。RA相关骨破坏的发病机制与RNA m6A甲基化有关。此外，我们使用PCR芯片比较了RA患者和健康对照组外周血中PBMCs的甲基化水平，并检测到m6A甲基化酶水平存在显著差异（文章待发表）。对RA和OA患者关节组织中m6A甲基化酶转录水平的进一步比较显示，Mettl3、Ythdf1、Igf2bp2、Ythdc1和Ythdc2的表达存在显著差异[图7（c）]。在这些发现的基础上，我们进一步研究了TP和Med的m6A甲基化靶点。通过查询在线数据库中TP和Med的分子靶点，我们分析了它们与m6A甲基酶的相互作用，这些酶在PCR芯片中表现出mRNA水平的显著变化。此分析确定了TP和Med以及RA相关m6A甲基化酶之间具有密切的网络关联，特别是METTL3、YTHDF1、ALKBH5和FTO。编码这些蛋白质的基因可以作为TP和Med的新治疗靶点[图7（d）]。

在体外诱导OCs过程中，m6A总量升高，而TP、Med单独或联合处理可显著下调m6A水平[图8（a）、（b）]。因此，m6A在RANKL诱导的OCs生成中起着重要作用。对最常见的m6A“写入酶（writers）”、“擦除酶（erasers）”和“阅读蛋白（readers）”的mRNA水平进行分析后发现，RANKL增加了OCs中Mettl3、Wtap、Igf2bp1、Igf2bb3和Ythdf1的水平，TP和Med降低了Mettl3、Igf2bp3和Ythdf1的水平，联合治疗降低了Mettl3、Wtap、Igf2bf3和Ythdf1的水平。值得注意的是，与TP或Med组相比，联合组Mettl3和Ythdf1的表达受到更大程度的抑制[图8（c）]。接下来，我们检测了目标m6A甲基化修饰酶的蛋白质水平，结果表明，TP和Med抑制METTL3和YTHDF1的表达，联合治疗组与单独用TP或Med治疗的组之间存在显著差异，这与转录水平结果几乎一致[图8（d）、（e）]。RA患者关节组织脱钙后TRAP与IHC染色结果显示，TRAP阳性细胞中METTL3和YTHDF1表达显著升高[图8（f）、（g）]。在体内实验中，通过IHC和TRAP染色同时标记OCs中的METTL3和YTHDF1，发现TP可以降低OCs中METTL3的水平，而Med可以降低OCs中YTHDF1的水平[图8（h）~（j）]。分子对接结果显示，TP可与METTL3结合（结合能为-5.90 kcal∙mol-1），Med可与YTHDF1结合（结合能为-6.92 kcal∙mol-1）[图8（k）、（l）]。

3.6 敲降Mettl3或Ythdf1可抑制OCs分化与骨吸收

接下来，我们将si-Mettl3或si-Ythdf1转染到BMM中，以进一步研究“writer” METTL3或“reader” YTHDF1与OCs生成之间的关系。si-Mettl3或si-Ythdf1转染后BMMs中Mettl3或Ythdf1的mRNA和蛋白表达显著降低（附录A图S1），表明敲降作用有效。

TRAP和F-actin环染色显示，si-Mettl3 [图9（a）~（c）]或si-Ythdf1 [图9（d）~（f）]转染后OCs的数量和面积减少。此外，F-actin融合程度降低，表明细胞骨架结构受到影响，OCs形成受到抑制。F-actin环的面积减小，表明OCs的侵蚀能力降低，进一步证实METTL3和YTHDF1在OCs分化和骨吸收中的关键作用。Mettl3的敲降导致TP诱导的OCs数量、面积和细胞骨架结构的减少效应消失；同样，Ythdf1的敲降导致Med失去对OC产生和功能的进一步抑制。

实时（real-time, RT）-qPCR显示，si-Mettl3 [图9（g）]或si-Ythdf1 [图9（h）]显著降低了Nfatc1、c-Fos、Dc-stamp、Atp6v0d2和Ctsk mRNA的表达，进一步证实Mettl3或Ythdf1的敲降会影响OCs相关基因的表达。蛋白质印迹分析进一步证实，si-Mettl3 [图9（i）~（j）]或si-Ythdf1 [图9（k）~（l）]转染后OCs分化相关蛋白的表达水平显著降低，这与RT-qPCR结果一致，表明YTHDF1和METTL3影响这些基因的转录和翻译。TP和Med对OCs相关因子的抑制作用并未因Mettl3和Ythdf1的敲降而进一步增强。RIP实验的结果表明，METTL3 [图9（m）]和YTHDF1 [图9（n）]与OCs相关基因（Nfatc1、c-Fos、Dc-stamp、Atp6v0d2和Ctsk）相互作用，表明这两种蛋白质可能通过直接结合这些mRNA来调节它们的表达。这些实验结果表明，敲降Mettl3或Ythdf1可以通过降低OCs相关基因的表达来减少OC的数量和面积，这表明METTL3和YTHDF1在OCs生成和功能方面具有共同的调控网络，它们可能在OCs调控系统中具有合作和互补的关系。此外，TP和Med分别通过METTL3和YTHDF1发挥作用，对OCs分化和功能的抑制作用相似，表明这两种药物通过其特定的m6A修饰途径在不同水平上协同调节OCs的形成和功能。

4 讨论

RA患者在疾病发作初期即会出现关节侵蚀，即使在尚未出现明显关节炎的RA前期，也可观察到骨破坏[37]。尽管目前的治疗策略已在一定程度上改善了炎症状态，但多数患者的骨破坏仍难以逆转[38]。靶向作用OCs被认为是RA治疗中极具前景的方向，然而现有药物种类有限，且在临床上已观察到多种严重不良反应[23]。近年来，中药活性成分抑制OCs形成及功能的作用日益受到关注[39‒40]。因此，阐明OCs的形成机制及其调控网络成为当前研究热点。本研究发现，TP与Med联合应用在CIA大鼠模型中具有协同作用，优于单药对骨侵蚀的抑制作用。体外实验同样显示TP与Med对OCs分化具有协同抑制作用。

尽管临床治疗手段不断进步，RA治疗仍面临挑战。由于单一药物疗效有限且存在毒副作用，药物联用逐渐成为临床趋势[41]。因此，开发疗效良好、毒副作用小的联合治疗方案，具有重要的医学及经济意义[42‒43]。雷公藤是RA治疗指南中公认的有效药物，其主要成分TP对肝脏、肾脏及生殖系统有毒副作用[44‒46]。而鸡血藤中的活性成分已被证实在与其他药物联用时可发挥协同效应[47]。本研究探索了低剂量TP与Med联合治疗RA的潜力，以期在保证疗效的同时降低毒性。结果显示，TP与Med联用可显著抑制CIA大鼠病情进展，其效果优于单药。尤其在低剂量下，此组合对骨侵蚀的抑制及OCs数量的降低表现突出，较高剂量单药更具优势。值得注意的是，此联合治疗的疗效与RA一线治疗药物甲氨蝶呤相当。TP与Med的低剂量联合用药为RA治疗提供了一种创新思路，不仅可增强对骨破坏的靶向治疗效果，而且可解决高剂量单药治疗所带来的全身毒性问题。尤其在高剂量TP因毒性应用受限的临床场景下，此方案更具实用价值。此外，TP与Med之间的协同作用提示其剂量仍具进一步优化空间，有望实现个体化治疗策略，以提高患者耐受性与治疗效果。

近年来的研究表明，表观遗传调控（包括DNA甲基化和组蛋白修饰）在RA的发生发展中具有重要作用[48‒49]。我们前期研究关注甲基化调控，发现RA患者滑膜组织及PBMC中m6A甲基化水平升高[14,25,50]。然而，OCs作为骨代谢核心细胞，是介导骨吸收与重塑的关键。m6A这一主要RNA表观遗传调控机制在RA相关骨破坏与OCs生成中的作用尚少见报道。在OCs生成过程中，RANKL刺激会显著提高胞内m6A水平，从而促进OCs生成及病理性骨吸收[17,51]。相反，抑制m6A甲基化可降低OCs的数量及功能。我们的实验结果表明，m6A修饰不仅调控基因表达水平，更是维持OCs分化及功能的关键机制[52]。因此，m6A修饰调控OCs生成及活性的机制有望成为骨质疏松症与RA等疾病的治疗靶点。对RA中差异甲基化基因及TP与Med潜在靶点的分析表明，Mettl3、Ythdf1及Alkbh5可能是新的潜在药物靶点[53]。我们推测TP与Med联合抑制关节骨侵蚀的作用可能与不同程度的m6A甲基化调控有关，TP通过抑制METTL3降低mRNA的m6A甲基化水平，而Med则通过抑制YTHDF1阻断其对甲基化mRNA的翻译功能（结果还需进一步验证）。因此，两药联合可通过不同的转录后调控机制同时干预OCs的形成与功能，从而显著减少其数量、减小其面积面积，并降低骨吸收能力。这一协同作用进一步验证了m6A修饰在OCs分化调控中的重要作用，并提示可通过靶向作用不同m6A调控因子实现类似的生物学效应。本研究为RA患者骨破坏治疗提供了新的可能路径。

有趣的是，TP与Med分别靶向作用METTL3与YTHDF1，而si-Mettl3与si-Ythdf1处理后的OCs呈现出高度相似的表型，提示这两个分子可能处于同一调控通路中。我们推测，在OCs生成过程中，METTL3与YTHDF1共同构成“甲基化-翻译”轴：METTL3首先在OCs相关基因mRNA上添加m6A修饰，YTHDF1随后识别并促进其翻译[54‒55]，以保证关键基因的快速表达。因此，Mettl3敲降可降低m6A修饰水平，而Ythdf1敲降则阻断mRNA翻译，最终导致OCs关键基因（如Nfatc1、c-Fos、Dc-stamp、Atp6v0d2及Ctsk）表达降低。NFATc1是OCs分化的主调控因子，c-Fos在RANKL诱导的OCs形成中发挥关键作用[56]，Dc-stamp [57]与Atp6v0d2 [58]则是OCs融合与功能维持所必需的基因，Ctsk编码骨基质降解相关蛋白[59]。基于上述结果，我们认为METTL3与YTHDF1之间的功能协同关系揭示了m6A修饰调控OCs生成的新机制，同时也进一步阐释了TP与Med协同效应的分子基础。已有研究表明，METTL3可调控OCs的面积与数量[16]。通过Mettl3敲降和过表达ALKBH5可降低Circ_0008542的稳定性与功能，进而抑制OCs活性[60]。在成骨细胞分化过程中，m6A水平升高，YTHDF1与YTHDF2通过调控NFATc1的转录后水平发挥拮抗作用[17]。YTHDF1可通过识别Ezh2与Cdh11的m6A位点，促进其翻译，进而驱动溶骨性癌转移[61]。此外，METTL3还通过调控FLSs中Icam2的mRNA甲基化，进而影响其增殖、迁移及侵袭能力[62]，促进FLSs活化与炎症反应[63]。研究也指出，METTL3可作为自身免疫性疾病的潜在治疗靶点，其在Tregs中的缺失会导致其免疫抑制功能受损，从而引发严重的自身免疫反应[64]。此外，YTHDF1可能通过调控Tregs与辅助性T细胞（T helpers, Th）的分化来影响炎症反应[65]。因此，METTL3与YTHDF1可能是TP与Med在CIA大鼠中调控炎症反应的潜在通路。我们的研究显示，METTL3与YTHDF1均可与上述关键基因mRNA结合，其敲降显著下调相关基因及蛋白表达，破坏m6A修饰并减少OCs生成。这也解释了Mettl3或Ythdf1敲降后所产生的相似表型，强调了m6A修饰在OCs分化转录后调控中的关键作用。综上所述，METTL3与YTHDF1均可作为潜在治疗靶点，通过阻断OCs生成进而预防RA相关骨破坏。TP与Med作为协同抑制METTL3与YTHDF1的天然药物，代表了一种安全、创新的治疗策略，具有良好的临床转化前景。

5 结论

OCs的过度活化是RA的核心病理特征。本研究首次证实TP与Med在RA治疗中（尤其是在骨破坏抑制方面）具有协同作用优势。此外，TP与Med联合通过靶向作用m6A修饰通路中关键因子METTL3与YTHDF1，从不同层面干预OC相关基因的表达，显著增强了对OCs形成与功能的抑制作用。本研究进一步明确了m6A修饰是OCs分化过程中的关键调控机制，METTL3与YTHDF1在此过程中发挥重要的正向调控作用。上述结果不仅为RA疾病治疗提供了新的分子靶点，也为中药活性成分的研究提供了新方向，同时为联合用药策略的开发提供了理论依据。

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