我国兽用益生菌产品质量分析及肠球菌介导的耐药性传播风险评估

吉星; 王佳芸; 李俊; 张莉莉; 魏瑞成; 王冉; 何涛

doi:10.1016/j.eng.2025.03.032

工程（英文） ›› 2025, Vol. 55 ›› Issue (12) : 241 -253. DOI: 10.1016/j.eng.2025.03.032

研究论文

我国兽用益生菌产品质量分析及肠球菌介导的耐药性传播风险评估

吉星 ^a ,
王佳芸 ^a^,^b ,
李俊 ^a ,
张莉莉 ^a ,
魏瑞成 ^a ,
王冉 ^a ,
何涛 ^a

作者信息 +

Livestock Probiotics in China: Quality Analysis and Enterococcus-Associated Antibiotic Resistance Dissemination Risks

Xing Ji ^a ,
Jiayun Wang ^a^,^b ,
Jun Li ^a ,
Lili Zhang ^a ,
Ruicheng Wei ^a ,
Ran Wang ^a^,^* ,
Tao He ^a^,^* ,

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摘要

益生菌作为抗生素的替代品，在畜牧养殖中具有广阔的应用前景。然而，兽用益生菌产品的大量使用可能带来潜在公共卫生风险，如产品质量低劣的益生菌可能介导耐药性传播等问题。本研究从我国不同地区收集了95份非重复性商业兽用益生菌产品。研究结果显示，益生菌产品中乳杆菌（Lactobacillus）的标签符合率最低，仅为11%。此外，约33.3%的产品受到机会性病原菌污染，这些病原菌携带多种毒力基因和抗生素耐药基因（ARGs）。从产品中分离的芽孢杆菌（Bacillus）和肠球菌（Enterococcus）表现出多样化的克隆类型和地理分布特征，其中部分肠球菌与人类感染性疾病相关克隆具有密切的系统发育关系。与芽孢杆菌和乳酸菌相比，肠球菌的抗生素耐药基因携带率更高。特别值得注意的是，在一株屎肠球菌（Enterococcus faecium）中发现了位于新型可转移质粒上的𫫇唑烷酮耐药基因optrA。通过鸡肠道定植模型，本研究发现大量使用携带optrA基因的屎肠球菌作为益生菌，会破坏鸡肠道初期正常菌群，并改变肠道耐药组和移动遗传元件（MGEs）的丰度。此外，宏基因组分析表明，optrA基因可通过转座子IS1216E转移至肠道共生菌，包括盲肠肠球菌（Enterococcus cecorum）、鸡肠球菌（Enterococcus gallinarum）和卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）等物种。总之，本研究证实，我国畜牧生产中使用的益生菌产品存在不符合良好生产规范（GMP）标准及益生菌菌株分子遗传背景研究不足等问题。广泛使用携带多种抗生素耐药基因的低质量肠球菌菌株作为益生菌，可能破坏肠道稳态，并成为抗生素耐药基因的储存库和传播源。此外，本研究也强调需谨慎评估肠球菌菌株作为益生菌大量使用的风险，以避免对养殖动物及人类健康造成潜在负面影响。

Abstract

As a natural alternative to antibiotics, probiotics have considerable potential for use in livestock farming. However, the current use of probiotics in livestock poses potential public health risks due to inadequate regulations, including issues such as the inferior quality and dissemination of antibiotic resistance. In this study, 95 non-duplicate commercial probiotic products for livestock were collected from different regions of China. Our findings revealed that the labeling compliance rate for Lactobacillus was the lowest, at just 11%, and approximately 33.3% of the products were contaminated with opportunistic pathogens containing various virulence and antibiotic-resistance genes (ARGs). Isolates of Bacillus and Enterococcus from the products exhibited diverse clonal types and geographical dispersion, whereas certain Enterococcus exhibited close phylogenetic relationships to clones associated with human infectious diseases. Compared with Bacillus and Lactobacillus, Enterococcus exhibited a higher prevalence of ARGs. Specifically, the oxazolidine-resistance gene optrA, which is located on novel transferable plasmids, was found in one isolate of Enterococcus faecium (E. faecium). Using chicken models, we observed that the optrA-positive E. faecium disrupts the normal intestinal microbiota in chickens and alters the abundance of intestinal resistome and mobile genetic elements (MGEs). Furthermore, metagenomic analysis revealed that the optrA gene can be transferred via transposon IS1216E to commensal intestinal bacteria, including Enterococcus cecorum (E. cecorum), Enterococcus gallinarum (E. gallinarum), and Lactobacillus crispatus (L. crispatus) species. In summary, our study confirms that the probiotic products used in Chinese livestock production present problems such as non-compliance with good manufacturing practice (GMP) production standards and insufficient elucidation of the molecular genetic background of probiotic strains. The widespread use of low-quality Enterococcus strains containing various ARGs as probiotics could disrupt intestinal homeostasis and serve as a reservoir and source of ARGs. We emphasize the importance of carefully evaluating the use of Enterococcus strains as probiotics to avoid potential negative effects on livestock and human health.

关键词

益生菌 / 养殖业 / 质量 / 耐药基因 / optrA

Key words

Probiotics / Livestock / Quality / Antibiotic-resistance genes / optrA

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吉星,王佳芸,李俊,张莉莉,魏瑞成,王冉,何涛. 我国兽用益生菌产品质量分析及肠球菌介导的耐药性传播风险评估[J]. 工程（英文）, 2025, 55(12): 241-253 DOI:10.1016/j.eng.2025.03.032

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1 引言

益生菌是一类非致病性活微生物，当以足够剂量施用时，能够对宿主产生积极影响[1]。现有研究表明，芽孢杆菌属（Bacillus）和乳酸菌属（Lactobacillus）等特定菌株对人类胃肠道疾病及免疫相关疾病具有预防或治疗效果[2]。此外，益生菌还可增强畜牧动物的免疫功能，降低畜牧养殖业中动物疾病的发生率[3]。随着许多国家对畜牧养殖业中抗生素使用的限制日益严格，益生菌作为一种重要的抗生素替代品，展现出巨大的行业应用潜力。

然而，值得注意的是，并非所有益生菌产品都符合市场监管中“公认安全”（GRAS）的标准[4]。多项研究指出，一些益生菌产品存在标签错误、活菌率低以及机会性病原菌污染等问题[5]。特别地，有研究报道了婴儿及危重患者因乳酸菌和芽孢杆菌引起的菌血症等严重感染的案例[6]。低质量的益生菌产品可能被机会性病原菌和真菌污染，如蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和毛霉目真菌（Mucorales）可引发食源性疾病，表现为腹泻、呕吐，严重时可能导致死亡[7‒8]。此外，益生菌可能作为抗生素耐药基因（ARGs）的储存库，促进ARGs在肠道中向共生菌或致病菌转移[9‒10]。例如，一些乳杆菌和芽孢杆菌已被证实可携带位于可移动遗传元件（MGEs）的ARGs，这些基因可介导对氨基糖苷类和大环内酯类抗生素的耐药性[11]。例如，四环素耐药基因tet(M)和红霉素耐药基因erm(B)可在乳杆菌和肠球菌之间实现水平转移[12‒13]。

与人用益生菌产品相比，兽用益生菌产品可能因缺乏标准化的菌株安全性评估标准而面临更高的使用风险。有研究表明，一些兽用益生菌产品含有致病性益生菌及机会病原菌，这些微生物可定植于动物体内并排入环境[14]。本研究对我国市场上兽用益生菌产品的组成及潜在病原菌污染情况进行了调查，并全面分析了益生菌菌株的遗传特征及进化关系。此外，本研究发现广泛使用携带ARGs的肠球菌菌株作为益生菌会破坏动物肠道稳态，并促进ARGs的转移。基于“同一健康”和“食品安全”原则，本研究旨在为兽用益生菌的规范化使用和健康发展提供依据。

2 方法

2.1 益生菌及机会性病原菌的分离与鉴定

为探究我国养殖业使用的益生菌质量，本研究于2021—2023年间从22个省收集了95份非重复性商业益生菌产品。所有收集的产品均在标明的有效期内，且专用于畜牧养殖。关于这些商业益生菌产品的详细信息见附录A中的表S1。每种产品各取10包益生菌粉剂充分混匀，制成一份样品，取1 g样品悬浮于5 mL无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，均质处理10 min。使用相同稀释液制备10倍系列稀释液，取0.1 mL稀释液分别涂布于甘露醇卵黄多黏菌素（MYP）琼脂（用于芽胞杆菌属分离）、胆汁七叶苷琼脂（用于肠球菌属分离）和MRS琼脂（用于乳酸菌属分离）。每个稀释度的平板在37 ℃下于有氧或厌氧条件下培养48 h后进行菌落计数。对于芽孢杆菌属，稀释液在80 ℃加热2 min以消除非产孢微生物。此外，使用RAPID'B.cereus培养基和CHROMagar培养基分离和鉴定益生菌产品中的机会性病原菌。从琼脂平板上挑选形态学上不同的菌落进行纯培养，并通过16S rRNA基因测序进行物种鉴定[15]。

2.2 抗菌药物敏感性试验

益生菌分离株的抗菌药物敏感性试验采用微量肉汤稀释法，依据临床与实验室标准协会（CLSI）文件M45的指南进行。肺炎链球菌ATCC49619和粪肠球菌ATCC29212用于常规质量控制（QC）。测试的抗菌药物包括克林霉素、红霉素、氯霉素、美罗培南、卡那霉素、氨苄西林、四环素、利奈唑胺、万古霉素、环丙沙星、链霉素和庆大霉素。芽孢杆菌属、肠球菌属和乳酸菌属的最低抑菌浓度（MIC）耐药折点主要参考CLSI文件M45和M11。对于CLSI未明确折点的特定抗菌药物，参考国际标准化组织/国际乳品联合会（ISO/IDF）-10932、欧洲食品安全局（EFSA）指南[16]和欧洲抗菌药物敏感性测试委员会（EUCAST）的标准。本研究中使用的折点列于附录A中的表S2。

2.3 全基因组测序及分子分析

使用Illumina HiSeq X-Ten系统生成300 bp的双端读长，每个菌株的覆盖度至少为250倍。随后使用FastQC进行质量评估，并使用Trimmomatic进行修剪。使用SPAdes（v.3.12.0）组装序列读长。对于携带fexA和optrA耐药基因的肠球菌AJ10XM1A和S11XM4A，使用MinION设备进行测序以获得完整基因组序列。通过Unicycler（v.0.4.8）整合QC后的短读长数据，获得高质量的全基因组组装序列。组装后的DNA序列通过RAST平台进行自动注释。使用SRST2中的直接读长比对方法，以大于90%的相似性阈值，比对ResFinder和VirulenceFinder数据库，鉴定已知的抗菌药物耐药性（AMR）和毒力基因[17]。所有菌株的多位点序列分型（MLST）使用PyMLST（v.2.1）基于pubMLST数据库进行。

2.4 系统发育分析

使用基于最小哈希距离的非加权组平均（UPGMA）算法构建129株芽孢杆菌属、84株肠球菌属和18株乳酸菌属的系统发育树，草图大小为1000，k-mer大小为21（Mashv.2.1）。随后使用交互式生命树（iTOL）进行可视化。此外，从细菌与病毒生物信息学资源中心（BV-BRC）数据库下载了公共益生菌菌株参考基因组[18]。详细菌株信息见附录A中的表S3。

2.5 接合实验

为评估fexA和optrA基因的可转移性，使用从益生菌产品中分离的fexA阳性粪肠球菌S11XM4A和optrA阳性屎肠球菌AJ10XM1A作为供体菌，利福平耐药的粪肠球菌JH2-2作为受体菌进行滤膜接合实验[19]。接合子在选择培养基（含200 mg∙L^-1利福平和8 mg∙L^-1氟苯尼考）上筛选。通过聚合酶链反应（PCR）检测fexA和optrA基因以确认接合子。此外，将fexA和optrA阳性质粒电转化至代表益生菌产品中主要克隆型序列分型（ST）296的屎肠球菌CXM16A感受态细胞中。使用8 mg∙L^-1氟苯尼考筛选转化子，并通过PCR确认。依据CLSI指南测定接合子/转化子对氟苯尼考和利奈唑胺的MIC，将粪肠球菌ATCC 29212用于QC。菌株AJ10XM1A和CXM16A的AMR基因组成详见附录A中的表S4。

2.6 益生菌在鸡肠道定植的实验设计

通过直接粪便培养和PCR检测，确认105只新孵化的Arbor Acres（AA）肉鸡（52只雄性，53只雌性）未携带optrA阳性肠球菌和optrA基因。将肉鸡随机分为3组，分别置于无菌隔离室中。分组如下：①对照组仅给予PBS（n = 35）；② optrA阳性肠球菌定植组（n = 35）；③ optrA阴性屎肠球菌CCW15A定植组（n = 35），以研究optrA阴性肠球菌定植是否影响微生物群和抗生素耐药组。CCW15A缺乏包括optrA在内的多种AMR基因，且在系统发育上与AJ10XM1A密切相关（CCW15A携带的AMR基因见表S4）。所有肉鸡适应新环境3天。根据肉鸡益生菌推荐日剂量（约1.0 × 10⁷~1.0 × 10⁸ CFU∙d^-1，CFU为菌落形成单位），每只肉鸡每天口腔注射500 μL含1.0 × 10⁸ CFU∙mL^-1 AJ10XM1A/CCW15A的PBS悬浮液，连续接种3天。在定植后第1天、3天、7天、14天、21天、28天和35天，每组随机选取5只肉鸡。所有肉鸡通过颈椎脱位法安乐死，并立即收集回肠和盲肠内容物。部分内容物用于分离利奈唑胺耐药肠球菌，其余内容物立即转移至液氮中，随后保存于-80 ℃待进一步分析。在整个35天的试验期间，所有肉鸡均可自由获取饲料和水。饲料和水均通过PCR检测确认无optrA基因，并经过灭菌处理。动物实验符合江苏农业科学院实验室动物护理与使用指南（IACUC-AE-2023-08-010）。

2.7 宏基因组测序、组装及分箱

提取鸡回肠和盲肠内容物的宏基因组DNA，并使用MGI DNBSEQ-500平台进行测序。随后，超过10 Gb的原始读长通过Trimmomatic（v.0.33）和BMTagger（v.2.2.4）进行质控和宿主序列过滤，以去除接头序列、低质量序列和污染的宿主DNA [20‒21]。使用MEGAHIT（v.1.1.2）组装干净读长，过滤掉小于500 bp的重叠群（contig）。为从宏基因组数据中重建微生物基因组[22]，使用MetaBAT2计算所有contig的覆盖度并进行宏基因组分箱，以获得在分类学上等同于微生物菌株的宏基因组组装基因组（MAGs）[23]。使用CheckM（v.1.0.12）评估分箱的完整性和污染程度。高质量MAGs的完整性大于90%且污染小于5%，中等质量MAGs的完整性不小于50%且污染小于10%，低质量MAGs的完整性小于50%且污染小于10%。最后，使用GTDB-Tk（v.2.2.0）基于基因组分类数据库对分箱进行默认参数下的分类注释[24]。

2.8 微生物、AMR及MGE组成分析

使用Prodigal（v.2.6.3）在meta模式下预测开放阅读框（ORFs）[25]。利用Kraken2对肠道微生物群进行分类，并使用Bracken计算微生物多样性和丰度[26]。为全面分析宏基因组数据中ARGs和MGEs的组成，使用HMMER或BLAST将注释的ORFs比对至集成数据库（包括AMRfinder、CARD和proMGE）以及自定义的质粒数据库[26]。此外，使用bowtie2量化contig、ARGs和MGEs的丰度，随后通过SAMtools计算转录本每千碱基百万数（TPM）进行标准化。

2.9 统计分析及可视化

在R包vegan中使用标准化相对丰度数据对微生物组和耐药组进行α多样性（chao1指数）和β多样性[基于Bray Curtis距离的主坐标分析（PCoA）]分析。使用GraphPad Prism（v.8.0）对分组数据进行差异统计分析，并采用Kruskal-Wallis检验、Mann-Whitney U检验或Student t检验。通过Spearman相关分析识别ARGs、MGEs与微生物群之间的相关性。此外，使用R包Igraph进行相关性网络分析。所有统计检验的显著性水平设为p小于0.05。

2.10 数据可用性

本研究中生成的宏基因组测序原始数据可通过国家生物技术信息中心（NCBI）序列读长档案库（Sequence Read Archive）访问，BioProject编号为PRJNA1049198。两种新型耐药质粒（pS11XM4A和pAJ10XM1A）的序列可通过GenBank获取，编号分别为OR734628和OR734227。

3 结果

3.1 兽用益生菌产品在菌株组成、含量与纯度方面存在质量问题

本研究从我国22个省份收集了95份非重复性兽用益生菌产品（附录A图S1）。大多数益生菌产品（> 79.3%）宣称含有至少两种益生菌菌株，主要属于芽孢杆菌属（Bacillus spp.）、乳酸菌属（Lactobacillus spp.）或肠球菌属（Enterococcus spp.）。然而，仅芽孢杆菌属和肠球菌属表现出较高的分离率和标签符合率（菌株阳性产品数/总产品数，NSPP/TNP = 0.91和0.79；菌株阳性产品数/标签阳性产品数，NSPP/NLPP = 1.11和1.59）。相比之下，83%的采样产品中未检出乳酸菌属，包括那些标签标注含有该菌种的产品（NSPP/TNP = 0.17; NSPP/NLPP = 0.30）。这一结果表明，芽孢杆菌属和肠球菌属是受检产品中的主要益生菌属，甚至包括未在标签中标注的产品[图1（a）]。尽管大多数产品宣称活菌数超过公认的有效阈值1.0 × 10⁸ CFU∙g^-1 [27]，但仅有72.6%的芽孢杆菌属相关产品符合这一标准。肠球菌属和乳酸菌属产品的合格率（QRP）相对较低，分别为0.62和0.38 [图1（b）]。

通过16S rRNA测序分析，进一步鉴定了280株非冗余益生菌菌株。芽孢杆菌属主要包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis, n = 113）、贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis, n = 31）、副地衣芽孢杆菌（B. paralicheniformis, n = 12）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis, n = 8）、贫瘠水芽孢杆菌（B. inaquosorum, n = 6）和短小芽孢杆菌（B. pumilus, n = 5）。肠球菌属包括屎肠球菌（Enterococcusfaecium, n = 78）、粪肠球菌（E. faecalis, n = 4）和希拉肠球菌（E. hirae, n = 2）。乳酸菌属主要包括植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum, n = 8）、副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei, n = 3）和戊糖乳杆菌（L. pentosus, n = 1）[图1（b）]。除益生菌外，53.6%的益生菌产品（n = 51）中检出了条件性病原菌，如蜡样芽孢杆菌（B. cereus, n = 33）、阴沟肠杆菌（E. cloacae, n = 13）、弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii, n = 3）、阪崎肠杆菌（E. sakazakii, n = 4）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia, n = 5）和肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis, n = 15）。这些结果表明，我国市场上相当一部分兽用益生菌产品在益生菌组成、含量和纯度方面存在显著质量问题。详细菌株信息见附录A表S1。

3.2 肠球菌益生菌表现出更复杂的抗生素耐药性模式

本研究对分离的益生菌菌株进行多种抗菌药物的敏感性测试，结果显示芽孢杆菌属的抗生素耐药性模式有限且具有种属特异性。例如，枯草芽胞杆菌沙漠亚种对氯霉素表现出显著耐药性（n = 4, 100%）；而贝莱斯芽孢杆菌（n = 15）、枯草芽孢杆菌（n = 40）和地衣芽孢杆菌（n = 6）对氨苄西林（12%~75%）、四环素（25%~65%）、克林霉素（20%~75%）和红霉素（25%~70%）表现出较高的耐药性。副地衣芽孢杆菌（n = 6）对红霉素（100%）和克林霉素（100%）表现出显著耐药性。另一方面，乳酸菌属（n = 6）对庆大霉素、万古霉素和环丙沙星表现出广泛的耐药性，这可能归因于其固有耐药机制。此外，本研究发现屎肠球菌（n = 35）和粪肠球菌（n = 4）对克林霉素和氨基糖苷类抗生素表现出固有耐药性，同时对四环素（14%和75%）、环丙沙星（34%和50%）和氯霉素（5%和75%）表现出获得性耐药性。值得注意的是，本研究还分离出了一株利奈唑胺耐药的屎肠球菌和一株氟苯尼考耐药的粪肠球菌。总体而言，分离得到的芽孢杆菌和乳酸菌类益生菌菌株的抗生素耐药性谱相对集中，主要表现为可预测的固有耐药性。相比之下，肠球菌菌株除了固有耐药性外，还表现出菌株特异性的多药耐药模式，表明其具有水平获得抗生素耐药性的潜力[图2（a）和（b）]。

此外，鉴于蜡样芽孢杆菌（n = 33）是采样产品中最常见的机会性病原菌（n = 32, 34.7%），本研究专门对其进行了抗菌药物敏感性测试。结果显示，所有蜡样芽孢杆菌菌株对庆大霉素、环丙沙星、万古霉素和美罗培南敏感，但对其他抗生素表现出广泛的异质性耐药（附录A表S5）。

3.3 肠球菌益生菌及机会性病原菌携带多种耐药基因和毒力基因

本研究通过全基因组测序进一步分析了采样益生菌中AMR基因的分布[图2（b）和（c）]。结果显示，芽孢杆菌属主要携带abc-f、catA、mphK、bla_OXA、vmlR、bla_BUP和cat86基因，分别介导对β-内酰胺类、氯霉素和大环内酯类抗生素的耐药性。值得注意的是，本研究在75%的贝莱斯芽孢杆菌和11%的副地衣芽孢杆菌中鉴定到了编码23S核糖体RNA甲基转移酶的cfr样基因（clbA），但未观察到相关抗菌药物（如利奈唑胺）敏感性的降低。乳酸菌属中除abc-f和bla家族基因外，未检测到其他ARGs。值得注意的是，肠球菌属携带了更多样化的ARGs。除常见的ARGs [如lsa(A)、lnu(B)、msr(C)和aac(6")-I]外，在屎肠球菌和粪肠球菌菌株中还鉴定到了tet(L)、lnu(B)、erm(B)、lsa(E)、optrA和fexA基因，这些基因分别介导对四环素类、林可酰胺类、大环内酯类、氯霉素类、链阳霉素类和𫫇唑烷酮类抗生素的耐药性。

对于从益生菌产品中分离的机会性病原菌，蜡样芽孢杆菌主要携带bla、satA和fosB基因，它们分别介导对β-内酰胺类、氨基糖苷类和磷霉素的耐药性。此外，阴沟肠杆菌、克罗诺杆菌属、肺炎克雷伯菌和沙门氏菌属携带oqxB、catA、tet(A)、bla_TEM-1、aph(3')-II和aph(6)-Id基因，相应基因分别介导对氟喹诺酮类、氯霉素类、四环素类、β-内酰胺类和氨基糖苷类抗生素的耐药性。值得注意的是，在一株阴沟肠杆菌中还鉴定到了黏菌素耐药基因mcr-9.1。菌株携带的特定耐药基因见附录A表S6。

针对益生菌产品中蜡样芽孢杆菌广泛污染及潜在中毒风险的担忧，本研究进一步分析了蜡样芽孢杆菌分离株中毒力基因的分布。几乎所有菌株（97.1%, n = 33）均检测到了非溶血性肠毒素操纵子nheABC；32.6%的分离株（n = 11）携带了荚膜合成基因capA、capB、capC和capD。有趣的是，ST24和ST177两种序列型还携带了额外的毒力因子，特别是由hblACD操纵子编码的溶血素BL和由cytK编码的细胞毒素K，这些毒力因子在其他ST型中未发现。蜡样芽孢杆菌携带的毒力基因详见附录A表S7。

3.4 系统发育分析揭示益生菌菌株的遗传多样性

接下来，本研究对采样产品中的益生菌菌株进行了全面的系统发育分析，以比较其遗传关系。枯草芽孢杆菌作为主要益生菌种，属于ST1、ST47和ST55克隆谱系。贝莱斯芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、贫瘠水芽孢杆菌和副地衣芽孢杆菌分别属于ST96、ST1、ST13、ST4及多个新ST型。短小芽孢杆菌、科赫纤维芽胞杆菌（Cytobacillus kochii）和坚固纤维芽孢杆菌（C. firmus）菌株数量较少，均属于多个新ST型。枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和副地衣芽孢杆菌表现出多个进化分支[图3（a）]。此外，所有粪肠球菌菌株均属于ST16，而屎肠球菌菌株表现出异质性克隆谱系，以ST160、ST269、ST361、ST812和ST1669为主，其中ST296菌株进一步分为3个不同的分支[图3（b）]。乳酸菌属及其他乳酸菌菌株缺乏ST数据，但同一属内的菌株表现出密切的系统发育关系[图3（c）]。益生菌物种的克隆谱系未表现出典型的地理聚类，表明益生菌产品中的主要组成菌株已在我国各省份广泛传播，并可能起源于不同的祖先。在全球范围内，我国益生菌产品中的分离株（除地衣芽孢杆菌外）与其他国家的益生菌菌株表现出密切的系统发育关系，这些菌株来源于发酵食品、膳食补充剂以及土壤、水和粪便等环境样本（附录A图S2）。值得注意的是，采样产品中分离的屎肠球菌ST262和ST396以及粪肠球菌ST16与已知致病性肠球菌菌株（引起伤口感染、血流感染及其他人类感染性疾病）表现出密切的遗传关系（附录A图S3）。

本研究还对机会性病原菌蜡样芽孢杆菌进行了系统发育分析。结果显示，其包括ST177、ST24、ST26、ST45和ST185等多种ST型。这些菌株分布于我国不同省份的益生菌产品中，其中ST185是最主要的克隆谱系（n = 11, 33.3%），如附录A图S4所示。

**3.5 益生菌产品中分离的肠球菌携带可转移的optrA和fexA阳性质粒**

本研究在采样益生菌产品中分离的肠球菌属中鉴定到了多种获得性AMR基因，包括𫫇唑烷酮耐药基因optrA和氯霉素耐药基因fexA。在屎肠球菌AJ10XM1A中，fexA和optrA基因位于同一质粒（41 126 bp）上，命名为pAJ10XM1A（GenBank：OR734227）。pAJ10XM1A质粒是一种新型质粒，GC含量为30.73%，编码45个ORFs。该质粒与NCBI数据库中屎肠球菌optrA阳性质粒pP47-61（CP091102.1）的核苷酸序列相似性为31.32%，序列覆盖率为73%。除erm(B)基因外，pAJ10XM1A还携带了一个由IS1216E-fexA-optrA-erm(A)-IS1216E组成的基因簇，该基因簇在先前报道的optrA阳性质粒[如pC25-1（CP030043）、pC54（CP030046）、pP47-61（CP091102）、pW6-2（CP118549）和pT17-1（CP109840）]中保守存在。在粪肠球菌S11XM4A中，fexA基因位于质粒pS11XM4A（OR734628）上，其大小为59 821 bp [图4（a）]。pS11XM4A质粒还携带耐药基因erm(B)、tet(L)和tet(M)，与质粒pEFT30-1（CP113829.1）和p26975-26-2（LR962637.1）的核苷酸序列相似性分别为81.56%和93.99% [图4（b）]。然而，pS11XM4A质粒缺乏IS1216E-fexA-optrA-erm(A)-IS1216E基因簇，仅携带一个fexA基因，该基因插入在两个ISEnfa家族转座酶之间。这些结果表明，IS1216E和ISEnfa可能促进了optrA和fexA基因在不同质粒间的共转移。

基于Orifinder数据库，本研究发现pS11XM4A含有编码松弛酶和IV型分泌系统（T4SS）的基因，表明其为一类典型的接合质粒。相比之下，pAJ0XM4A缺乏可识别的T4SS和松弛酶编码基因，表明其可能为非自转移质粒。然而，随后的接合实验表明，pS11XM4A和pAJ10XM1A均可成功转移至粪肠球菌JH2-2，转移频率分别为3.6 × 10^-5和1.0 × 10^-8。所得接合子对氟苯尼考（MIC = 64 μg∙mL^-1）和利奈唑胺（MIC = 16 μg∙mL^-1）表现出耐药性。pAJ10XM1A的低频转移可能由同一菌株中存在的另一T4SS阳性质粒pAJ10XM1A-3（GenBank：PQ463012）或其他未识别的机制介导。此外，pS11XM4A和pAJ10XM1A均可电转化至屎肠球菌CXM16A，赋予其对氟苯尼考（MIC = 64 μg∙mL^-1）和利奈唑胺（MIC = 8μg∙mL^-1）的耐药性。

**3.6 肠球菌益生菌定植促进optrA转移并改变鸡肠道菌群组成**

鉴于肠球菌在动物益生菌产品中的广泛使用和其作为ARGs传播关键载体的潜力，以及利奈唑胺耐药基因optrA在益生菌菌株中的罕见性，本研究采用鸡肠道定植模型评估了益生菌产品中optrA阳性屎肠球菌的定植能力及其对肠道菌群和ARGs传播的影响[图5（a）]。研究观察到，在实验期间对照组未分离到optrA阳性肠球菌，而定植组中利奈唑胺耐药肠球菌的分离率在前21天先下降后上升，随后保持稳定至第35天。此外，盲肠中利奈唑胺耐药肠球菌的总体分离率高于回肠（p < 0.05）[图5（b）]。在动物实验的最后阶段，我们随机从定植组肠道内容物中收集了66株肠球菌菌株，其中26株为optrA阳性，包括15株屎肠球菌（ST262、ST195和ST398）、10株粪肠球菌（ST16、ST618和ST631）和1株鸡肠球菌（E. gallinarum）（附录A图S5）。这一结果表明，optrA基因成功定植于鸡肠道菌群中，进一步表明optrA阳性屎肠球菌AJ10XM1A能够在鸡肠道中稳定定植，并促进optrA基因向其他ST型的屎肠球菌及其他肠球菌属菌株的水平转移。

基于宏基因组数据分析，第3天盲肠样本的chao1指数显著低于第14天和第35天的样本，同时也低于回肠样本和对照组。基于Bray-Curtis距离的PCoA图显示，对照组和定植组之间存在明显的聚类分离[图5（c）]。进一步分析表明，回肠菌群主要由厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）组成，而拟杆菌门（Bacteroidota）在盲肠中占主导地位。optrA阳性肠球菌定植对肠道菌群组成的影响随着鸡的生长逐渐减弱[图5（d）]。与对照组相比，回肠中罗尔斯通菌属（Ralstonia）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和大肠杆菌属（Escherichia）的增加导致了变形菌门丰度的上升，而盲肠中拟杆菌属（Bacteroides）、副拟杆菌属（Parabacteroides）和菲氏菌属（Phocaeicola）的减少则导致了拟杆菌门丰度的下降[图5（e）]。宏基因组分析证实，与对照组相比，定植组回肠和盲肠样本中屎肠球菌的水平显著升高[图5（f）]。此外，这一变化与变形菌门和拟杆菌门丰度的变化呈显著正相关（附录A图S6）。

值得注意的是，基于α多样性和PCoA分析，optrA阴性肠球菌定植组在第3天、第14天和第35天的菌群多样性和群落组成变化趋势与optrA阳性定植组相似[附录A图S7（a）~（d）]。回肠和盲肠中肠球菌的丰度随时间逐渐下降，而微生物丰富度逐渐增加[附录A图S7（e）和（f）]。这些结果表明，在鸡肠道的早期发育阶段，肠球菌的广泛定植导致盲肠中微生物多样性和丰度显著下降，但对回肠的影响较小。重要的是，这种效应似乎与菌株是否携带optrA耐药基因无关。

3.7 多药耐药肠球菌益生菌显著影响肠道耐药基因的组成和丰度

接下来，本文探讨了optrA阳性肠球菌定植对鸡肠道菌群中ARGs和MGEs的影响。结果显示，与对照组相比，定植组回肠样本（第3天和第14天）和盲肠样本（第3天）中ARGs的总相对丰度和数量均显著增加[图6（a）和（b）]。基于Bray-Curtis距离的PCoA分析显示，回肠和盲肠样本中ARGs的组成存在明显的聚类和差异[图6（c）、附录A图S8（a）]。然而，通过Shannon指数评估的ARGs多样性在定植组和对照组之间未观察到显著差异[图6（d）]。进一步分析表明，定植组中ARGs丰度的波动主要归因于特定耐药基因的显著增加。这些基因包括氨基糖苷类耐药基因[ant(6)-Ia、acc(6)-Ie和acc(6)-I]、大环内酯类、林可酰胺类和链阳霉素B（MLS）耐药基因[lsa(E)、erm(A/B)和lnu(B)]、四环素类耐药基因[tet(L/M)]，以及氯霉素类和𫫇唑烷酮类耐药基因（fexA和optrA）[图6（e）]。这一现象与optrA阳性菌株的初始高定植率有关。本研究还证实了肠球菌丰度、质粒上optrA和fexA基因的丰度以及定植菌株染色体上lsa(E)基因的丰度之间存在显著正相关[附录A图S8（b）]。此外，本研究注意到，与对照组相比，定植组回肠（第3天和第14天）和盲肠（第3天）样本中MGEs的相对丰度普遍升高，其中插入序列-转座子（IS_Tn）和质粒的相对丰度显著增加[图7（a）]。特别地，定植组中编码I类整合酶和II类整合酶的基因（intI1和intI2）、插入序列（IS1R、IS1542和IS1216E），以及质粒复制起始蛋白编码基因（repAJ10_repR、rep18b_repA、repUS12_repB和rep9a_repA）的相对丰度显著增加[图7（b）]。

相应地，由于optrA阴性肠球菌菌株CCW15A未携带额外的耐药基因，其定植未引起回肠和盲肠中AMR基因丰度的显著波动，也未显著影响AMR基因的多样性。具体而言，与optrA阳性定植组相比，optrA阴性定植组中按抗生素类别、典型耐药基因和多样性（Shannon指数）分类的AMR基因丰度显著较低[附录A图S9（a）~（f）]。此外，基于Bray-Curtis距离的PCoA分析显示，optrA阳性和optrA阴性定植组在盲肠和回肠中AMR基因的组成存在一定程度的聚类分离[附录A图S10（a）和（b）]。这些结果证实，益生菌肠球菌菌株可作为多种重要AMR基因的载体，广泛使用多药耐药肠球菌会显著影响鸡肠道微生物群中耐药基因的组成结构和丰度。

3.8 MGEs在肠球菌益生菌向肠道菌群转移ARGs中起关键作用

网络相关性分析显示，在回肠和盲肠样本中，氯霉素/𫫇唑烷酮类耐药基因（如optrA和fexA）不仅与插入序列、转座子和质粒等MGEs呈显著正相关，还与芽孢杆菌属、Kiritimatiellia、放线菌属等细菌呈显著正相关[图7（c）、附录A图S11（a）]。此外，本研究证实了肠道样本中IS1216E和repR基因的相对丰度与optrA基因和屎肠球菌的丰度呈显著正相关[附录A图S11（b）]。这些结果证实了optrA阳性肠球菌定植对肠道ARGs、MGEs和菌群的显著影响，表明optrA基因可能在肠道菌群中发生转移。

为确定optrA基因是否已转移至正常肠道菌群，本研究通过宏基因组分箱分析研究了携带optrA和fexA基因的contigs及其可能的细菌宿主。结果显示，从盲肠和回肠样本中共鉴定到30个携带optrA的MAGs，其中21个MAGs（70%）为中等质量MAGs，满足大于50%完整性和小于10%污染的最低标准。这些MAGs通过GTDB-tk（v2.2.0）鉴定为盲肠肠球菌（E. cecorum, n = 10）、鸡肠球菌（n = 2）、卷曲乳杆菌（L. crispatus, n = 2）、粪肠球菌（n = 2）、屎肠球菌（n = 4）和坚忍肠球菌（E. durans, n = 1）。关于MAGs的详细信息见附录A表S8。分析显示，所有contigs均携带一个相对保守的IS1216E-fexA-optrA基因簇，与携带optrA的质粒pAJ10XM1的相应区域序列相似性大于90%。然而，在所有MAGs的contigs中均未鉴定到携带IS1216E的pAJ10XM1质粒的完整序列，表明IS1216E可能比质粒更有效地介导optrA基因向其他肠道细菌的转移[图7（d）]。

4 讨论

自2020年我国政府通过法律禁止在动物饲料中使用抗生素以来，畜牧业中抗生素的使用显著减少。因此，益生菌作为抗生素替代品的开发和应用受到了广泛关注[28‒29]。然而，与人类用益生菌产品的严格监管相比，兽用益生菌的安全性，特别是其传播抗生素耐药性的潜力，受到的监管较为有限[30]。据我们所知，本研究是首次对我国兽用益生菌产品的质量及其ARGs传播风险进行的大规模系统调查。

本研究表明，我国部分商业兽用益生菌产品不符合良好生产规范（GMP）标准，存在标签错误、益生菌活菌数不足以及乳酸菌属分离率低等质量问题，这与之前的报道[5]一致。重要的是，本研究从33%的采样兽用益生菌产品中分离出了机会性病原菌，包括阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）、沙门氏菌（Salmonella）和蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）。这些机会性病原菌未表现出明显的克隆谱系或聚类系统发育关系，表明这些菌株可能是在生产过程中被随机污染的。这些机会性病原菌不仅携带多种ARGs和毒力因子，还在益生菌的广泛使用背景下构成潜在的动物中毒或感染风险[31‒32]。

益生菌菌株的系统发育分析显示，芽孢杆菌属和肠球菌属内存在相对多样化的ST类型。同一物种的益生菌菌株表现出多个进化分支；特别是从益生菌中分离的某些肠球菌菌株与人类中潜在的致病性肠球菌表现出较近的遗传关系。这些结果表明，与人类和婴儿用益生菌的严格菌株级要求相比，兽用益生菌菌株，特别是肠球菌属菌株，表现出显著的种内异质性，遗传背景不明确，缺乏统一的菌株标准[33]。

关于抗生素耐药性，本研究结果表明，益生菌中的芽孢杆菌属和乳酸菌属主要表现出由染色体介导的固有耐药性，未在质粒上发现可转移的AMR基因。相比之下，某些肠球菌菌株表现出复杂的耐药模式，并携带多种典型的可转移耐药基因。特别地，本研究鉴定到了两种携带optrA或fexA基因的新型质粒，它们能够在体外以较低频率接合至其他肠球菌。这些结果表明，芽孢杆菌和乳酸菌益生菌的ARGs传播风险较低，而肠球菌益生菌的风险较高，这与之前关于肠球菌益生菌可能传播耐药基因的担忧一致[34]。

先前研究表明，动物肠道是ARGs水平传播的热点区域[35]。本研究表明，无论是否携带多药耐药基因，广泛使用肠球菌益生菌都会影响鸡回肠和盲肠菌群的组成，导致早期定植阶段菌群丰度和多样性的显著下降。这与之前的研究一致，即肠球菌的优势可能通过竞争抑制或代谢物相互作用促进其他致病菌（如大肠杆菌和沙门氏菌）的生长，进一步加剧肠道微生态失衡[36‒37]。微生物丰度的下降可能促进接种细菌的定植和ARGs的传播[38‒39]。此外，我们观察到实验组回肠和盲肠中optrA阳性肠球菌的持续定植，伴随着ARGs和MGEs丰度的显著增加，这一现象持续至实验结束（35天）。ARGs与MGEs（如插入序列和整合酶）之间也存在显著相关性，这可能促进ARGs向共生菌群的水平转移。尽管由于第二代宏基因组测序和分析的限制，我们未能直接证明耐药质粒向其他微生物的转移，但我们证实了IS1216E转座子介导的optrA基因向盲肠肠球菌、鸡肠球菌和卷曲乳杆菌等共生菌的水平转移。IS1216E是某些革兰氏阳性菌（如肠球菌）中常见的插入序列[40]。IS1216E在鸡肠道菌群中的存在增加了水平基因转移事件的可能性，从而加速了重要ARGs在肠道内的传播。因此，一旦用作益生菌的肠球菌菌株获得MGEs和可转移的ARGs，它们很容易成为ARGs的载体，在牲畜肠道中持续定植并传播耐药基因。

基于以上研究结果，本研究提出了以下关于兽用益生菌菌株使用和生产的建议。首先，益生菌（特别是肠球菌）应进行严格的分子水平鉴定。除了筛选常见的毒力因子外，还必须评估MGEs（如IS1216E）和可转移的AMR基因（如optrA），以降低这些菌株作为抗生素耐药性传播载体的风险。其次，应在个体菌株水平上建立兽用益生菌菌株的标准化指南。这将有助于统一商业兽用益生菌菌株的遗传背景和信息，从而建立全面的菌株追溯系统。还应遵循菌株的物种特异性适用性原则，这需要对不同牲畜物种进行定制化的适应性评估和实验研究，以确保益生菌的有效性和安全性。最后，应根据GMP指南优化生产过程，以确保益生菌产品的一致性、效力和纯度，同时防止生产过程中病原微生物的污染。

总之，本研究证实了我国兽用益生菌产品存在的具体问题，如不符合GMP生产标准以及益生菌菌株遗传背景不明确。当携带多种ARGs的不合格肠球菌菌株被广泛用作益生菌时，不仅会破坏肉鸡正常肠道菌群的平衡，还会成为肠道ARGs传播的储存库和源头。因此，未来应谨慎考虑肠球菌菌株作为畜牧益生菌的大规模应用，以减轻对牲畜和公共健康的潜在不利影响。同时，除了严格筛选合格菌株和规范生产外，还应建立跨部门协作机制，加强对兽用益生菌行业供应链的监管，并制定全面的使用指南，以确保兽用益生菌产品的质量和安全。

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