二氢丹参酮I通过破坏SORT1介导的自噬-溶酶体途径诱导卵巢癌细胞自噬性死亡

孙承韬 ,  Shengqian Deng ,  韩冰 ,  Xiaoxiao Han ,  Yanan Yu ,  Man Li ,  Jiayi Lou ,  温成平 ,  吴炯 ,  开国银

Engineering ›› 2025, Vol. 51 ›› Issue (8) : 280 -296.

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Engineering ›› 2025, Vol. 51 ›› Issue (8) : 280 -296. DOI: 10.1016/j.eng.2025.06.020
研究论文

二氢丹参酮I通过破坏SORT1介导的自噬-溶酶体途径诱导卵巢癌细胞自噬性死亡

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Dihydrotanshinone I Induces Autophagic Cell Death in Ovarian Cancer by Disrupting the SORT1-Mediated Autophagy–Lysosome Pathway

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摘要

卵巢癌（OC）是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，在妇科恶性肿瘤中死亡率最高。卵巢癌细胞（OCCs）的一个显著特征是自噬水平低于正常细胞。这一现象表明，过度自噬激活或自噬-溶酶体融合障碍可能导致卵巢癌细胞死亡。本研究探讨了丹参来源的丹参酮化合物——二氢丹参酮I（DHT）的抗卵巢癌作用。蛋白质组学分析显示，DHT通过自噬-溶酶体途径抑制卵巢癌生长，且分选蛋白1（sortilin1, SORT1）被证实是关键作用靶点。体外实验中，DHT可促进微管相关蛋白1轻链3-II（LC3-II）介导的自噬体形成，同时抑制自噬体与溶酶体融合。卵巢癌原位模型实验结果进一步验证了上述发现，表明DHT可诱导肿瘤发生自噬性细胞死亡（ACD），并下调肿瘤中SORT1表达。进一步RNA干扰实验证实，SORT1缺失会诱导卵巢癌细胞内自噬体积累。值得注意的是，研究发现SORT1可与自噬相关基因（ATG）编码的蛋白ATG5和ATG16L1发生相互作用，且SORT1缺失会使这两种蛋白的表达水平升高。免疫共沉淀、泛素化和细胞热位移分析结果显示，DHT可直接靶向作用SORT1，并促进SORT1泛素依赖性降解。通过降解SORT1，ATG5和ATG16L1得以释放，进而促进自噬体形成并破坏自噬流。上述研究结果证实，DHT是一种新型自噬体诱导剂，可通过靶向作用SORT1诱导卵巢癌细胞发生ACD，有望成为治疗卵巢癌的候选方案。

Abstract

Ovarian cancer (OC), a common malignancy of the female reproductive system, has the highest mortality rate among gynecological cancers. A distinguishing feature of OC cells (OCCs) is their reduced autophagic flux compared with normal cells. This phenomenon indicates that excessive autophagy activation or impaired autophagosome–lysosome fusion may lead to OCC death. This study investigated the anti-OC effects of dihydrotanshinone I (DHT), a tanshinone compound from Salvia miltiorrhiza. Proteomic analysis suggested that DHT suppressed OC growth via the autophagy–lysosome pathway, with sortilin 1 (SORT1) identified as a critical target. In vitro, DHT promoted autophagosome formation mediated by microtubule-associated protein 1 light chain 3-II (LC3-II), while inhibiting autophagosome–lysosome fusion. The results of an orthotopic OC model corroborated these findings, showing that DHT induced autophagic cell death (ACD) and suppressed SORT1 expression in tumors. Further RNA interference experiments confirmed that SORT1 depletion caused autophagosomes to accumulate in OCCs. Notably, we found that SORT1 interacted with autophagy-related gene (ATG)-encoded proteins ATG5 and ATG16L1, and that depleting SORT1 increased the levels of these proteins. Co-immunoprecipitation, ubiquitination, and cellular thermal shift assay analyses revealed that DHT directly targeted and promoted ubiquitin-dependent degradation of SORT1. By degrading SORT1, ATG5 and ATG16L1 were released, which enhanced autophagosome formation and disrupted the autophagic flux. These findings identified DHT as a novel autophagosome inducer that induced ACD by targeting SORT1, making it a promising therapeutic candidate for OC.

关键词

二氢丹参酮I / 卵巢癌 / 自噬性细胞死亡 / 分选蛋白1 / 自噬 / 自噬-溶酶体途径

Key words

Dihydrotanshinone I / Ovarian cancer / Autophagic cell death / Sortilin 1 / Autophagy / Autophagy–lysosome pathway

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孙承韬,Shengqian Deng,韩冰,Xiaoxiao Han,Yanan Yu,Man Li,Jiayi Lou,温成平,吴炯,开国银. 二氢丹参酮I通过破坏SORT1介导的自噬-溶酶体途径诱导卵巢癌细胞自噬性死亡[J]. 工程（英文）, 2025, 51(8): 280-296 DOI:10.1016/j.eng.2025.06.020

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1 引言

卵巢癌（OC）是全球范围内危害女性健康的致命癌症之一。尽管卵巢癌仅占女性所有恶性肿瘤的3.7%，但其导致的癌症相关死亡率达4.7%，因此成为致死率最高的女性生殖系统癌症[1]。2020年，全球新增卵巢癌病例约31万例，死亡病例约20万例，且发病率仍在持续上升[2]。由于卵巢癌发病初期症状隐匿，近2/3的患者确诊时已处于晚期或转移阶段，导致五年生存率不足30% [3]。化疗（尤其是铂类联合紫杉醇化疗）仍是目前主要的治疗手段，旨在破坏卵巢癌细胞（OCCs）的DNA。然而，化疗存在严重副作用，包括骨髓抑制、肝肾功能损伤以及化疗耐药性等，导致患者预后较差、复发率较高，从而限制了其治疗效果[4]。近年来，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抑制剂通过合成致死效应，延长了部分卵巢癌患者（尤其是乳腺癌易感基因1/2突变携带者）的生存期和复发间隔[5]。但由于此类突变仅存在于30%的卵巢癌患者中，大多数患者缺乏针对性治疗方案[6]，因此亟待开发新的治疗策略和可靠的治疗靶点。

自噬是细胞在饥饿等应激条件下启动的一种生存机制，目前已在癌症研究领域获得广泛关注。在自噬过程中，细胞内蛋白质、细胞器等成分会被包裹进自噬体，随后自噬体与溶酶体融合，通过自噬-溶酶体途径（ALP）将这些细胞成分降解并回收。虽然自噬通常可支持细胞存活，但过度自噬会引发自噬性细胞死亡（ACD）——一种表现为自噬体积累的程序性细胞死亡[7]。既往研究表明，肿瘤细胞产生耐药性后，过度激活自噬可克服其凋亡抵抗，直接诱导癌细胞死亡[8]。自噬的启动需要自噬相关基因（ATG）编码的蛋白参与，促成自噬体形成[9]。激活后，在E1酶ATG7、E2酶ATG3和E3连接酶ATG12-ATG5-ATG16L的作用下，微管相关蛋白1轻链3（LC3）-I与自噬体膜上的磷脂酰乙醇胺结合，形成LC3-II——一种自噬体的特异性标志物[10]。然而，研究发现卵巢癌细胞中存在ATG家族蛋白（包括LC3）的显著缺失。自噬选择性治疗药物的应用研究显示，LC3-II积累与卵巢癌进展受限相关[11]。例如，异甘草素可通过上调LC3-II表达抑制卵巢癌细胞生长，但可被自噬抑制剂逆转[12]。自噬流异常（尤其是自噬体与溶酶体融合过程受阻）也会导致自噬体积累。溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）、突触融合蛋白17（STX17）和ras相关蛋白Rab-7（Rab7）等对自噬体与溶酶体的融合至关重要[13]，且溶酶体功能障碍是与卵巢癌进展相关的关键病理特征[14]。因此，阻断自噬体与溶酶体的融合可造成卵巢癌细胞线粒体损伤和凋亡[15]。

分选蛋白1（sortilin 1, SORT1）由SORT1基因编码，主要位于内质网和溶酶体膜上，参与蛋白质转运过程，特别是蛋白质向溶酶体的转运[16]。研究表明，SORT1可通过促进卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭来介导卵巢癌进展[17]。在超过75%的临床卵巢肿瘤样本中检测到SORT1高表达，针对SORT1阳性卵巢癌患者的靶向治疗已进入I期临床试验[18]。此外，研究发现SORT1可通过自噬介导其底物的溶酶体降解，进而影响溶酶体功能和ALP [19]。既往研究显示，SORT1可通过调控自噬促进胃癌进展[20]，但在卵巢癌进展和治疗中的具体作用尚不明确。

中草药能改善患者生活质量且副作用较小，其可作为抗肿瘤辅助药物，因此备受研究者关注[21]。紫杉醇、喜树碱、长春碱等生物活性化合物仍是抗肿瘤药物的重要来源。丹参作为传统中药，含有脂溶性丹参酮类和水溶性丹酚酸类成分，具有重要药用价值。研究表明，丹参酮类化合物具有显著抗肿瘤活性，尤其是丹参酮IIA已被证实可激发多形性胶质母细胞瘤和肌成纤维细胞自噬[22‒23]。我们团队在既往研究中发现，二氢丹参酮I（DHT）可抑制裸鼠原位乳腺癌肺转移[24]，但其对卵巢癌抗肿瘤效果的具体机制仍不明确。

我们的既往研究表明，DHT可提高细胞内活性氧（ROS）水平，从而诱导卵巢癌细胞线粒体损伤[25]。有趣的是，抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸无法完全逆转DHT诱导的细胞凋亡，表明DHT可能通过除激活氧化应激外的其他机制抑制卵巢癌生长。研究通过蛋白质组学分析鉴定了DHT抑制卵巢癌的潜在作用靶点，并结合卵巢癌原位模型、透射电子显微镜（TEM）、免疫共沉淀（Co-IP）、细胞热位移分析（CETSA）等技术，深入探讨了DHT抑制卵巢癌生长的分子机制。研究结果表明，靶向作用SORT1可能是治疗卵巢癌的有效策略。通过促进SORT1的泛素化和降解，DHT可破坏卵巢癌细胞自噬流，最终引发ACD。

2 材料与方法

2.1 试剂与抗体

本研究所用二氢丹参酮 I（DHT, ≥ 98.0%, PubChem CID: 11425923）购自上海源叶生物科技有限公司。雷帕霉素（RAPA, 99.06%, PubChem CID: 5284616）、托林1（Torin 1, 99.07%, PubChem CID: 49836027）、3-甲基腺嘌呤（3-MA, 99.97%, PubChem CID: 135398661）、羟氯喹（HCQ, 99.93%, PubChem CID: 3652）、渥曼青霉素（WORT, 99.97%, PubChem CID: 312145）、苄氧羰基-L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-亮氨醛（MG132, 99.69%, PubChem CID: 462382）、喹啉基-缬氨酰-O-甲基天冬氨酰-[2,6-二氟苯氧基]-甲基酮（Q-VD-OPh, 99.82%, PubChem CID: 24794416）和苄氧羰基-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-氟甲基酮（Z-VAD-FMK, 99.79%, PubChem CID: 5497174）购自Selleck Chemicals公司（美国）。杜氏改良Eagle培养基（DMEM）、McCoy’s 5A培养基、RPMI 1640、胎牛血清、青霉素/链霉素溶液和0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）购自Gibco公司（美国）。mCherry-GFP-LC3B腺病毒（一种可表达mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒，识别CD46）、线粒体绿色荧光探针（Mito-Tracker Green）和溶酶体红色荧光探针（Lyso-Tracker Red）购自上海碧云天生物技术有限公司。Lipofectamine 2000转染试剂购自赛默飞世尔科技有限公司（美国）。本研究所用抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司，具体包括：LC3（14600-1-AP）、LAMP2（66301-1-Ig）、SORT1（12369-1-AP）、ATG3（11262-2-AP）、ATG5（10181-2-AP）、ATG7（10088-2-AP）、ATG16L1（67943-1-Ig）、第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN, 60300-1-Ig）、Beclin-1（11306-1-AP）、B细胞淋巴瘤2（BCL-2, 60178-1-Ig）、STX17（17815-1-AP）、Rab7（55469-1-AP）、LAMP1（67300-1-Ig）、β-肌动蛋白（β-actin, 66009-1-Ig）、免疫球蛋白G对照抗体（IgG, 30000-0-AP）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗（SA00001-2）、HRP标记的山羊抗小鼠二抗（SA00001-1）、CoraLite 488标记的山羊抗兔二抗（RGAR002）和CoraLite 594标记的山羊抗小鼠二抗（RGAM004）。rProtein A/G琼脂糖树脂购自上海翊圣生物科技有限公司。

2.2 细胞培养

人卵巢癌细胞系ES2、OVCAR3、A2780、HO8910PM、SKOV3和HEY购自武汉普诺赛生命科技有限公司。正常人卵巢上皮细胞IOSE80购自上海盈湾生物科技有限公司。用含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM、RPMI 1640或McCoy’s 5A培养基，于37 ℃、5% CO2的潮湿环境下培养细胞。后续实验所用细胞均为第4代。除非另有说明，细胞需生长至80%融合度，随后在无血清培养基中饥饿孵育过夜，再进行后续处理。

2.3 实验动物

雌性BALB/c裸鼠（4~6周龄）购自上海斯莱克实验动物有限公司[SCXK（沪）2022-0004]。小鼠饲养于无特定病原体（SPF）环境中，采用12 h/12 h光照/黑暗的光照周期，饲喂标准饲料。所有动物实验均严格遵守美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物关爱和使用指南》（编号：8023，1978年修订版）。所有动物实验方案和操作均由浙江中医药大学动物实验研究中心批准[SYXK（浙）2021-0012，伦理审批号：IACUC-20230904-05]。在设定时间点，用CO2窒息法对小鼠进行安乐死。

2.4 细胞活力检测和集落形成实验

用3-（4,5-二甲基-2-噻唑基）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法检测细胞活力。简而言之，将细胞接种于96孔板，每孔1 × 104个细胞，加入不同浓度的目标化合物孵育24 h。随后在每孔加入10μL MTT试剂，于37 ℃孵育4 h。在各孔中加入100 μL二甲基亚砜（DMSO）溶解甲臜结晶，用酶标仪（Cytation 1；BioTek公司，美国）在490 nm波长下测定吸光度。集落形成实验中，将转染SORT1敲低短发夹RNA（shRNA, shSORT1）或scramble shRNA（阴性对照）的卵巢癌细胞接种于6孔板，次日加入或不加DHT处理。12天后，用4%多聚甲醛固定细胞15 min，经磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，加入0.1%结晶紫染色15 min。用蒸馏水冲洗去除多余染料，计数细胞集落数量。

2.5 蛋白质组学分析

经DHT干预或未干预的卵巢肿瘤样本快速冷冻后，于-80 ℃保存。样本送至杭州景杰生物科技股份有限公司进行蛋白质组学分析。用布鲁克timsTOF Pro/Pro2质谱仪，结合平行累积-连续碎裂技术，开展四维无标记定量蛋白质组学检测。用Maxquant软件（v.1.6.15.0）进行蛋白质鉴定，差异表达蛋白（DEPs）的筛选标准为p小于0.05且|差异倍数|大于1.5。

2.6 透射电子显微镜检测

收集经不同化合物处理的细胞，用2.5%戊二醛于4 ℃固定24 h。随后加入1%锇酸与1.5%铁氰化钾[K3[Fe(CN)6]]混合液，于4 ℃孵育2 h。之后固定细胞，经双蒸水（ddH2O）洗涤，用2%乙酸铀于37 ℃染色2 h。染色后，依次用梯度浓度乙醇（70%、80%、90%、95%）对细胞脱水，环氧树脂包埋72 h后进行超薄切片。用透射电子显微镜（H-7650；日立，日本）拍摄图像。

2.7 mCherry-GFP-LC3斑点检测

将卵巢癌细胞接种至玻璃细胞培养皿中，待细胞密度达50%时，转染mCherry-GFP-LC3B腺病毒[感染复数（MOI）= 20]。转染24 h后，更换为含不同化合物的培养基，继续孵育24 h。随后用激光共聚焦显微镜（LSM880；蔡司，德国）观察自噬流变化。在自噬体与溶酶体融合过程中，溶酶体的酸性环境会猝灭绿色荧光蛋白（GFP）的荧光，而红色荧光蛋白（mCherry）因耐酸特性其荧光保持稳定。因此，可通过监测mCherry-GFP-LC3B的表达追踪自噬流。自噬发生时，mCherry-GFP-LC3B 会聚集于自噬体膜上，显示出黄色斑点（LC3斑点，mCherry+GFP+）；当自噬体与溶酶体融合，GFP荧光部分猝灭，呈现红色斑点（mCherry+GFP-）。

2.8 免疫荧光

将卵巢癌细胞接种至玻璃细胞培养皿，经不同化合物处理后，用PBS洗涤细胞，于4%多聚甲醛固定15 min。随后用0.4% Triton X-100通透细胞，用5%山羊血清封闭30 min，加入一抗于4 ℃孵育过夜。次日，加入二抗于37 ℃孵育1 h。用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色细胞核10 min后，用激光共聚焦显微镜观察染色结果。线粒体探针（Mito-Tracker）和溶酶体探针（Lyso-Tracker）染色实验中，将处理后的细胞用PBS洗涤，加入含线粒体绿色荧光探针（100 nmol∙L-1）和溶酶体红色荧光探针（75 nmol∙L-1）的培养基孵育45 min。用激光共聚焦显微镜观察染色细胞，对线粒体与溶酶体进行荧光共定位分析。

2.9 实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）

用TRIzol试剂（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）从ES2细胞中提取总RNA。按试剂盒说明书，用HiScript IV All-in-One Ultra RT SuperMix逆转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）进行逆转录。用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）基于Applied Biosystems 7500实时PCR系统（赛默飞世尔科技有限公司）进行qPCR。用2-ΔΔCT法计算基因表达。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因。引物序列详见附录A表S1。

2.10 蛋白质印迹

用含1 mmol∙L-1苯甲基磺酰氟（PMSF；北京索莱宝科技有限公司）的放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液（碧云天生物技术有限公司），将卵巢癌细胞置于冰上裂解20 min。裂解液于4 ℃、14 000g条件下离心10 min，收集上清液。用二辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒（上海源叶生物科技有限公司）测定上清液中蛋白浓度。蛋白质印迹（western blotting）检测按先前描述的标准流程[26]进行。

2.11 免疫共沉淀

用添加1 mmol∙L-1 PMSF的Pierce IP裂解缓冲液（赛默飞世尔科技有限公司）裂解细胞。收集上清液，和SORT1抗体或免疫球蛋白G对照抗体于4 ℃孵育过夜。次日，将样品与rProtein A/G琼脂糖树脂混合，室温孵育2 h。孵育后，用IP裂解缓冲液洗涤树脂，于1500g条件下离心10 min后收集树脂。免疫沉淀的蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，加入相应一抗进行检测。

2.12 细胞热位移分析

用先前描述的CETSA法[27]检测ES2细胞中DHT与靶蛋白的相互作用。简言之，将ES2细胞与350 μmol∙L-1 DHT共孵育2 h（对照组不加DHT），经PBS洗涤、收集后进行CETSA检测。对照组与DHT处理组样品配对，分别于不同温度（43 ℃、46 ℃、49 ℃、52 ℃、55 ℃、58 ℃、61 ℃、64 ℃、67 ℃、70 ℃）加热5 min。加热后立即置于液氮中速冻30 s，重复此步骤3次。细胞裂解液于4 ℃、14 000g条件下离心10 min，收集上清液，用蛋白质印迹法分析不同温度下的蛋白稳定性。此外本研究还进行了剂量依赖性CETSA检测。用不同浓度DHT（0 μmol∙L-1、50 μmol∙L-1、150 μmol∙L-1、200 μmol∙L-1、250 μmol∙L-1、300 μmol∙L-1、350 μmol∙L-1、400 μmol∙L-1、450 μmol∙L-1、500 μmol∙L-1）处理细胞2 h，经PBS洗涤、收集后，将样品于64 ℃下加热5 min，后续步骤同前。通过蛋白质印迹法分析不同DHT浓度下特定蛋白的降解。

2.13 慢病毒转染

携带荧光素酶基因（含嘌呤霉素筛选标记）的慢病毒由吉凯基因生物科技有限公司提供。通过慢病毒感染生成SORT1沉默的卵巢癌细胞。HEK293T与慢病毒包装质粒（pCMV-Gag-Pol和 pCMV-VSVG）以及shSORT1质粒（新霉素筛选）共转染，或对照shRNA质粒共转染，以产生慢病毒颗粒（附录A表S2所示寡核苷酸序列）。转染48~72 h后，收集含慢病毒的细胞上清液，经0.45 μm滤膜过滤。在聚凝胺作用下，用慢病毒感染卵巢癌细胞。48 h后，用1 μg∙mL-1嘌呤霉素或1 mg∙mL-1 G418进行细胞筛选。

2.14 RNA干扰

靶向作用ATG16L1的小干扰RNA（siRNA）由海兴生物科技有限公司合成，siRNA序列详见附录A表S3。按照试剂盒说明书，用Lipofectamine 2000转染试剂将siRNA转染至卵巢癌细胞，转染60 h后进行后续实验。

2.15 皮下异种移植瘤模型

参照先前描述的方法[25]构建皮下异种移植瘤模型。步骤如下：收集ES2细胞（每只小鼠1 × 106 个，n = 7）、ES2-shSORT1细胞或ES2-shNC（阴性对照）细胞（每只小鼠1 × 106 个，n = 8），用无血清培养基重悬后，接种于裸鼠右侧腋下。为评估DHT对卵巢癌的干预效果用于蛋白质组学研究，将DHT溶解于含35% DMSO、50% PEG400和15%生理盐水的混合溶剂中。裸鼠接种肿瘤细胞前2天，随机分为3组：肿瘤对照组（TC组）、DHT处理组（20 mg∙kg-1，腹腔注射，每日1次，频率为给药2天停药1天）和卡铂（CBP）处理组（12.5 mg∙kg-1，腹腔注射，每周2次）。TC组腹腔注射生理盐水。于实验终点（接种后18天）将小鼠麻醉处死。为研究SORT1对卵巢癌生长的影响，裸鼠随机分为3组：ES2-shNC组、ES2-shSORT1组和ES2-shSORT1 + DHT处理组（20 mg∙kg-1，腹腔注射，每日1次，频率为给药2天停药1天）。ES2-shNC组和ES2-shSORT1组腹腔注射生理盐水。于实验终点（接种后21天）将小鼠麻醉处死。用游标卡尺测量肿瘤体积，计算公式为肿瘤体积 = 0.5 ×长×宽2。迅速剥离肿瘤组织，一部分于-80 ℃冷冻保存，另一部分用4%多聚甲醛固定，用于后续病理分析。

2.16 原位卵巢癌模型

参照先前研究方法[28]构建原位卵巢癌模型。雌性小鼠在诱导舱中吸入异氟烷（5%氧气混合）麻醉，手术过程中，通过鼻罩持续输送2.5%~3.0%异氟烷维持麻醉。术前为小鼠皮下注射卡洛芬（5 mg∙kg-1）镇痛。在卵巢脂肪垫上方做背部正中小切口，随后穿透腹膜壁做二次切口。将卵巢脂肪垫拉出体外，用止血夹固定，用显微镊定位输卵管，向左卵巢包膜下注射ES2（1.5 × 106, 15 μL）。用6/0缝线缝合腹膜壁，局部涂抹布比卡因止痛，皮肤切口用手术缝合钉闭合。肿瘤细胞接种6天后，将小鼠随机分为4组：肿瘤对照组（TC组）、DHT处理组（20 mg∙kg-1，腹腔注射，隔日1次）、RAPA处理组（6 mg∙kg-1，腹腔注射，隔日1次）、DHT + RAPA联用处理组[(20 + 6) mg∙kg-1，腹腔注射，隔日1次]。DHT和RAPA均溶解于含35% DMSO、50% PEG400和15%生理盐水的混合溶剂中，TC组腹腔注射生理盐水。于实验终点（接种后25天）将小鼠麻醉处死。分别在接种后第6天、第12天、第18天、第24天用生物发光成像监测肿瘤进展及转移情况。小鼠麻醉后腹腔注射D-荧光素（150 mg∙kg-1），5~30 min后用活体成像系统（IVIS-200；珀金埃尔默公司，美国）成像。用Living Image软件（Caliper LifeSciences公司，美国）分析成像数据。剥离肿瘤组织，称重、拍照后用于后续实验分析。

2.17 苏木精-伊红（H&E）染色与免疫组织化学（IHC）分析

肿瘤组织以10%多聚甲醛固定过夜后，按照标准H&E染色流程进行脱水、石蜡包埋、切片及染色。制备组织进行免疫组织化学分析，将组织切片置于0.1 mol∙L-1柠檬酸盐缓冲液中孵育30 min，再用3% H2O2处理15 min以灭活内源性过氧化物酶。室温下用10%山羊血清封闭1 h后，加入一抗于4 ℃孵育过夜。次日，在25 ℃下孵育二抗1 h，随后进行3,3'-二氨基联苯胺（DAB）显色及苏木精复染。所有切片用显微镜（蔡司 AXIO SCOPE A1）观察成像，用Image Pro Plus软件（Media Cybernetics公司，美国）分析蛋白表达水平。

2.18 统计学分析

所有数据均以至少3次独立实验的平均值±标准差（SD）表示。用IBM SPSS Statistics 22.0软件（SPSS公司，美国）和GraphPad Prism 10.0软件（GraphPad 软件公司，美国）进行统计学分析。用Student t检验分析两组间差异，用单因素方差分析（ANOVA）比较多组定量数据。p小于0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 DHT通过ALP抑制卵巢癌生长

本研究选用ES2和OVCAR3两株卵巢癌细胞系，分析DHT对卵巢癌的药理作用。集落形成实验结果显示，DHT处理后，两株细胞的克隆形成能力均显著下降[图1（a）~（c）]。在先前对丹参中抗肿瘤化合物的筛选研究中，我们发现DHT可显著抑制卵巢癌异种移植瘤的生长[附录A图S1（a）、（b）]，并诱导卵巢癌细胞发生线粒体去极化和凋亡[25]。为进一步明确DHT在卵巢癌中的作用机制，我们对DHT处理后的卵巢癌异种移植瘤进行蛋白质组学分析，共鉴定出373个差异表达蛋白（蛋白质组学信息详见附录A表S4）。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）结果显示，DHT处理组与对照组的蛋白表达存在明显聚类差异[图1（d）]。火山图分析显示，DHT处理组中有203个蛋白表达下调，170个蛋白表达上调[附录A图S1（c）]。对差异表达蛋白的生物信息学分析发现，关键通路发生改变。按p值排序的前10条京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路中，溶酶体通路（hsa04142）和吞噬体通路（hsa04145）显著富集[图1（e）]。基因集富集分析（GSEA）结果证实，DHT处理后溶酶体通路受显著抑制[图1（f）]。脂肪酸代谢激活是自噬的一个特征性表现[29]，而GSEA结果还显示脂肪酸代谢通路同样被激活[图1（g）]。与上述结果相一致的是，对上调蛋白的基因本体（GO）生物学过程分析发现，三羧酸（TCA）代谢过程、脂质分解代谢及脂质氧化相关通路显著激活[图1（h）]。这些结果共同表明，ALP的异常可能参与了DHT介导的卵巢癌生长抑制过程。热图显示，溶酶体通路中15个蛋白的表达显著下调[图1（i）]。为进一步筛选导致卵巢癌细胞自噬流异常的关键靶点，我们通过蛋白质-蛋白质相互作用网络分析了吞噬体和溶酶体通路中的差异表达蛋白[附录A图S1（d）、（e）]。其中，SORT1和LAMP2引起了我们的注意，尤其是SORT1。人类蛋白质图谱（HPA）分析显示，超过一半的卵巢癌患者肿瘤中SORT1高表达[图1（j）、附录A图S1（f）]。癌症基因组图谱（TCGA）也证实，卵巢癌患者中SORT1基因表达升高[图1（k）]，且卵巢癌患者中SORT1与LAMP2的表达呈高度相关性，而正常人群中无此相关性[图1（l）~（m）]。与公开数据一致，蛋白质组学数据的多变量相关性分析表明，溶酶体和吞噬体通路中的差异表达蛋白之间存在显著正相关[附录A图S1（g）]。此外，Kaplan-Meier生存分析显示，SORT1高表达的卵巢癌患者总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）显著缩短[图1（n）~（o）]。这些结果共同强调，SORT1表达水平与DHT对卵巢癌细胞自噬通路的影响之间存在密切关联。

3.2 DHT通过破坏自噬流诱导卵巢癌细胞中自噬体积累

为研究DHT对卵巢癌细胞自噬流的影响，本研究评估了自噬体的形成，并参考既往研究用TEM鉴定双膜结构自噬体[30]。结果显示，经1.8 μmol∙L-1、3.5 μmol∙L-1、7.0 μmol∙L-1 DHT处理的ES2细胞，自噬体数量显著增加[图2（a）]。A2780细胞中也观察到类似趋势[附录A图S2（a）]。正如预期，自噬体积累的同时，自噬体标志物LC3显著升高。实验结果显示，DHT处理促进了卵巢癌细胞中LC3-I向脂化形式LC3-II的转化[图2（b）]。自噬体特异性单丹磺酰尸胺（MDC）染色进一步证实了这一积累现象，与TEM检测结果一致[附录A图S2（b）]。自噬全过程包括自噬体形成、自溶酶体生长和底物降解。为监测完整自噬流过程，我们将mCherry-GFP-LC3B腺病毒转染至卵巢癌细胞。经DHT处理的ES2细胞显示出黄色斑点（表明mCherry+GFP+标记的自噬体），而经自噬激活剂RAPA处理的细胞则显示出红色斑点（表明mCherry+GFP-标记的自溶酶体）。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂3-MA显著减弱了DHT处理的ES2细胞中mCherry+GFP+信号[图2（c）、（d）]，表明DHT损害了卵巢癌细胞的自噬流。A2780细胞中也得到类似结果[附录A图S2（c）、（d）]。通过Mito-Tracker和Lyso-Tracker染色的进一步分析显示，经DHT处理的ES2细胞中线粒体发生断裂，与对照组细胞中正常的管状线粒体网络形成对比。3-MA处理显著逆转了DHT诱导的ES2细胞线粒体自噬[图2（e）]。相比之下，RAPA处理组的Mito-Tracker和Lyso-Tracker共定位信号增强。然而，与RAPA处理组和对照组细胞相比，DHT显著降低了Lyso-Tracker信号，并破坏了受损线粒体与溶酶体的共定位[图2（e）、（f）]。A2780细胞中也验证了类似结果[附录A图S2（e）、（f）]。此外，蛋白质印迹检测显示，DHT以剂量依赖方式下调LAMP2的表达[图2（g）]。综上，这些结果表明DHT可促进卵巢癌细胞自噬启动，但通过抑制自溶酶体的形成阻断自噬流。受损线粒体和溶酶体共定位被破坏，进一步支持DHT既能改变线粒体结构，又能抑制受损线粒体溶酶体降解的假设。

3.3 DHT通过诱导自噬性细胞死亡抑制原位卵巢肿瘤生长

鉴于DHT可诱导卵巢癌细胞自噬体积累，我们应用自噬抑制剂和激活剂进一步研究DHT的作用机制。结果显示，低浓度3-MA和WORT对卵巢癌细胞生长无显著抑制作用，而RAPA和Torin 1可有效抑制细胞生长[附录A图S3（a）~（c）]。值得注意的是，DHT和自噬晚期抑制剂HCQ联合处理，诱导的细胞死亡率高于仅用DHT处理[附录A图S3（d）]。而3-MA和WORT可显著逆转DHT对卵巢癌细胞增殖的抑制作用[附录A图S3（e）、（f）]。此外，凋亡抑制剂Q-VD-OPh和Z-VAD-FMK无法阻断DHT诱导的ES2细胞死亡（附录A图S4），表明DHT以不依赖凋亡的方式抑制卵巢癌细胞生长。这些结果表明，DHT可能通过诱导卵巢癌细胞自噬体积累引发ACD。因此，我们研究了DHT能否在原位卵巢肿瘤中触发ACD，利用以下处理组评估DHT对ES2原位卵巢癌的效果：肿瘤对照组（TC组）、DHT处理组（20 mg∙kg-1，腹腔注射，隔日1次）、RAPA处理组（6 mg∙kg-1，腹腔注射，隔日1次）和DHT + RAPA联合处理组（剂量同单药组）[图3（a）]。结果显示，DHT和RAPA单独处理均能显著减慢肿瘤生长速度[图3（b）]、减少肿瘤结节形成[图3（c）]并减轻肿瘤重量[图3（d）]。但联合处理组的抗肿瘤效果并未优于任一单药组，提示DHT可能仅通过激活自噬途径抑制卵巢癌生长。DHT耐受性良好，实验过程中小鼠出现的轻微体重下降与肿瘤负荷减轻相关[图3（e）]。基于ES2-荧光素酶细胞的活体成像结果进一步验证了上述结论[图3（f）、（g）]。H&E染色和IHC分析显示[图3（h）]，DHT和RAPA处理均导致细胞出现异常形态，包括核固缩、空泡形成和细胞分散。此外，DHT可显著下调卵巢癌组织中SORT1的表达，使其水平接近正常卵巢组织。为验证DHT通过诱导ACD抑制卵巢癌生长，我们检测了异种移植瘤中ALP相关蛋白的表达。结果显示，DHT和RAPA均能降低卵巢癌细胞中增殖标志物Ki67的表达。正如预期，与TC组相比，DHT处理组的肿瘤组织切片中自噬相关蛋白ATG5、ATG16L1、LC3和PTEN的染色强度显著增强（附录A图S5）。同时，DHT可显著下调肿瘤组织中LAMP2、STX17和Rab7的表达，而RAPA处理组无此效果（附录A图S6）。该差异可能是DHT的抗肿瘤效果优于RAPA的原因[图3（d）]，这进一步支持了前文关于DHT可破坏卵巢癌细胞自噬流的研究发现。综上，这些结果证实，过度激活自噬可抑制卵巢癌生长，DHT通过促进ACD发挥抗癌功效。

3.4 SORT1敲低诱导卵巢癌细胞发生自噬性细胞死亡

基于上述研究发现，即SORT1可能参与DHT诱导的自噬流破坏，我们进一步探究仅SORT1缺失是否会导致卵巢癌细胞自噬体积累。首先，实验评估了6种卵巢癌细胞系中SORT1的表达。与正常人卵巢上皮细胞（IOSE80）相比，SORT1在多数卵巢癌细胞中高表达，这在ES2和A2780细胞中尤为显著[图4（a）、（b）]。为验证SORT1在卵巢癌细胞自噬中的作用，我们通过慢病毒包装shSORT1质粒转染卵巢癌细胞，构建SORT1敲低细胞系。结果显示，shSORT1-1和shSORT1-2两种干扰序列均能显著降低ES2和A2780细胞中SORT1的表达（附录A图S7）。MDC染色结果显示，与对照组相比，ES2/A2780-shSORT1细胞中被标记的自噬体数量显著增加[图4（c）]。集落形成实验表明，SORT1缺失可显著抑制ES2和A2780细胞生长[图4（d）、附录A图S8]。值得注意的是，SORT1敲低并未改变ATG的表达，包括ATG3、ATG5、ATG7、ATG16L1、BECN1和LC3B [图4（e）]。但TEM观察发现，ES2-shSORT1细胞中的自噬体数量大幅增加[图4（f）]，这强烈表示在卵巢癌细胞中高表达的SORT1可抑制自噬体形成。进一步实验显示，3-MA处理可减少ES2-shSORT1细胞中的自噬体数量，而HCQ对SORT1缺失引起的自噬体积累无显著影响[图4（f）]。结合此前发现的DHT诱导的自噬流破坏及SORT1的抑制作用，我们进一步研究自噬体积累的潜在根本原因。结果显示，经DHT处理后，卵巢癌细胞内源性LC3水平显著升高。但与RAPA处理诱导的LC3和溶酶体标志物LAMP1共定位（橙色斑点）相比，DHT处理组未观察到LC3和LAMP1的显著共定位[图4（g）]。这表明SORT1缺失导致的自噬体积累，是由自噬早期激活与自噬体-溶酶体融合功能障碍共同介导的。综上，这些研究结果证实，DHT诱导卵巢癌细胞发生ACD的过程由SORT1介导。

3.5 SORT1缺失通过ATG家族蛋白刺激卵巢癌细胞发生自噬性细胞死亡

鉴于SORT1敲低可诱导卵巢癌细胞自噬体积累，但未显著影响自噬体相关基因表达，我们推测SORT1通过蛋白质-蛋白质相互作用调控ACD。已知自噬调控因子（包括ATG3、ATG7和ATG5-ATG12-ATG16L1复合物）对LC3脂化和自噬体成熟至关重要，该过程中吞噬泡闭合形成自噬体[31]。蛋白质印迹检测显示，DHT处理可上调ES2和A2780细胞中ATG5和ATG16L1的表达，并下调SORT1的表达[图5（a）~（d）]。为排除其他因素对ATG5和ATG16L1水平的影响，我们检测了PI3K-蛋白激酶B（AKT）-雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路。DHT处理后，PI3K、AKT、p-AKT、mTOR及p-mTOR的水平均无显著变化[附录A图S9（a）、（b）]。此外，qPCR分析证实，DHT未改变SORT1、ATG5和ATG16L1的mRNA水平[附录A图S9（c）、（d）]，这表示SORT1表达降低并非转录变化所致。SORT1的降解主要由泛素-蛋白酶体途径介导[32]，因此实验评估了SORT1泛素化以研究DHT下调SORT1的机制。Co-IP分析显示，DHT处理后SORT1的泛素化水平升高（观察到泛素化条带上移），且SORT1蛋白水平降低[图5（e）]。激动人心的是，Co-IP分析进一步发现SORT1可与ATG5和ATG16L1发生相互作用。DHT通过抑制SORT1表达，降低了与SORT1结合的ATG5和ATG16L1水平，而游离态ATG5和ATG16L1水平显著升高[图5（f）]。这些结果表明，DHT通过抑制SORT1的表达间接减少了ATG与SORT1的结合，且SORT1通过直接相互作用负调控内源性ATG5和ATG16L1。出乎意料的是，蛋白酶体抑制剂MG132与DHT联合处理既未阻断DHT对SORT1的作用，也未恢复LC3-II水平[图5（g）、附录A图S10]，表示可能存在其他通路调控SORT1降解。尽管如此，上述证据无法充分证实DHT介导的SORT1缺失可促进自噬体形成。

为验证SORT1在自噬中的作用，我们检测了SORT1敲低或DHT处理后，ES2中ALP蛋白的表达[图5（h），附录A图S11（a）、（b）]。结果显示，ES2-shSORT1细胞中ATG5、ATG16L1和LC3-II的表达升高。值得注意的是，SORT1敲低对PTEN的水平无影响，但DHT处理可提高PTEN的表达。此外，SORT1敲低可提高Beclin1的表达并降低BCL-2的表达，从而影响Beclin1/BCL-2复合物（调控自噬水平）。有趣的是，自噬体-溶酶体融合过程中的关键蛋白LAMP2和STX17在ES2-shSORT1细胞中显著下调，而Rab7水平不变，这表示SORT1参与了DHT诱导的自噬流阻断。进一步实验显示，敲低ATG16L1可部分逆转ES2-shSORT1细胞中升高的LC3-II/I比例[图5（i）、附录A图S11（c）]。此外，3-MA和WORT处理可促进ES2-shSORT1细胞增殖，而HCQ处理则抑制其增殖[图5（j）]，这表明卵巢癌细胞的死亡由自噬体过度积累导致，而非SORT1敲低的其他效应。DHT和RAPA对ES2-shSORT1细胞几乎无抑制作用，进一步支持了上述结论[图5（k）]。确实，敲低ATG16L1以抑制shSORT1诱导的自噬，可减轻shSORT1对卵巢癌细胞的细胞毒性[图5（l），附录A图S12]。ES2-shNC和ES2-shSORT1细胞的伤口愈合能力也呈类似趋势（附录A图S13）。ATG16L1敲低可部分逆转shSORT1诱导的卵巢癌细胞迁移抑制。值得注意的是，DHT无法进一步抑制ES2-shSORT1细胞迁移。上述发现有力证明，SORT1通过与ATG家族蛋白相互作用，促进卵巢癌细胞自噬体积累并诱导ACD。

3.6 DHT通过羰基与SORT1相互作用

鉴于DHT不影响SORT1 mRNA的表达，我们推测DHT与SORT1存在直接相互作用。为验证这一假设，我们进行了CETSA，此分析法基于配体结合可增强靶蛋白热稳定性的原理[33]。结果显示，经高浓度DHT处理的卵巢癌细胞在63 ℃加热后，SORT1水平升高，当DHT浓度为350 μmol∙L-1时，SORT1降解显著减少[图6（a）、（b）]。

为研究DHT与SORT1的结合模式，我们通过分子对接预测两者的相互作用位点（具体分析方法详见文献[24]）。Autodock（Scripps研究所，美国）分析显示，DHT在一个含TYR189和MET187氨基酸残基的口袋区域与SORT1结合，结合能为-6.15 kcal∙mol-1（1 cal ≈ 4.2 J）。LigPlot+（欧洲生物信息研究所，英国）进一步证实，DHT的羰基与SORT1的TYR189存在相互作用[图6（c）]。温度依赖性CETSA实验进一步证实了这一相互作用[图6（d）]。经DMSO处理的ES2和A2780细胞，其SORT1条带在61~70 °C之间几乎消失。而经350 μmol∙L-1 DHT处理的细胞，其SORT1条带仍保持稳定[图6（e）、（f）]。热解链曲线显示，DHT处理的ES2和A2780细胞中SORT1的稳定性明显改变，而β-actin的稳定性无变化[图6（g）、（h）]。上述结果表明，DHT可与SORT1直接结合，但DHT结合SORT1并抑制其表达的具体机制仍待研究。

3.7 SORT1缺失通过破坏自噬流在异种移植瘤模型中抑制卵巢癌生长

研究结果表明，DHT通过抑制SORT1表达影响ALP中的关键蛋白（包括ATG5和ATG16L1），最终破坏自噬流并诱导ACD。为评估SORT1抑制在卵巢癌中的治疗潜力，我们向小鼠皮下注射ES2-shSORT1细胞建立异种移植瘤模型。结果显示，SORT1敲低显著减小了卵巢癌异种移植瘤的体积和重量，且DHT对ES2-shSORT1异种移植瘤的生长无额外抑制作用[图7（a）~（c）]。ES2-shNC组肿瘤组织的H&E染色显示，细胞排列密集、形态规则、体积较大且核质比高。相反，ES2-shSORT1组肿瘤组织的细胞排列更松散且形态异常[图7（d）]。IHC分析进一步显示，与对照组异种移植瘤相比，SORT1缺失的ES2细胞形成的肿瘤中，Ki67阳性细胞数量显著减少。与体外实验结果一致，ES2-shSORT1组异种移植瘤中ATG5和ATG16L1水平更高[图7（d）、（e）]，LAMP2和STX17水平更低[图7（f）、（g）]。DHT处理未改变ES2-shSORT1组异种移植瘤中这些蛋白的表达水平，表示DHT对卵巢癌细胞自噬的调控依赖SORT1。综上，这些结果证实，SORT1缺失在体内可破坏自噬流，从而诱导ACD并抑制卵巢癌生长。

4 讨论

卵巢癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤之一，具有死亡率高、早期症状隐匿的特点，被誉为“沉默的杀手”。多数卵巢癌患者确诊时已处于晚期，常伴随转移，导致手术治疗效果受限[34]。近年来，基于自噬的高效抗癌药物及治疗方案备受关注，部分诱导自噬体形成的纳米药物已展现出令人振奋的抗肿瘤效果[35]。因此，通过破坏自噬流诱导自噬性细胞死亡是一种极具潜力的卵巢癌治疗策略。本研究旨在探究ALP是否参与DHT对卵巢癌的抑制作用。主要研究结果发现DHT通过抑制SORT1表达破坏卵巢癌细胞的自噬流，导致自噬体积累并引发后续ACD。值得关注的是，本研究首次揭示了SORT1在卵巢癌细胞自噬中的全新作用——SORT1可与自噬相关蛋白ATG5和ATG16L1发生相互作用。

蛋白质组学与生物信息学分析显示，DHT可改变吞噬体和溶酶体通路中显著富集的蛋白表达。GSEA和GO分析进一步证实，DHT在卵巢癌中抑制溶酶体通路，同时过度激活能量代谢通路，如脂肪酸代谢和TCA循环。其原因在于以下几个因素。首先，癌细胞中脂质代谢增强和TCA循环激活通常与自噬水平升高有关[36‒37]。其次，多数癌细胞存在Warburg效应，过度依赖TCA循环可能耗尽糖酵解途径中的中间代谢产物（如核苷酸），从而限制DNA和蛋白质合成[38]。最后，脂肪酸代谢增强和脂质氧化会导致ROS水平升高。先前研究表明，DHT可诱导卵巢癌发生氧化应激[25]，这一过程可通过调控自噬实现。因此，我们推测DHT可破坏卵巢癌细胞的自噬流，具体而言，DHT可能在激活卵巢癌细胞自噬的同时，破坏自噬体与溶酶体的融合。随后，我们聚焦ALP中的关键差异表达蛋白。溶酶体通路中表达变化最显著的4种蛋白分别为β-葡萄糖醛酸苷酶、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、组织蛋白酶C和溶酶体α-甘露糖苷酶。这些蛋白均为溶酶体酶，主要降解细胞内半胱氨酸、糖胺聚糖和部分寡糖，并不直接影响自噬。SORT1和LAMP2的表达变化分别位列第5和第6。SORT1主要位于内质网、溶酶体和细胞膜，参与细胞内蛋白质转运[16]。2018年有研究发现，SORT1通过自噬介导底物蛋白的溶酶体降解[19]，后续研究也报道了SORT1对自噬的调控作用[39]，但SORT1在癌细胞中调控自噬的具体机制仍不明确。近期一项研究表明，受环状RNA（hsa_circ_0110389）调控的SORT1可能通过异常自噬促进胃癌进展[20]。本研究表明，尽管SORT1并非蛋白质-蛋白质相互作用网络中的核心蛋白，但HPA和TCGA等公共数据库表明，卵巢癌患者中SORT1在基因和蛋白水平均呈高表达，表示其在卵巢癌进展中具有重要意义。值得注意的是，卵巢癌患者中SORT1与LAMP2的表达呈强正相关，而健康人群中无此相关性。LAMP2是溶酶体膜上高度糖基化的蛋白，可稳定溶酶体膜并促进自噬体-溶酶体融合。LAMP2缺失会降低该融合效率，导致自噬底物清除障碍。上述研究发现说明，SORT1在自噬流调控中不可或缺，且可能参与DHT对卵巢癌的抑制作用。

为进一步研究SORT1在自噬中的作用，我们验证了DHT是否通过ALP影响卵巢癌。尽管早期研究认为自噬在癌症中具有双重作用，但目前已被广泛认可的是，自噬可抑制肿瘤发生[40]。过度激活自噬会导致ACD，又称II型细胞死亡。与凋亡不同，ACD通过自噬体对细胞组分进行广泛降解。本研究数据首次证实，DHT可促进卵巢癌细胞自噬体生成。但自噬体的积累是自噬起始通路激活与自噬体-溶酶体融合受抑共同作用的结果。DHT处理可上调LC3-II水平，导致大量LC3在自噬体而非自溶酶体中积累，这与RAPA处理的结果不同。这表明DHT在促进自噬体形成的同时，可阻断卵巢癌细胞中的自噬流。此外，线粒体与溶酶体的共定位分析支持了以下假设，即DHT可破坏线粒体结构，并阻止溶酶体与受损线粒体结合，导致受损线粒体在细胞内积累，这可能是DHT诱导卵巢癌细胞发生ACD的原因。值得注意的是，已有研究报道类似机制可增强癌细胞对化疗药物的敏感性[41]。有趣的是，抑制自噬启动的3-MA和WORT可逆转DHT对卵巢癌细胞的抑制作用。相反，自噬晚期抑制剂HCQ则增强了DHT的抑制效果。这进一步证实DHT可诱导卵巢癌细胞发生ACD。为验证这一结论，我们采用原位卵巢癌模型进行验证。既往研究表明，卵巢癌细胞的自噬水平通常较低，其LC3表达量显著低于卵巢良性或交界性肿瘤。且与国际妇产科联盟（FIGO）I、II期相比，III、IV期卵巢癌的LC3表达进一步降低[42]。已有研究证实，丹参酮IIA可通过调控雷帕霉素靶蛋白复合物1促进自噬，并抑制多形性胶质母细胞瘤生长[22]。此外，线粒体融合蛋白2高表达可通过下调磷酸化雷帕霉素靶蛋白和磷酸化细胞外信号调节激酶通路，激活AMP活化蛋白激酶，促进自噬，并抑制卵巢癌进展[43]。这表明激活自噬可能是卵巢癌的潜在治疗策略。与此相符，本研究中RAPA可显著上调ATG5、ATG16L1和LC3的表达，并抑制卵巢癌生长。DHT在卵巢癌中模拟了上述效应，且抗肿瘤效果优于RAPA单用，这可能与DHT通过下调LAMP2、STX17和Rab7表达抑制自溶酶体形成有关。此外，LC3与LAMP1的共定位分析显示，尽管DHT可上调LC3水平，但并未增强LC3与溶酶体的共定位，这一现象可能是DHT抑制卵巢癌生长的主要机制。近期研究也与本研究发现一致，在激活自噬起始的同时阻断自噬晚期过程，会导致自噬体过度积累，使自噬转化为具有破坏性的ACD诱导过程[44]。

在原位异种移植瘤模型中，DHT可抑制SORT1表达，这与蛋白质组学结果相互验证。因此，我们深入研究SORT1在DHT诱导ACD中的作用。既往研究证实，多种癌症（包括乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌）中SORT1呈高表达[45]。本研究证实，较之正常卵巢上皮细胞，卵巢癌细胞（OVCAR3、ES2、SKOV3、A2780）中SORT1水平升高。实验发现，自噬体形成抑制剂3-MA可显著减少SORT1敲低细胞中的自噬体积累，而自噬流抑制剂HCQ对该积累无明显影响。本发现初步证实，DHT诱导的卵巢癌细胞自噬体过度积累依赖于SORT1。已有研究表明，SORT1可通过促进上皮间质转化、紊乱脂质代谢、赋予化疗耐药性，增强肿瘤侵袭性[46‒48]。本研究发现敲低SORT1可抑制卵巢癌细胞生长。此外，3-MA和WORT可促进ES2-shSORT1细胞增殖，而HCQ则抑制其增殖。同时，DHT和RAPA对ES2-shSORT1细胞几乎无抑制作用。上述结果共同证实SORT1缺失可诱导卵巢癌细胞发生ACD。然而，SORT1调控自噬的分子机制仍需进一步研究。多种致癌突变可通过激活mTORC1或抑制Beclin1/III 类PI3K复合物抑制自噬[49]。尽管PI3K-AKT-mTOR通路是公认的自噬起始调控通路，但DHT对该通路无明显影响，且SORT1缺失未改变自噬体形成相关基因的表达。因此，我们推测SORT1可能通过与ATG家族蛋白相互作用，促进自噬体生成。

ATG12-ATG5-ATG16L1复合物可促进LC3/γ-氨基丁酸受体相关蛋白的脂化修饰，该过程在自噬底物招募及自噬体成熟中发挥关键作用[50]。本研究发现，DHT在抑制SORT1表达的同时，显著上调ATG5和ATG16L1的表达。值得注意的是，随着癌症进展，ATG家族蛋白有时会发生突变或失活，以逃避具有肿瘤抑制作用的自噬[51]。在阿霉素诱导的休眠乳腺癌模型中，ATG5敲低介导的自噬缺陷会导致肿瘤更早发生转移复发[52]。令人振奋的是，本研究首次揭示SORT1通过与ATG5和ATG16L1结合（而非与LC3结合）促进自噬体生成。敲低ATG16L1的实验进一步支持了这一发现，即siATG16L1可部分逆转SORT1缺失引起的卵巢癌细胞增殖和迁移抑制。已有研究证实，激活ATG16L1可诱导自噬并抑制肾透明细胞癌进展[53]，这也解释了为何SORT1缺失会导致卵巢癌细胞发生ACD。既往研究表明，SORT1的核心功能之一是介导靶蛋白向溶酶体的转运。例如，SORT1可将apoB100从分泌通路重定向至自噬体，进而通过溶酶体降解[19]。这表示DHT可能通过抑制SORT1依赖的ATG5和ATG16L1溶酶体降解，导致自噬体蓄积。此外，SORT1缺失会下调自噬体-溶酶体融合相关蛋白（包括LAMP2、STX17和Rab7）的表达。我们之前的生物信息学分析也发现，卵巢癌患者中SORT1与LAMP2的表达呈显著正相关。此外，SORT1与LAMP2可共同介导细胞外囊泡分泌和细胞黏附，从而导致多发性骨髓瘤对来那度胺产生耐药性[54]。综上，通过抑制SORT1破坏卵巢癌细胞的自噬流并诱导ACD，可能是DHT抑制卵巢癌生长的潜在机制。然而，SORT1是否在抑制自噬体-溶酶体融合中发挥关键作用，仍待进一步研究明确。

SORT1在细胞内可通过经典泛素-蛋白酶体途径和溶酶体途径降解。本研究中，DHT干预未影响SORT1 mRNA水平，推测DHT可能通过翻译后修饰调控SORT1表达。进一步研究证实，DHT可促进SORT1泛素化，这也解释了其导致SORT1蛋白水平降低的原因。有趣的是，已有研究表明，颗粒体蛋白可增强SORT1泛素化，使其通过内吞作用内化并分选至早期内体，最终经溶酶体降解[55]。这表明SORT1泛素化可能绕过经典蛋白酶体途径，也解释了为何蛋白酶体抑制剂MG132无法逆转DHT对SORT1的下调作用。CETSA和分子对接结果为DHT作用于SORT1的机制提供了启发。CETSA证实DHT与SORT1存在直接相互作用，分子对接则显示DHT通过其C10位的羰基与SORT1的TYR189结合。既往研究表明，抑制SORT1的SER825磷酸化可加速其蛋白酶体依赖的降解[56]。类似地，DHT可能通过占据特定氨基酸位点促进SORT1泛素化，但其具体机制仍需进一步研究证实。尽管已有研究部分探讨了SORT1对ALP的影响[57]，但其如何通过调控ALP影响肿瘤生长仍不明确。最后，本研究在体内实验中证实，SORT1缺失可上调ATG5和ATG16L1的表达，进而抑制卵巢癌异种移植瘤生长，这与先前的体外实验结果一致。此外，在ES2-shSORT1细胞中，DHT对ATG家族蛋白表达及异种移植瘤生长的调控作用均消失，进一步证实DHT诱导的卵巢癌细胞ACD依赖于SORT1。

5 结论

本研究揭示，DHT通过破坏ALP调控卵巢癌细胞的ACD，由此明确SORT1可作为卵巢癌治疗的潜在靶点。具体而言，DHT通过促进SORT1的泛素化依赖性降解，减少ATG家族蛋白与SORT1的结合，上调ATG5和ATG16L1的表达，同时阻碍自噬体-溶酶体融合，最终导致卵巢癌细胞中自噬体积累（图8）。本研究为通过调控自噬开发抗卵巢癌药物提供了全新思路。

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原文顺序 | 出版日期 | 本文引用
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