小檗碱通过抑制肠道菌群代谢物δ-氨基戊酸甜菜碱保护脑血管并改善糖尿病脑病

张正威 ,  王伟平 ,  胡家淳 ,  鲁金月 ,  冯茹 ,  徐少峰 ,  王玲 ,  符洁 ,  于航 ,  徐慧 ,  张浩健 ,  杨新宇 ,  翟钊 ,  王竟越 ,  叶孟亮 ,  左恒通 ,  宋建业 ,  赵一 ,  回翔 ,  王晓良 ,  蒋建东 ,  王琰

Engineering ›› 2025, Vol. 49 ›› Issue (6) : 290 -303.

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Engineering ›› 2025, Vol. 49 ›› Issue (6) : 290 -303. DOI: 10.1016/j.eng.2025.04.018
研究论文

小檗碱通过抑制肠道菌群代谢物δ-氨基戊酸甜菜碱保护脑血管并改善糖尿病脑病

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Berberine Protects Cerebral Vessels and Alleviates Diabetic Encephalopathy by Inhibiting the Production of δ-Valerobetaine in the Gut Microbiota

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摘要

糖尿病患者的高血糖会导致认知损害，即糖尿病脑病（DE）。DE的发病机制与血管病变密切相关，临床迫切需要有效治疗。植物来源药物小檗碱（BBR）可有效降低糖尿病患者的血糖水平。本文首次证实，BBR可显著改善2型糖尿病脑病KK‑Ay（2DEK）小鼠的认知功能。通过荧光显微光学切片断层成像技术（fMOST）的高分辨率成像可见，BBR处理后脑血管的完整性得到改善。在顶叶联合皮层（PtA）及海马CA1、CA3区域，血管平均直径、血管长度与总血管体积均显著改善。机制研究表明，口服BBR可抑制肠道菌群代谢产物δ-氨基戊酸甜菜碱（δ-VB）的产生。由于肠源性δ-VB可进入体循环并与Toll样受体-4（TLR-4）相互作用，从而在血管上皮细胞中激活TLR-4/髓样分化因子88（MyD88）/核因子κB（NF-κB）炎症通路，BBR可能通过降低肠道δ-VB水平来保护DE小鼠的脑血管并改善其脑功能。来源于BBR处理小鼠的粪菌移植（FMT）实验进一步证实了肠道菌群在其中的关键作用。此外，BBR还通过调节产短链脂肪酸（SCFA）/脂多糖（LPS）细菌的丰度来增加SCFA的产生，并降低肠道中的LPS水平，进而协同抑制TLR-4/MyD88/NF-κB炎症通路。综上，我们发现肠道菌群代谢物δ-VB是导致脑血管病变及认知障碍的可能机制，而BBR可通过下调肠道中的δ-VB水平保护脑血管，从而改善DE。

Abstract

Hyperglycemia in individuals with diabetes causes cognitive impairment, called diabetic encephalopathy (DE). The pathogenesis of DE is closely related to angiopathy, and effective treatment is highly desirable. The botanical agent berberine (BBR) effectively lowers blood glucose in diabetic patients. Here, we show for the first time that BBR significantly improved cognitive function in type 2 diabetic encephalopathy KK-Ay (2DEK) mice. High-resolution imaging via fluorescence micro-optical sectioning tomography (fMOST) revealed that the integrity of brain vessels was improved by BBR treatment. The improvements in average vessel diameter, vessel length, and total vessel volume were significant in the parietal association cortex (PtA), as well as in the CA1 and CA3 regions. A mechanistic study revealed that oral BBR inhibited δ-valerobetaine (δ-VB, a metabolite of the gut microbiota) production in the intestine. As intestinal δ-VB can enter the circulation and activate the Toll-like receptor-4 (TLR-4)/myeloid differentiation factor 88 (MyD88)/nuclear factor kappa B (NF-κB) inflammatory pathway in the epithelial cells of blood vessels through interacting with TLR-4, BBR might reduce the intestinal level of δ-VB to protect the cerebral blood vessels of DE mice and improve their brain function. Fecal microbiota transplantation (FMT) using the gut microbiota from BBR-treated mice confirmed the vital role of the gut microbiota. BBR showed a wide range of effects on the gut flora, also increasing short-chain fatty acid (SCFA) production and decreasing lipopolysaccharide (LPS) levels in the intestine by adjusting the abundance of SCFA- or LPS-producing bacteria. The observed therapeutic efficacy in vivo revealed a synergistic effect of BBR on the gut microbiota. Conclusively, we found an association between the gut microbiota and blood vessels, of which intestinal δ-VB might be a chemical link. Mainly through downregulating δ-VB in the intestine, BBR protected cerebral vessels and alleviated DE.

关键词

小檗碱 / 肠道菌群炎症δ-氨基戊酸甜菜碱 / 糖尿病脑病

Key words

Berberine / Gut microbiota / Inflammation / δ-Valerobetaine / Diabetic encephalopathy

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张正威,王伟平,胡家淳,鲁金月,冯茹,徐少峰,王玲,符洁,于航,徐慧,张浩健,杨新宇,翟钊,王竟越,叶孟亮,左恒通,宋建业,赵一,回翔,王晓良,蒋建东,王琰. 小檗碱通过抑制肠道菌群代谢物δ-氨基戊酸甜菜碱保护脑血管并改善糖尿病脑病[J]. 工程（英文）, 2025, 49(6): 290-303 DOI:10.1016/j.eng.2025.04.018

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1 引言

糖尿病脑病（DE）是一种由糖尿病引起的伴有中枢神经系统功能异常的脑病[1]。糖尿病患者患痴呆的风险比非糖尿病患者约高73%，尤其是中年2型糖尿病患者[2]。DE与记忆力减退和学习功能障碍等临床表现密切相关[3]，可能导致阿尔茨海默病（亦称“3型糖尿病”）等严重后果[4]。DE的发病机制非常复杂，尚未完全阐明。其中，高血糖等因素可引起脑血管炎症，相关损伤机制与半乳糖凝集素-3（Gal-3）[5‒6]、Toll样受体-4（TLR-4）[7]和核因子κB（NF-κB）[8‒9]等的激活密切相关，导致脑血管壁受损、内皮细胞坏死，并随后发展为脑血管数量减少等显著的病理损伤[10]。因此，通过靶向作用TLR-4和NF-κB来阻断炎症通路可能部分恢复脑血管生理功能并改善脑功能。

研究显示，肠道菌群及其代谢物在神经与精神疾病治疗中起关键作用[11]。靶向“肠-脑轴”已成为近年来新药研发的重要方向。例如，巴戟天寡糖可以通过肠道菌群正向调节色氨酸-5-羟色氨酸-血清素代谢通路，从而促进5-羟色氨酸的释放并发挥抗抑郁作用[12]。逍遥丸中的芍药内酯苷或芍药苷等化合物可被肠道菌群代谢并转化为苯甲酸等活性代谢物[13‒15]。这些代谢物可以穿过血脑屏障，减少脑内脂肪酸酰胺水解，并发挥抗抑郁作用[15]。此外，肠道菌群代谢物也可能参与脑病的发生发展。δ-氨基戊酸甜菜碱（δ-VB）是近年来发现的一种肠道菌群代谢物，它能够穿过血脑屏障并导致与年龄相关的认知记忆衰退和认知功能障碍[16]。研究表明δ-VB可能直接损伤脑微环境，但其详细机制尚不清楚。因此，调节肠道菌群可能是治疗DE的一种潜在策略。识别可能与DE相关的肠道菌群及其代谢物的特征，对于发现治疗该疾病的药物具有重要潜在意义。

小檗碱（BBR）是从中药黄连中提取的一种异喹啉生物碱。自2004年以来，我们课题组以及其他研究者发现BBR在临床上是一种安全有效的治疗高脂血症和2型糖尿病的药物[17‒18]。与大多数已知的降糖或降脂药物不同，口服途径给予的BBR能有效地与肠道菌群相互作用[19]。作为我们持续研究的一部分[20‒25]，我们在此表明，BBR通过抑制肠道菌群中δ-VB的产生，从而阻断血管内皮细胞中的TLR-4/髓样分化因子88（MyD88）/NF-κB炎症通路，在很大程度上改善了大脑中的血管状态并减轻了DE。据我们所知，本研究首次揭示肠道δ‑VB是肠道菌群与DE中的脑血管炎症的关键连接物质。目前，在临床上保护脑血管免受高血糖诱发的炎症损伤仍然很困难，鉴于BBR已被用作非处方药且具有良好的安全性，我们认为本研究具有较高的临床转化潜力。

2 材料与方法

2.1 BBR在2型糖尿病脑病KK-Ay（2DEK）小鼠中的疗效

C57BL/6J小鼠（雄性，42~49日龄）和KK-Ay小鼠（雄性，42~49日龄）由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。动物饲养在受控环境中，自由摄取食物和水，室温维持在(22±2) ℃，12 h光照/12 h黑暗循环。研究根据机构指南和伦理进行，并获得中国医学科学院&北京协和医学院实验室动物护理和使用委员会的批准（编号：00005020）。研究遵循我国实验动物管理委员会的所有伦理准则。

30只KK-Ay小鼠和10只C57BL/6J小鼠在分组前适应一周。随后，C57BL/6J小鼠喂食常规饲料（对照组，口服纯水），KK-Ay小鼠自由摄入KK饲料（编号：1042）。每周测量小鼠体重和6 h空腹血糖，使用ACCU-CHEK® Performa血糖仪（罗氏糖尿病护理有限公司）测量空腹血糖。10周后，从连续3周6 h空腹血糖水平不低于11.1 mmol∙L-1的KK-Ay小鼠中筛选出2DEK小鼠。然后将2DEK小鼠随机分为3组，并给予不同药物治疗10周。这3组分别是模型组（口服纯水，M组；n = 10）、BBR低剂量组（口服，100 mg∙kg-1∙d-1，BBR-L组；n = 10）和BBR高剂量组（口服，200 mg∙kg-1∙d-1，BBR-H组；n = 10）。在治疗期间，每周固定时间测量小鼠体重和6 h空腹血糖。治疗结束时，对每组小鼠进行口服葡萄糖耐量试验，灌胃给予D-葡萄糖（2 g∙kg-1），并在15 min、30 min、60 min和120 min后测量血糖水平。然后进行新物体识别实验[26]和跳台实验[27]，并收集小鼠新鲜粪便用于16S rRNA基因测序分析。根据跳台实验结果，选择每组中等水平的小鼠进行荧光显微光学切片断层扫描（fMOST；n = 3来自M组，n = 3来自BBR-H组）。收集其他小鼠的血清、结肠和脑组织。用于测定其他指标的方法见附录A。

2.2 通过fMOST进行高分辨率成像

将3只KK-Ay小鼠（来自M组）和3只BBR处理的KK-Ay小鼠（来自BBR-H组）用10%水合氯醛溶液（每10 g体重对应0.4 mL溶液）麻醉。然后通过尾静脉注射番茄凝集素DyLight 488（每只小鼠140 μL）以标记血管。用0.01 mol∙L-1的磷酸盐缓冲液（PBS）和4%多聚甲醛经心脏灌注小鼠。取出的脑组织在4 ℃下用4%多聚甲醛固定24 h。此外，每个脑组织用PBS冲洗2次（每12 h一次）。然后，将脑组织在梯度乙醇（50%和75%各2 h）中脱水，并在无水乙醇中脱水3次，其中前两次不含0.3%苏丹黑B（SBB），每次2 h，第3次含0.3%苏丹黑B，过夜。随后，使用梯度LR white树脂（50%、75%、100%各2 h）对每个脑组织进行渗透，接着用100% LR white树脂渗透48 h。渗透后，将脑样本包埋在明胶胶囊中，并在真空干燥箱中按梯度温度（45 ℃、2 h，48 ℃、4 h，50 ℃、2 h）聚合。用于渗透和聚合的LR white树脂和乙醇均含有0.3% SBB。100% LR white树脂由过滤的LR white树脂按每5 mL树脂添加0.03 g 2,2'-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)制成。将完整脑组织取出、染色并包埋在LR white树脂后，对样本进行成像。

成像和图像预处理：树脂包埋的完整小鼠脑组织使用fMOST系统（Biomapping 5000；武汉沃亿生物有限公司）进行自动连续切片和成像。所有图像文件以8-bit深度保存，体素大小为0.35 μm × 0.35 μm × 2 μm。每个小鼠脑的连续数据采集持续4天；每个小鼠脑的原始数据总未压缩体积超过3 TB，产生大约4500~5000个冠状切片。脑血管系统的原始成像数据集使用OE-Bio mapping预处理软件进行预处理，通过组装马赛克并校正照明提高图像质量。预处理后的数据集以标签图像文件格式（TIFF）保存。

所有冠状切片使用预处理软件重采样至体素大小为1 μm × 1 μm × 2 μm。为了便于计算血管的直径、长度和体积，对高分辨率切片进行重采样是必要的步骤。我们将重采样后的切片转换为Imaris文件格式，并使用Imaris 9.5重建全脑。应用Imaris软件的表面模块来构建尽可能贴合血管的表面模型。考虑到脑区体积的差异，本研究计算了脑区的血管表面积与体积比，以评估糖尿病对小鼠脑血管的影响。单个脑亚区被三维裁剪成一个245 μm × 140 μm × 200 μm的立方体，原始体素大小为0.35 μm × 0.35 μm × 2 μm。选择的脑亚区位置在KK-Ay小鼠组和BBR处理小鼠组之间尽可能一致。使用Imaris软件的丝状迹线功能自动追踪血管网络。主要定量参数包括平均血管直径、血管长度密度和血管体积。通过表面功能分析脑亚区血管体积和片段数量。虽然可以使用丝状迹线功能计算血管体积，但丝状迹线测量的血管内体积会低于实际血管体积。

2.3 粪菌移植（FMT）在2DEK小鼠中的疗效

在获得批准（编号：00005468）后，共获得45只KK-Ay小鼠（雄性，42~49日龄）和15只C57BL/6J小鼠（雄性，42~49日龄），小鼠在分组前适应一周。C57BL/6J小鼠喂食常规饲料（对照组，口服纯水），KK-Ay小鼠自由获取KK饲料以建立2DEK小鼠模型。然后，将2DEK小鼠随机分为三组：模型组（口服纯水，M组；n = 15）、BBR高剂量组（口服，200 mg∙kg-1∙d-1，BBR-H组；n = 15）和FMT组（口服纯水，FMT组；n = 15）。BBR-H治疗六周后，使用抗生素混合物建立伪无菌模型，然后使用来自BBR-H组小鼠的新鲜粪便进行FMT，持续三周。抗生素混合物的制备和给药方案如下：将含有头孢西丁、庆大霉素、甲硝唑和万古霉素各10 mg∙kg-1的混合物溶解在PBS中。FMT处理的小鼠连续3天口服该抗生素混合物，以建立短期伪无菌模型，有效清除原生肠道菌群。随后，在第4天给予盐酸克林霉素（33.3 mg∙kg-1）以在实验时间线内维持微生物群抑制[16]。治疗结束时，进行口服葡萄糖耐量试验。之后，进行莫里斯水迷宫[29]、新物体识别实验和跳台实验，并收集新鲜粪便用于16S rRNA基因测序分析。收集其他小鼠的血清、结肠和脑组织。其他指标的测定方法见附录A。

2.4 在高糖诱导的bEnd.3细胞中测定Gal-3和TLR-4/MyD88/NF-κB信号通路

实验包括9组：对照组（仅完全培养基）、M组（仅完全培养基）、脂多糖（LPS）组（100 ng∙mL-1）、δ-VB组（200 μmol∙L-1）、乙酸钠（SA）组（1 mmol∙L-1）、丙酸钠（SP）组（1 mmol∙L-1）、丁酸钠（SB）组（2 mmol∙L-1）、异丁酸钠（SIB）组（2 mmol∙L-1）和改性柑橘果胶（MCP）组（2 mg∙mL-1）。将对数生长期的bEnd.3细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司）铺在六孔板中，培养24 h直至细胞长满孔底。除对照组外，向其他组细胞添加额外含有30 mmol∙L-1D-葡萄糖的培养基，对照组添加等量的完全培养基。培养24 h后，将上述化合物添加到相应的组中（n = 6）。再培养24 h后，收集bEnd.3细胞并裂解，并通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）定量测定Gal-3、TLR-4、MyD88、NF-κB P65、NF-κB p-P65、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的水平（试剂购自北京冬歌博业生物科技公司）。

2.5 统计分析

使用GraphPad Prism 8进行统计分析，采用双尾Student t检验或单因素方差分析（ANOVA），然后进行Dunnett t检验。在进行ANOVA分析之前，使用Levene检验确认方差齐性。使用Spearman相关进行相关性统计分析。P值小于0.05被认为具有统计学意义。

详细方法和材料见附录A。

3 结果

3.1 BBR减少脑血管损伤并保护脑功能免受高血糖诱导的脑病影响

为评估BBR是否能够改善DE，本研究以30只KK-Ay小鼠建立2DEK模型（另取10只C57BL/6J小鼠为对照）。随后将2DEK小鼠随机分为3组并口服给药10周，具体分组如下：模型组（M, n = 10）、BBR低剂量组（BBR-L, 100 mg∙kg-1∙d-1, n = 10）与BBR高剂量组（BBR-H, 200 mg∙kg-1∙d-1, n = 10）[附录A中的图S1（a）]。疗程结束后，依据行为学测试结果在各组中选择居中水平的小鼠用于fMOST成像（M组 n = 3；BBR-H组 n = 3）。首先，我们检查了脑内血管。为获得高分辨率的全脑血管图像，我们对两组小鼠的连续切片进行三维（3D）血管网络重建。将500张切片投影为1000 μm厚的冠状切片，可直观显示全脑血管的3D图像。冠状面显示整个大脑的血管均被红色荧光清晰标记（图1），其中皮层血管尤为丰富，密度高于海马和纹状体等区域[图1（a）]。在放大观察（比例尺为50 μm或20 μm）时可见，与BBR-H处理组相比，KK-Ay模型小鼠的图像背景更为模糊，且在全脑包括皮层、海马与纹状体的血管间散布大量红色小点。我们进一步选择血管较为丰富的顶叶联合皮层（PtA）区域[30]来比较差异。图1（a）右侧清晰显示了未经处理的KK‑Ay模型小鼠（M组）与BBR‑H处理小鼠（BBR‑H组）之间的差别。糖尿病小鼠的毛细血管完整性与血脑屏障（BBB）通透性可能受损[31‒32]。本研究经尾静脉注射番茄凝集素标记的DyLight488红色荧光探针（一种红色凝集素荧光染料），该染料仅与血管内皮结合，理论上不应出现在血管外。图1右侧（PtA、CA1与CA3）显示，未经治疗的KK‑Ay模型小鼠血管间组织出现大量红色荧光信号，提示脑血管发生渗漏并暗示血管内皮细胞受损。为验证血管通透性确实受损，如图2（a）和（b）所示，我们对原始未处理图像的灰度值进行测量。与BBR-H组相比，KK-Ay模型组的图像灰度值显著增高；BBR-H组的图像背景明显更清晰。这提示KK-Ay模型小鼠中DyLight488由血管渗漏至周围组织，而BBR具有血管保护作用。这些发现表明，BBR治疗可以改善脑血管的完整性。

为了确定BBR-H如何改善血管功能，我们选择了海马的PtA、CA1和CA3区三个脑区（每个组织样本大小为245 μm × 140 μm × 200 μm），并测量了BBR-H给药前后血管直径、血管长度密度和血管体积的变化。如图2（c）~（e）所示，BBR-H治疗后，PtA和CA1区的平均血管直径分别显著增加了6.91%和8.20% [每组n = 3；*P < 0.05，BBR-H组 vs M组；图2（c）和（d）]；而在CA3区，平均血管直径增加了8.35%，P值为0.10 [BBR-H组 vs M组；图2（e）]。在本研究中，血管长度密度指的是245 μm × 140 μm × 200 μm组织块中的总血管长度，此指标先前已有报道[33]。BBR-H治疗使PtA区的总血管长度密度显著增加了25.62% [每组n = 3；*P < 0.05，BBR-H组 vs M组；图2（f）]；CA3区增加了9.64% [P = 0.16；图2（g）]；CA1区无明显变化[图2（h）]。BBR-H治疗后，PtA和CA3区的总血管体积也分别显著增加了39.80%和27.73% [每组n = 3；*P < 0.05, **P < 0.01，BBR-H组 vs M组；图2（i）和（j）]；在CA1区，总血管体积增加了9.64%，但差异无统计学意义[P = 0.42；图2（k）]。总之，这些发现表明BBR-H改善了KK-Ay小鼠的血管功能。PtA区在平均血管直径、血管长度密度和总血管体积方面的改善比CA1和CA3区更明显，这可能反映了PtA区丰富的血管供应[30]。我们推测KK-Ay模型小鼠脑图像的模糊性是由高血糖诱导的血管完整性损伤引起的，这导致荧光染料泄漏到血管外并标记了受损的内皮碎片。

为了定量分析两组图像的清晰度，我们比较了原始未处理图像中血管的灰度值；使用ImageJ软件随机检测每个图像中血管的10个数据点的灰度值。然后将检测到的100个点的灰度平均值作为每只小鼠图像的灰度值[图2（a）]。计算得出的KK-Ay模型小鼠和BBR-H处理小鼠原始图像的灰度值分别为(56.32 ± 1.74)%和(29.09 ± 2.21)% [n = 3; **P < 0.01，BBR-H组 vs M组；图2（b）]。KK-Ay模型小鼠图像的灰度值是BBR-H处理小鼠的1.94倍。与BBR-H小鼠相比，KK-Ay模型小鼠的原始脑图像确实具有模糊的背景，这表明BBR对大脑血管完整性具有保护作用。

在脑功能方面，所有40只小鼠对相似物体的识别能力均正常[图3（a）]。然而，对于新物体的识别，口服BBR（100 mg∙kg-1或200 mg∙kg-1）治疗后，2DEK小鼠受损的认知和记忆功能得到恢复，因为BBR-L组和BBR-H组花费在新物体上的时间分别显著增加至11.50 s和13.70 s，而M组为10.00 s [*P < 0.05, ***P < 0.001；图3（b）]。跳台潜伏期在BBR-L组和BBR-H组分别显著增加至156.60 s和167.60 s，而M组为92.10 s [*P < 0.05, **P < 0.01；图3（c）]。此外，错误次数在BBR-L组和BBR-H组分别从M组的2.0次显著减少至0.6次和0.3次[*P < 0.05, **P < 0.01；图3（d）]。

从系统角度看，BBR还能以剂量依赖的方式显著降低2DEK小鼠的体重和空腹血糖水平[***P < 0.001；附录A图S1（b）和（c）]，改善其葡萄糖耐量[***P < 0.001；附录A图S1（d）和（e）]，并降低糖化血红蛋白水平[**P < 0.01, ***P < 0.001；附录A图S1（f）]。

DE与炎症密切相关[34‒35]。与对照组相比，M组小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著更高（**P < 0.01, ***P < 0.001）。然而，用BBR治疗的小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著降低[**P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；附录A图S1（g）~（i）]，这表明BBR可以改善2DEK小鼠的高炎症状态。相应地，组织学检查结果显示，BBR可以减少2DEK小鼠的炎症病理表现，如海马区神经元萎缩[图3（e）]和肠道渗漏[图3（f）]，并显著恢复结肠上皮屏障中紧密连接蛋白（如ZO-1、occludin和claudin-5）的表达[**P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；图3（g）~（i）]以及其在脑中的表达[**P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；图3（j）~（l）]。此外，我们检测了Gal-3，因为它是一种与炎症相关的蛋白，可能加速炎症和胰岛素抵抗，从而参与糖尿病的发生和发展[36]。本研究发现，与对照组相比，M组小鼠结肠和脑中的Gal-3水平更高[图4（a）和（b）]；而BBR治疗显著降低了2DEK组小鼠结肠、血清和脑中Gal-3的表达水平[**P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；图4（c）~（e）]。BBR通过局部恢复2DEK小鼠受损的肠道屏障功能或系统性降低炎症因子，减轻了结肠和海马区的炎症损伤。

这些炎症标志物（包括脑、血清和结肠中的Gal-3，以及血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6）与行为学结果呈负相关（*P < 0.05），在新物体识别实验中的相关系数范围为-0.4867~-0.6069，在跳台实验中为-0.2630~-0.6914（附录A表S1）。在这些炎症因子中，脑中的Gal-3可能是指示DE进展的最关键的指标，因为在识别实验中观察到Gal-3的最大相关系数分别为-0.6069和-0.6914（表S1），这表明脑内Gal-3水平越高，记忆损伤越严重。BBR可能以剂量依赖的方式降低结肠中的Gal-3来减少脑中的Gal-3，从而减轻记忆损伤。

3.2 BBR通过作用肠道菌群缓解DE

由于口服后大量BBR在肠道积累[37]，我们使用FMT来探索BBR的作用模式[附录A图S2（a）]。为了满足FMT治疗的先决条件，我们使用抗生素混合物去除了粪便中87.3%的好氧菌[***P < 0.001；附录A图S2（b）和（c）]和93.86%的厌氧菌[***P < 0.001；附录A图S2（d）和（e）]。随后，使用BBR-H处理的2DEK小鼠作为FMT的供体，并在移植前用PBS离心洗涤粪便样本。在脑功能方面，FMT显著恢复了2DEK小鼠因高血糖水平而受损的认知功能[图4（f）和（g）]，因为BBR-H组和FMT组花费在新物体上的时间分别显著增加至12.60 s和12.50 s，而M组为9.92 s（*P < 0.05, ***P < 0.001）。FMT还显著恢复了2DEK小鼠受损的记忆功能[图4（h）和（i）]，表现为跳台潜伏期在BBR-H组和FMT组分别显著增加至164.46 s和159.29 s，而M组为91.54 s（*P < 0.05, **P < 0.01）。此外，错误次数从M组的2.31次显著减少至BBR-H组和FMT组的0.46次和0.50次（*P < 0.05, ***P < 0.001）。另外，BBR-H和FMT进一步恢复了2DEK小鼠受损的空间记忆，在训练的第5天，BBR-H组和FMT组的逃避潜伏期相较于M组显著缩短[*P < 0.05, ***P < 0.001；图4（j）]。与M组相比，BBR-H组和FMT组的首次穿越时间分别显著减少至31.82 s和37.44 s，而M组为72.34 s [*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；图4（k）]。此外，穿越次数从M组的0.54次显著增加至BBR-H组和FMT组的2.62次和2.50次[*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；图4（l）]。这些结果表明，BBR对DE小鼠脑功能的改善可能通过肠道菌群实现。

此外，FMT显著降低了2DEK小鼠的体重[***P < 0.001；附录A图S2（f）]、空腹血糖水平[***P < 0.001；附录A图S2（g）]和糖化血红蛋白水平[***P < 0.001；附录A图S2（h）]，并改善了葡萄糖耐量[***P < 0.001；附录A图S3（a）和（b）]。与M组相比，FMT还显著抑制了2DEK小鼠的炎症，表现为TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低[*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；附录A图S3（c）~（e）]。此外，FMT显著降低了脑、血清和结肠中的Gal-3水平[*P < 0.05, **P < 0.01；附录A图S3（f）~（h）]，并抑制了结肠和脑中Gal-3的表达[附录A图S3（i）和（j）]。由于结肠[*P < 0.05, **P < 0.01；附录A图S4（a）~（c）]和脑[*P < 0.05, **P < 0.01；附录A图S4（d）~（f）]中紧密连接蛋白（ZO-1、occludin和claudin-5）的表达显著恢复，2DEK小鼠中由炎症损伤引起的肠道渗漏[附录A图S4（g）]和海马神经元萎缩[附录A图S4（h）]得以减轻。

3.3 BBR通过调节肠道菌群代谢物δ-VB、短链脂肪酸和脂多糖的产生来改善DE

通过分析16S rRNA基因测序结果，我们发现BBR能显著改变2DEK模型小鼠肠道菌群的多样性和丰富度[附录A图S5（a）~（d）]。此外，BBR治疗后肠道菌群的组成发生了变化[附录A图S5（e）和（f）]。在门水平上，BBR增加了拟杆菌门的占比，并抑制了变形菌门的过度生长[图5（a）]，这与相应的目和科水平的趋势一致[图5（b）和（c）]。在属水平上，在图5（d）中用红色箭头标记的13个属（如拟杆菌属、异杆菌属和阿克曼菌属）在BBR治疗后丰度更高，这些属与短链脂肪酸的合成密切相关[38‒39]。此外，另外7个用蓝色箭头标记的属（特别是大肠肝菌-志贺氏菌属、克雷伯菌属和柠檬酸杆菌属）的丰度较低[图5（d）]，这些属与脂多糖的产生密切相关[40]。

类似地，FMT也显著改变了2DEK模型小鼠肠道菌群的多样性和丰富度[附录A图S5（g）~（l）]。此外，FMT组小鼠的肠道菌群组成与BBR-H组一致[附录A图S5（a）~（f）]。FMT促进了有益菌属的恢复，如拟杆菌属、异杆菌属和阿克曼菌属，但抑制了几个有害菌属的过度生长，如大肠肝菌-志贺氏菌属、克雷伯菌属和柠檬酸杆菌属（图6）。

有趣的是，BBR和FMT均显著抑制了δ-VB的产生[*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；图7（a）~（f）]，δ-VB是一种肠道菌群代谢物，据报道会导致认知衰退[16]。δ-VB的水平与新物体识别实验（接触新物体的时间）和跳台实验（跳台潜伏期）的结果呈负相关。δ-VB与新物体识别实验结果之间的相关系数在粪便中为-0.4629，在血清中为-0.4395，在脑中为-0.5888；δ-VB与跳台潜伏期之间的相关系数在粪便中为-0.5301，在血清中为-0.5239，在脑中为-0.7354（附录A表S2）。因此，脑中的δ-VB水平也可能是BBR治疗DE疗效的潜在生物标志物，其水平与异杆菌属和嗜胆菌属的丰度相关性最强，相关系数分别为-0.7136和0.7160（附录A中的表S3）。

此外，本研究通过气相色谱-质谱法在体内分析了短链脂肪酸的水平。结果显示，BBR显著提高了2DEK小鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸和异丁酸的水平[*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；附录A图S6（a）~（d）]。血清和脑中短链脂肪酸水平的趋势与粪便中的趋势一致[*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；附录A图S6（e）~（l）]。然而，BBR治疗后体内其他短链脂肪酸的水平没有显著升高（附录A图S7）。类似地，FMT也显著增加了2DEK小鼠的乙酸、丙酸和丁酸水平（*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001），并在一定程度上上调了异丁酸的表达（附录A图S8）。其中，粪便样本中的乙酸、丙酸和丁酸可能是BBR改善2DEK小鼠行为症状效应的潜在药效学生物标志物，具有良好的相关性（附录A表S4），且主要与普雷沃氏菌属、丁酸球菌属和异杆菌属相关（附录A表S5）。

相比之下，BBR和FMT均显著降低了2DEK小鼠血清中脂多糖和脂多糖结合蛋白的水平（*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001），这与脑中的变化一致（*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；附录A图S9）。因此，降低血清中脂多糖和脂多糖结合蛋白水平，对于BBR改善DE也可能具有重要意义（附录A表S6），特别是BBR对产生脂多糖或脂多糖结合蛋白的细菌（如大肠杆菌-志贺氏菌属和柠檬酸杆菌属）的作用机制方面（附录A表S7）。

3.4 肠道菌群的δ-VB调节脑微血管系统中的TLR-4/MyD88/NF-κB通路

鉴于肠道菌群来源的代谢物δ-VB可能是与DE相关的关键分子，我们研究了δ-VB是否以及如何影响TLR-4/MyD88/NF-κB炎症通路。我们首先进行了δ-VB与TLR-4之间的分子对接模拟，结果表明，δ-VB能够与TLR-4的所有结合位点稳定地形成牢固的分子键（附录A表S8），其中第三个位点的结合作用尤为显著（附录A图S10）。此外，在高糖诱导的脑微血管内皮细胞中，在δ-VB存在的情况下，TLR-4的选择性抑制剂TAK-242 [41]抑制了TLR-4/MyD88/NF-κB通路的激活，以及随后TNF-α、IL-1β和IL-6的产生[*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；图7（g）~（i）]。这些结果表明δ-VB可以通过直接结合TLR-4来激活TLR-4/MyD88/NF-κB炎症通路。

此外，我们发现，如上所述，DE的炎症标志物Gal-3与粪便中的乙酸、丙酸、丁酸和异丁酸水平呈显著负相关，并与脑中的脂多糖和体内的δ-VB水平呈正相关[*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；图8（a）]。再者，乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠和改性柑橘果胶（一种特定的Gal-3抑制剂）抑制了高糖处理的bEnd.3细胞中Gal-3的产生[*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；图8（b）]，同时抑制TLR-4/MyD88/NF-κB通路的激活[*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；图8（c）~（e）]，下游TNF-α、IL-1β和IL-6的产生也随之减少[*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001；图8（f）~（h）]。相比之下，脂多糖和δ-VB进一步加剧了该炎症通路的激活[*P < 0.05；图8（b）]，随后导致TNF-α（*P < 0.05）、IL-1β（*P < 0.05）和IL-6 [图8（f）~（h）]的产生增加。

4 讨论

2型糖尿病继发性疾病的发病机制，通常与高血糖诱导的患病器官血管慢性炎症有关，DE就是大脑中的一个例子[42]。本研究发现肠道菌群的稳态似乎与血管状态相关，至少在大脑中这一关联成立。此外，肠道δ-VB可能是肠道和血管之间的化学连接，因为它可以进入血液，激活TLR-4/MyD88/NF-κB通路，然后引起脑血管炎症。口服BBR下调了肠道菌群中δ-VB的产生，并抑制了脑微血管中的TLR-4/MyD88/NF-κB炎症通路，从而改善DE。由于2型糖尿病是一种全身性疾病，对其继发性疾病（如DE）的最佳药物治疗应包括降低血糖水平和抑制血管炎症。我们认为BBR是治疗DE的理想药物，因为它已成功用于降低患者血糖水平[18]。

本研究最重要的发现是BBR对DE大脑中的微血管结构和体积有显著改善，据我们所知，此前尚未有治疗药物对血管产生如此显著有益效应的报道。本研究采用一种结合了三维超微结构成像和fMOST的新技术，实现了对2DEK小鼠脑血管的检测（图1）。值得注意的是，fMOST作为一种新型神经光学成像系统，在脑血管的重建和定量分析方面也具有巨大优势，分辨率高达1 μm体素[43]。因此，本研究所用血管分析的方法和技术均属于前沿且精确的实验手段。通过这些新方法，我们发现BBR不仅能改善血管内皮完整性，还整体提升了脑血管参数，包括直径、长度、密度和总体积[图2（c）~（k）]。这些发现表明，BBR是一种潜在的DE治疗药物，它通过一系列有利于脑血管健康的途径发挥作用。

有趣的是，这些作用与肠道菌群相关，提示存在一个“肠-血管轴”。代谢物δ-VB可能是肠道菌群和血管之间的化学连接，因为δ-VB激活了血管内皮细胞中的TLR-4/MyD88/NF-κB通路。δ-VB是一种源自肠道菌群的功能性代谢物，它进入循环并存在于大脑等器官中。δ-VB水平过高会导致心脏肥大[44]和脑功能衰退[16]，但δ-VB的致病机制尚不清楚。我们发现，脑中高水平的δ-VB似乎与2DEK小鼠的行为症状相关，并且上皮细胞中TLR-4/MyD88/NF-κB通路的激活可能至少是其所涉及机制的一部分。事实上，尚未发现能有效降低人体内δ-VB的临床药物。如果进一步的临床研究证实BBR可以通过下调肠道菌群中的δ-VB来改善DE的认知和记忆功能，这将为未来针对DE的合理药物设计提供重要依据。此外，由于TLR-4配体TAK-242有效抑制TLR-4/MyD88/NF-κB通路的激活，我们推测TLR-4与δ-VB之间的相互作用是DE的一个潜在药物靶点。

研究表明，口服BBR可显著调节宿主体内的肠道菌群，从而有助于BBR发挥治疗疾病的作用[23‒25,45]。例如，BBR增加肠道菌群中左旋多巴的产生以改善帕金森病；此外，它减少肠道中三甲胺N-氧化物（TMAO）和对甲酚的形成，从而改善动脉粥样硬化和慢性肾病[23‒25]。本研究首次报道BBR对肠道菌群中δ-VB产生的下调作用，并通过来自BBR处理小鼠的无BBR粪菌移植（BBR-free FMT）实验加以验证。总的来说，我们认为阐明BBR保护血管的机制具有重要意义。此外，微生物群的作用广泛，可能涉及本研究发现代谢物以外的其他物质。然而，我们的研究表明，BBR显著改变了2DEK小鼠肠道菌群的组成，其中产生短链脂肪酸的菌属增加，而促进脂多糖的菌属减少，我们推测这进一步有助于减轻血管内皮细胞的炎症[46‒48]。

本研究证明了Gal-3与δ-VB、短链脂肪酸和脂多糖之间存在显著相关性[图8（a）和（b）]。值得注意的是，δ-VB和脂多糖进一步参与了高糖诱导的bEnd.3细胞中TLR-4/MyD88/NF-κB炎症通路的激活，而短链脂肪酸对该通路表现出抑制作用[图8（e）]。我们发现乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠和改性柑橘果胶均显著抑制了Gal-3的产生，表明短链脂肪酸下调Gal-3的表达。这一结果与报道一致，即果胶中的膳食纤维通过肠道菌群产生短链脂肪酸来下调Gal-3水平[49]。此外，已有研究发现脂多糖在脑卒中患者中与Gal-3发挥协同作用，因为Gal-3是脂多糖完全激活TLR-4所必需的[50]。δ-VB与Gal-3之间的关系此前未见报道，本研究发现脂多糖和δ-VB都会加剧上皮细胞中TLR-4/MyD88/NF-κB炎症通路的激活。

宿主血管内皮、高血糖和肠道细菌之间的生物学关系可能很复杂。有效治疗DE需要综合疗法，既要降低血糖水平，又要保护脑血管免受炎症影响。本研究表明，肠道菌群是解决方案的一部分，并且BBR具有作为治疗DE药物的潜力。未来，需要进行精心设计的临床研究，以得出有关使用BBR治疗DE的结论。

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