细胞色素P450酶催化反应特征研究进展——从含N、S小分子药物底物的代谢规律分析

颜超华; 魏桂林; 金倬鞍; 李小东; 杨柳逸; 邹立伟; 杨凌

doi:10.1016/j.eng.2025.07.029

工程（英文） ›› 2025, Vol. 54 ›› Issue (11) : 249 -272. DOI: 10.1016/j.eng.2025.07.029

Research

细胞色素P450酶催化反应特征研究进展——从含N、S小分子药物底物的代谢规律分析

颜超华 ^b ,
魏桂林 ^b^,^c ,
金倬鞍 ^b ,
李小东 ^b ,
杨柳逸 ^b ,
邹立伟 ^b ,
杨凌 ^a^,^b

作者信息 +

Elucidating the Substrate Specificity of Cytochrome P450 Enzymes: Insights into N- And S-Containing Small-Molecule Metabolism

Chaohua Yan ^b^,^# ,
Guilin Wei ^b^,^c^,^# ,
Zhuoan Jin ^b ,
Xiaodong Li ^b ,
Liuyi Yang ^b ,
Liwei Zou ^b^,^* ,
Ling Yang ^a^,^b^,^* ,

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摘要

细胞色素P450酶（P450s或CYPs）是小分子药物吸收、分布、代谢和排泄（ADME）属性的主要贡献因素，能够介导催化多种反应类型，包括含N、S小分子化合物的代谢。本文对294种P450s介导的小分子底物进行统计分析（其中含N、S原子的底物占比超47%），旨在阐明5种反应类型中底物与不同CYP亚型间的广谱交叉性和专一性作用规律。本文发现，分子量大于500 Da或小于200 Da的底物主要受CYP亚型活性空腔的主导性影响；而分子量在200~400 Da范围内的中小分子化合物更多地受其所含杂原子类型的影响，酶催化空腔大小并不是底物特异性的显著决定因素。本文从P450s介导的含N、S化合物的代谢机制出发，分析了N-脱烷基化反应、N-氧化反应和S-氧化反应的底物结构特征，以及其与P450s的代谢作用规律。本研究为完善现有的P450s底物特异性与底物分子结构性质之间的关系提供了新的视角，也为优化基于P450s催化反应理论体系的药物设计和代谢稳定性预测提供了重要的依据。

Abstract

Cytochrome P450 enzymes (P450s or CYPs) are the primary metabolic contributors to the absorption, distribution, metabolism, and excretion (ADME) properties of small-molecule drugs. These enzymes can catalyze various types of reactions, including metabolic reactions that occur at nitrogen (N) and sulfur (S) sites of small molecules. In this review, we conducted a comprehensive statistical analysis of 294 P450s-mediated small-molecule substrates, among which more than 47% substrates contained N and S. The purpose of the analysis is to elucidate the broad-spectrum cross-reactivity and specificity between these substrates and various CYP isoforms across five reaction types. Our findings reveal that substrates with molecular weights greater than 500 Da or less than 200 Da are predominantly governed by the dominant effect of the CYP isoform’s active sites. In contrast, small- to medium-sized molecules with molecular weights ranging from 200 to 400 Da exhibit a stronger dependence on the types of heteroatoms they contain, with the size of the enzyme’s catalytic site (cavity) playing a negligible role in determining substrate specificity. This review starts from the metabolic mechanisms of P450s-mediated N- and S-containing compounds, and systematically analyzes the structural characteristics of substrates involved in N-dealkylation, N-oxidation, and S-oxidation, as well as their metabolic interactions with P450s. These analyses provide a new perspective for improving the existing understanding of the relationship between the P450s substrate specificity and substrate structural characteristics, and offer a valuable perspective for enhancing drug design and predicting metabolic stability based on the P450s-catalyzed reaction framework.

Graphical abstract

关键词

药物代谢 / 细胞色素P450酶 / 活性位点/催化空腔 / 底物特异性 / 含N、S底物

Key words

Drug metabolism / Cytochrome P450 enzymes / Active sites/catalytic sites / Substrate specificity / N- and S-containing substrates

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颜超华,魏桂林,金倬鞍,李小东,杨柳逸,邹立伟,杨凌. 细胞色素P450酶催化反应特征研究进展——从含N、S小分子药物底物的代谢规律分析[J]. 工程（英文）, 2025, 54(11): 249-272 DOI:10.1016/j.eng.2025.07.029

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1 引言

细胞色素P450酶（P450s或CYPs）是药物吸收、分布、代谢和排泄（ADME）属性的主要贡献因素，负责近80%的小分子药物代谢。P450s表现出广泛的催化反应多样性和底物特异性[1‒6]。其中，主要的反应类型是羟基化、氧化、环氧化和脱烷基化等[7‒10]。Guengerich在1984年首次提出酶空腔特征是催化反应多样性的关键因素[11‒15]。该假说表明，P450s的活性位点具有高度灵活性和适应性，使其能够容纳并催化多种结构不同的底物。特定底物的分子量与酶活性空腔的大小之间存在相对精确的匹配关系，这构成了P450s在氧化反应中高效催化不同底物的基础[16‒19]。换言之，酶空腔的大小和形状决定着P450s对底物的选择性[20‒23]。此外，Lewis [24]通过准确预测氧化底物与各CYP同工酶空腔大小之间的相关性，为这一观点提供了更多证据支持。这些预测进一步得到了来自人类P450同源建模和X射线晶体学[24‒26]结构信息的支持。

根据Lewis的预测，P450s的空腔大小可分为3种类型。如表1 [27‒44]所示，不同亚型的酶根据其空腔尺寸表现出不同的底物偏好性。CYP2A6、CYP2B6和CYP2E1三种亚型具有较小的结合空腔，因此它们倾向于结合分子量较小的底物[27‒29]；CYP2A6具有相对刚性的活性位点结合口袋，可确保高底物选择性[45]，其远端结构域的灵活性则允许不同大小的底物分子进入并释放产物[46]；中性或弱碱性分子更易被CYP2B6代谢，该酶更偏好非平面分子，通常需要具有1~2个氢键受体的底物[47]；CYP2E1的大部分底物为中性或弱极性分子，该酶主要分解低分子量（通常小于100 Da）物质[28]。相比之下，CYP3A4、CYP2J2和CYP2C8具有更大的结合空腔，这使其能够代谢更广泛的底物，尤其是分子量较大的底物，这三种同工酶对相应底物表现出更高的特异性[30‒34]。CYP3A4优先代谢具有高分子量和强亲脂性的分子，如睾酮和咪达唑仑[48]；CYP2J2能够代谢多种结构各异的外源性和内源性化合物，包括刚性分子、复杂大分子以及长链多不饱和脂肪酸[49]；CYP2C8具有三叉戟形（T形或Y形）活性位点，可容纳较大分子的药物[50]。CYP1A1、CYP1A2、CYP2D6、CYP2C9和CYP2C19是具有中等大小结合腔的亚型，这些亚型显示出独特的底物识别模式；具有平面芳香结构或质子化碱性氮原子的底物优先被CYP2D6代谢[41‒44]；CYP1A1和CYP1A2因其相对宽大且扁平的结合口袋，对扁平、刚性平面分子表现出更高的亲和力[39‒40]；CYP2C19和CYP2D6也表现出类似的底物偏好性，两者都倾向于代谢碱性底物[41]；含有一个或多个酸性官能团的分子会受到CYP2C9的强烈偏好[42‒43]。

空腔大小并非是影响中等分子量（200~400 Da）底物特异性的唯一因素。随着分子构象和官能团类型等其他结构和化学特征的重要性日益凸显，多亚型间发生交叉底物识别的可能性也随之增加。参与羟基化和O-脱烷基化的底物一直是早期关于P450s底物偏好复杂规律性的综述研究重点[23‒24,51‒52]。

含N和S的药物分子因其广泛的药理活性受到越来越多的关注。这类化合物不仅对生物靶标（如各种酶和受体）表现出更高的亲和力，还显著增强了药理活性，并拓展了治疗适应症的范围。值得注意的是，含N和S的药物分子在治疗炎症性疾病、感染、癌症、人类免疫缺陷病毒（HIV）、疟疾、结核病、阿尔茨海默病、帕金森病及糖尿病方面展现出显著的治疗潜力[53‒59]。相较于与药效学特性相关的结构修饰模式，对由P450s介导的含N和含S小分子化合物的代谢模式仍研究不足，现有系统综述型文献或报道也较为有限。本文对294种明确由P450s代谢的小分子底物进行了统计分析，其中部分底物可同时经历多种反应类型；在这些底物中，51.4%的底物被多种CYP亚型交叉代谢。

本研究比较了33种O-脱烷基化底物和164种羟基化反应底物。此外，我们还考察了115种含N底物（包括26种N-氧化底物和96种N-脱烷基化底物）以及29种含S底物（S-氧化底物）与CYP亚型酶的相互作用方式（图1）[60‒63]。作为对照，羟基化和O-脱烷基化反应中交叉代谢底物的比例为53.5%，而含N和含S底物的交叉代谢比例为58.3%，这表明多种同工酶存在显著的交叉代谢作用。在含N、S的底物中，57.6%通过CYP3A4代谢，22.5%通过CYP2D6代谢，26.5%通过CYP1A2代谢；这些底物的分子量分布如下：200~400 Da的底物占68.2%，小于200 Da的底物占10.6%。在300 Da以下的小分子底物中，CYP2E1、CYP2A6和CYP2B6三种小空腔酶的占比分别为66.7%、82.4%和70.8%。在500 Da以上的底物中，CYP3A4和CYP2C8两种大空腔酶的占比分别为80%和20%。在200~400 Da的分子量范围内，酶空腔主导作用基本丧失。我们发现，200~400 Da分子量范围的底物与中等空腔P450s亚型的作用关系难以区分，例如，其中70%是CYP1A2底物，87%是CYP2C19底物，72%是CYP2D6底物，而80%是CYP2C9底物，这表明影响底物特异性的主要因素尚不明确。

总体而言，预测由P450s介导的含N、S小分子化合物的代谢特异性具有重大挑战。因此，本文从P450s介导的N-脱烷基化、N-氧化和S-氧化的催化机制入手，全面总结了各类含N、S化合物的代谢模式。本研究重点探讨了底物的结构特性及其与三类反应中P450s活性的关系。这些发现有助于完善P450s催化代谢的理论框架，深化对P450s在药物代谢中作用的理解，并为更高效药物分子的合理设计提供科学依据。

2 P450同工酶的活性位点拓扑结构及其与底物的相互作用机制

2.1 小空腔代谢酶

CYP2A6的活性位点是一个高度疏水的口袋，由多个芳香族残基（如Phe107、Phe111、Phe118、Phe209和Phe480）构成“芳香笼”，为疏水性底物（如尼古丁、香豆素）提供结合环境[64‒65]。该活性空腔较小，限制了底物和抑制剂的体积。此外，活性位点包含6个底物识别位点（SRS-1~6），分别由不同螺旋和β折叠区域组成，以此调控底物特异性[66]。Asn297是活性位点中唯一的极性残基，通过氢键稳定底物。Phe107、Phe111等Phe簇通过π-π堆积相互作用固定底物的芳香环结构，增强结合稳定性[67]。如图2（a）所示，美地沙明（CYP2A6的底物）展示了CYP2A6活性位点的拓扑结构及其与底物的相互作用机制。

CYP2B6的活性位点包含多个关键残基，如Ile101、Ile114、Phe108、Phe115、Phe297等，这些残基通过疏水相互作用、氢键和卤素-π键等参与底物结合[68]。卤化合物（如溴化物）的卤素原子可与活性位点的苯丙氨酸侧链（如F108、F115、F297）形成π-π相互作用，促进底物定向并增强代谢效率[69‒70]。以CYP2B6底物替马西泮为例，我们在图2（b）中展示了CYP2B6活性位点的拓扑结构及其与底物相互作用的过程。

CYP2E1的活性位点底部是血红素部分，作为催化核心，直接参与氧化反应。其壁面由Ile115、Phe298、Ala299、Thr303、Val364和Leu368等疏水性残基组成，提供范德华力接触；顶面由Phe207和Leu210界定[71]。活性位点与远端空隙通过底物通道连接，Phe298的苯基侧链作为“盖子”，在底物结合时旋转以调节通道开闭[72]。长链脂肪酸结合时，Phe478的构象变化可扩展活性位点体积至1310 Å³ [73]。杂环化合物通过氮原子与血红素铁配位形成稳定键。单环化合物（如吡唑）依赖范德华力与壁面残基（如Ile115、Leu368）接触，双环底物（如苯并咪唑）可通过π-π堆叠与Phe207相互作用。此外，4-甲基吡唑等底物也可与Thr303形成氢键，显著提升亲和力[71]。图2（c）以2,6-二甲基苯胺（CYP2E1的底物）为例，展示了CYP2E1活性位点的拓扑结构及其与底物的相互作用机制。

2.2 中等空腔代谢酶

CYP1A1的活性位点通常呈现平面型结构，与CYP1A2相比，CYP1A1的活性位点及通道区域的疏水性更强，适合结合多环芳烃（PAH）类平面底物（如苯并[a]芘），其活性位点由12个α螺旋和4个β折叠构成，核心区域包括I螺旋、F螺旋和G螺旋[74‒75]。底物可以通过疏水作用、氢键和π-π堆积直接结合活性位点，平面核心部分与I螺旋平行，侧链指向血红素铁，实现高亲和力结合[76]。分子动力学模拟显示，CYP1A1的底物识别位点（SRS2和SRS3）在结合非平面底物时发生显著结构重排，F螺旋和G螺旋的构象变化优化了底物定位[77]。Arg464、Glu460与底物的相互作用在稳定底物结合中起关键作用[78]。以氨基黄酮（CYP1A1的底物）为例，图3（a）展示了CYP1A1活性位点的拓扑结构及其与底物的相互作用机制。

CYP1A2的活性位点具有紧凑的平面结构，体积约为375 Å³，由12个α螺旋和4个β折叠构成，晶体结构研究表明，其活性位点比CYP2A6等酶更狭窄，但容积更大，这与其对平面底物的选择性相关；底物通过平面结构与活性位点的疏水腔结合，能容纳底物的非极性区域，如烷基链或卤代基团[79‒80]。活性位点的疏水腔由Phe226、Ala317等残基形成，促进疏水性和π-π相互作用的形成，偏好平面且疏水的芳香族化合物，如咖啡因、茶碱和氯氮平。这类底物的芳香环结构能适配酶的狭窄活性位点，并通过π-π堆积与Phe226、Ala317等芳香残基结合，同时底物的极性基团（如羟基、氨基）与Thr124、Asp313等残基形成氢键，精确定位底物以促进氧化反应[75,81]。图3（b）以环苯扎林（CYP1A2的底物）为例，展示了CYP1A2活性位点的拓扑结构及其与底物的相互作用机制。

CYP2C9的活性位点由血红素辅基和周围疏水腔构成，底物亲脂性区域与疏水腔结合，促进稳定复合物形成[82]。底物结合诱导活性位点构象变化（如4个β折叠向螺旋F移动），调控底物接近血红素的路径。其中B'螺旋与F-G环包裹活性位点空腔，其构象变化影响底物进入和定位[83]。活性位点通过多个通道（如通道2b、S）与膜表面连接，磷脂分子[如赖氨酸72（K72）与磷脂的氢键作用]和底物亲脂性共同调控通道开放。丙戊酸通过氢键与活性位点结合，影响酶代谢活性；华法林、黄酮类化合物（如芹菜素）与Phe114等芳香残基形成π-π堆积，增强底物特异性[84]。CYP2C9可同时容纳多个底物，其大活性位点（约16%残基参与）允许构象重排以适应不同分子[85]。在图3（c）中，以瑞舒伐他汀（CYP2C9的底物）为例，我们展示了CYP2C9活性位点的拓扑结构及其与底物的相互作用机制。

CYP2C19活性位点由疏水性口袋组成，包含多个关键氨基酸残基（如Ser365、Ile362、Leu366、Phe100、Val208等），这些残基通过氢键、π-π堆积、范德华力和疏水作用与底物结合[80,82]。其中Ser365和Ile362参与氢键网络，稳定底物结合；Phe100位于B-C环，通过构象变化调控活性位点的开闭；而Arg108虽未直接与部分底物[如茜素紫（gallein）]结合，但通过空间排列影响底物亲和力[80]。CYP2C19活性位点具有高度柔韧性，可通过α-螺旋和β-折叠的构象调整（如L-螺旋的疏水性变化）适应不同大小的底物[86]。底物结合后，活性位点的水分子被置换，疏水口袋收缩，形成更紧密的酶-底物复合物[82]。以去甲替林（一种CYP2C19底物）为例，图3（d）展示了CYP2C19活性位点的拓扑结构及其与底物的相互作用机制。

CYP2D6偏好疏水性碱性底物，其底物分子通常含有一个质子化或可质子化的氮原子和一个芳香环。活性位点中的Asp301、Glu216、Phe120和Phe483是底物识别与结合的核心残基。Asp301通过离子相互作用与底物中的碱性氮原子（如胺基）结合，而Glu216可能参与稳定底物方向。Phe120和Phe483则通过π-π堆叠和疏水相互作用，与底物的芳香环结合，共同提升结合亲和力[87‒88]。活性位点具有可塑性，可通过构象变化适应不同底物[87,89]。图3（e）展示了CYP2D6活性位点的拓扑结构及其与美喹他嗪（CYP2D6底物）的相互作用机制。

2.3 大空腔代谢酶

CYP2C8的活性位点具有较大的疏水性口袋，能够容纳多种结构多样的底物。CYP2C8的活性位点比CYP2C9和CYP2C19更大，且存在一个额外的疏水口袋；该口袋由残基Ile102、Ser114、Leu208、Val366和Ile476等构成，其中Ser114、Val366和Ile476的较小侧链允许底物进入额外空间[90]。这种灵活性使其能够适应不同大小的底物（如紫杉醇、瑞格列奈等）。Phe201、Phe205等芳香族残基通过π-π堆叠与底物的疏水区域结合（如紫杉醇的苯环）[90]。Arg97、Arg105、Arg241等精氨酸残基参与离子键或氢键形成，增强底物亲和力[91]。底物结合时，活性位点发生构象调整（如口袋扩张），置换水分子以适应底物尺寸。例如，CYP2C8的催化腔体积因Leu362和Leu366的替换而增大，允许其结合较大分子[92]。图4（a）以尼卡地平（CYP2C8的底物）为例，展示了CYP2C8活性位点的拓扑结构及其与底物的相互作用机制。

CYP2J2的活性位点主要由疏水性氨基酸残基构成，形成一个限制性空腔。通过同源建模和分子动力学模拟发现，Ile127、Phe310、Ala311、Val380和Ile487等残基形成稳定的疏水夹层，限制了底物进入活性位点的路径[93]。此外，活性位点附近的残基（如Gly486和Leu378）通过氢键相互作用，这对底物识别至关重要。CYP2J2倾向于催化底物分子末端的弱反应活性位点，而非化学活性最强的位点。这种选择性与其狭窄的活性空腔（宽度约为9.4 Å）有关，相比CYP3A4（15.1 Å），CYP2J2更易容纳底物中靠近血红素铁的部分[49]。图4（b）以美索哒嗪（CYP2J2的底物）为例，展示了CYP2J2活性位点的拓扑结构及其与底物的相互作用机制。

CYP3A4的活性位点由疏水性的苯丙氨酸簇（如Phe108、Phe213、Phe304等）构成，形成一个可塑的底物结合袋。该区域具有较大的容积（约1386 Å³），允许同时结合多个底物分子[94]。晶体结构显示，苯丙氨酸簇的构象变化可扩大活性区域，促进多底物结合，通过π-π堆积和疏水相互作用稳定复合物[95‒96]。此外，活性位点包含极性残基（如Arg212、Ser119），可能通过氢键或静电作用增强底物特异性[97‒98]。图4（c）以克林霉素（CYP3A4的底物）为例，展示了CYP3A4活性位点的拓扑结构及其与底物的相互作用机制。

3 P450s介导的N、S底物结构类型及其机制

3.1 P450s介导的N、S底物的催化反应及其结构类型

P450s介导的含N、S的底物其催化反应主要包括N-脱烷基化、N-氧化和S-氧化三种反应类型，我们对其中115种含N原子的底物进行了统计分析，55.7%的为多亚型交叉底物，其中，71种底物含有脂肪胺基团，51种底物含有含氮杂环结构。含氮杂环结构涵盖嘌呤、哌啶、嘧啶、哌嗪、吡啶、环己亚胺、二氮七元杂环和桥联双环等；脂肪胺结构则包括叔胺、仲胺和伯胺。

此外，我们还统计了29种含S的底物，其中58.6%的为多亚型交叉底物。29种底物包括13种含硫杂环结构底物和17种含亚砜及硫化物结构底物。含S杂环结构包括吩噻嗪类、噻吩类、噻唑类以及七元含硫杂环化合物。这些发现凸显了P450s介导代谢的复杂性，以及同工酶对含N与含S化合物均存在显著交叉反应性。

3.2 含N、S底物的P450s催化反应机制

3.2.1 N-脱烷基化反应机制

如图5所示，N-脱烷基化机制可分为4个连续步骤：①单电子转移，②质子提取，③氧反弹，④非酶促重排。在此过程中，底物与CYP活性位点结合。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）-细胞色素P450还原酶（CPR）作为氧化还原伴侣蛋白，将电子从三价铁（Fe³⁺）血红素铁转移至二价铁状态（Fe²⁺）。当分子氧（O₂）与Fe²⁺核心结合时，会形成Fe²⁺-O₂复合物。该复合物通过第二个电子（来自CPR）被还原，导致O‒O键断裂并产生高能中间体（FeO³⁺）。高能中间体攻击烷基胺基团中的氢原子，生成羟基自由基（·OH）和碳正离子中间体。该碳正离子中间体会发生分子重排反应，生成α-羟基化产物（如甲醇胺）。甲醇胺（或半缩醛）本身不稳定，进一步经历双电子氧化反应生成亚胺离子（环外或环内）。随后，杂原子与碳原子之间的化学键断裂，通过水解作用最终生成仲胺、醛、酮或醇类化合物[99‒100]。

相比之下，O-脱烷基化通常发生在分子的末端位置，尤其是甲氧基基团（O-去甲基化）表现出较高的敏感性。其反应机制与N-脱烷基化类似，但缺少第一步的单电子转移，仅包含以下3个步骤：①质子提取，②氧反弹，③非酶促重排[12]。

3.2.2 N-氧化反应机制

如图6所示，N-氧化的催化机制可以通过3个步骤解释：①单电子转移，②质子提取，③氧反弹。在此机制中，含氮底物与CYP结合。Fe³⁺通过CPR介导的电子传递被还原为Fe²⁺。O₂与Fe²⁺结合后，随后的电子转移（来自CPR）生成氧铁（FeO³⁺）中间体。然后氢氧根阴离子转移至N-中间体自由基阳离子。最终，通过活化的O-原子转移（氧反弹）生成羟胺或N-氧化物[12,101‒104]。具体而言：伯胺氮被酶促氧化为相应的N-羟胺，进一步自发氧化为亚硝基和硝基形式。仲胺被酶促氧化为相应的N-羟胺，进一步自发氧化为硝酮形式[105]。叔胺被酶促氧化为氧化胺（N-氧化物），这是脂环族含叔氮化合物的常见生物转化[106‒107]。N-氧化物官能团中的O键是高度极化的，因为它的两个电子来自N原子，在图形上，N—O键可由其两种共振结构之一来表示，即由箭头表示或由形式上的电荷分离表示。羟胺和N-氧化物可以通过各种酶系统逆还原为母体胺。

相比之下，P450s的羟基化是非常常见的，该机制认为血红素铁在氧化步骤中处于氧铁基状态（FeO³⁺）。碳羟基化其反应机制与N-氧化类似，但缺少第一步的单电子转移，仅包含以下2个步骤：①质子提取，②氧反弹。

3.2.3 S-氧化反应机制

如图7所示，P450s催化的S-氧化和N-氧化的反应机制相似，都可以通过以下3个步骤解释：①单电子转移，②质子提取，③氧反弹。具体过程如下：含硫底物与CYP结合，Fe³⁺通过CPR还原为Fe²⁺，O₂结合与电子转移产生活性中间体FeO³⁺，FeO³⁺从硫中心抽离氢原子，生成硫自由基，氧反弹导致亚砜形成，进一步氧化（如适用）可能通过额外催化循环生成砜类化合物[12,108]。这种机制表明，底物越容易失去电子，P450s催化的S-氧化作用倾向就越强。在P450s催化的亚砜氧化为砜的反应中，也存在类似的机制。因此，硫原子的亲核性是控制S-氧化反应速率的关键因素之一。此外，砜类化合物无法被还原为亚砜，但亚砜可通过酶促反应重新还原为硫化物。

4 细胞色素P450酶介导的含N化合物的代谢

4.1 N-脱烷基化反应

N-脱烷基化是4种最常见的细胞色素P450酶催化反应类型之一，其在药物代谢中扮演着至关重要的角色。N-脱烷基化的底物结构主要分为含氮杂环和脂肪胺两类。主要涉及含氮杂原子化合物中烷基胺基团的脱烷基化。

我们对96种N-脱烷基化反应的底物进行了统计分析，其中包括41种含氮杂环结构和55种脂肪胺结构的底物。这些底物约61.5%为多亚型交叉代谢底物，主要由CYP3A4（61%）、CYP2D6（26%）、CYP1A2（25%）和CYP2B6（22%）介导代谢。

这些底物的分子量分布如下：10.4%的分子量低于200 Da，22.9%的分子量高于400 Da，66.7%的分子量介于200~400 Da之间。CYP3A4和CYP2C8负责代谢分子量大于500 Da的底物（占4.2%）（附录A中的表S1和表S2）。

4.1.1 含N-杂环结构底物的N-脱烷基化反应

我们对41种含氮杂环结构的N-脱烷基化反应底物进行了统计分析，这些底物包括6个含氮七元杂环（如环己胺和苯二氮䓬类）、3个嘌呤类结构、14个哌嗪类结构、8个吡啶类结构、1个吡咯、1个吗啉、1个嘧啶、1个咪唑和6个桥联双环底物。其中，61.0%的底物为多亚型交叉代谢底物。具体而言，70.7%由CYP3A4代谢，24.4%由CYP1A2代谢，19.5%由CYP2D6代谢。这些底物的分子量分布如下：63.4%处于200~400 Da范围内，9.8%低于200 Da，26.8%超过400 Da（表S1）。

哌嗪结构在含氮杂环化合物中最为常见，占此类化合物的34%。由于其较大的分子量和独特的电子密度分布，哌嗪类结构更倾向于被大空腔的CYP3A4酶代谢。例如，米安色林是一种哌嗪类抗抑郁药，通常以外消旋混合物的形式成药[109]，其代谢过程主要涉及由CYP3A4和CYP1A2催化的去甲基化反应，同时CYP2D6也参与其N-去甲基化（图8中1）[110‒111]。曲唑酮是第二代哌嗪类抗抑郁药，通过5-羟色胺2受体（5-HT₂）拮抗作用和5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制作用发挥药效[112]。曲唑酮主要是通过CYP3A4在哌嗪环上进行N-脱烷基化代谢，生成间氯苯基哌嗪（m-CPP）（图8中3）[113‒115]。在氮杂环类底物中，吡啶类结构较为常见，大部分通过CYP3A4完成N-脱烷基化代谢。例如，凯托咪酮是一种具有N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗活性的吡啶类镇痛药，它主要通过CYP3A4和CYP2C9进行N-去甲基化反应，生成去甲氯胺酮（图8中5）[116‒118]。Bondesson等[120]从人尿液中鉴定出去甲氯胺酮，其通过N-去甲基化形成的代谢物占给药剂量的10%~37%。硫利达嗪是吡啶类神经抑制剂的原型药物，具有镇静和抗抑郁活性，对精神分裂症的阳性和阴性症状均有效[120]。硫利达嗪能够被CYP3A4和CYP1A2催化发生N-去甲基化反应，生成去甲硫利达嗪（图8中6）[121‒122]。

七元含氮杂环化合物主要包括两类药物：苯二氮䓬类（如地西泮、氟硝西泮、夸西泮和氯硝西泮）及环己胺衍生物[123‒124]。这些药物主要通过CYP2C19和CYP3A4进行去甲基化代谢。例如，地西泮的主要活性代谢物去甲地西泮，是通过CYP2C19和CYP3A4介导的去甲基化作用形成的（贡献率分别为33%和44%）（图8中4）[123,125‒129]。类似地，氟硝西泮通过CYP2C19（63%）和CYP3A4（37%）代谢为去甲氟硝西泮（图8中10）[124,130‒131]。氯硝西泮和夸西泮具有相似的代谢途径，其中CYP3A4和CYP2C19是关键代谢因子[83‒84]。

相比之下，环己胺衍生物（如氮卓斯汀和加兰他敏）主要通过CYP2D6和CYP3A4进行代谢[131]。例如，氮卓斯汀（azelastine）是一种具有组胺H1受体拮抗活性的长效抗过敏及抗哮喘药物，用于治疗花粉热和过敏性结膜炎[132]。体外研究表明，氮卓斯汀的N-去甲基化代谢主要由CYP3A4和CYP2D6催化（图8中9），二者分别贡献了76.6%和21.8%，而CYP1A2的作用较小（3.9%）。氮卓斯汀经口服给药后，在人血浆中可检测到去甲基氮卓斯汀且其为主要代谢产物。去甲基氮卓斯汀的药理活性与母体药物相当，两种化合物在体外均有抑制CYP2C19和CYP2D6的作用[133‒135]。加兰他敏是一种环己亚胺类结构药物，对阿尔茨海默病有显著的疗效[136]。加兰他敏主要通过CYP2D6进行N-去甲基化代谢为N-去甲基加兰他敏（图8中2）。健康志愿者在单次口服加兰他敏后，其尿液中可检测到N-去甲基加兰他敏这一代谢物，但只有约5%的以N-去甲基加兰他敏的形式排泄[137‒138]。

嘌呤类结构药物通常是小分子，且可收集的数量较少，主要通过CYP1A2代谢。例如，咖啡因是一种嘌呤类中枢神经系统（CNS）兴奋剂和利尿剂[139]。咖啡因的主要代谢途径是通过CYP1A2的3-去甲基作用生成副黄嘌呤，而CYP2E1则是参与咖啡因N1-和N7-去甲基化的低亲和力组分的主要酶。咖啡因的1-、3-和7-去甲基作用分别生成可可碱（12%）、副黄嘌呤（80%）和茶碱（4%）（图8中13）[140‒141]。茶碱是一种用于治疗哮喘和慢性阻塞性肺病（COPD）的嘌呤类支气管扩张剂，通过抑制腺苷受体发挥作用[142‒143]。茶碱主要通过CYP1A2催化N-去甲基化代谢为1-甲基黄嘌呤和3-甲基黄嘌呤，此外，CYP2A13也能催化茶碱的3-去甲基化，约6%的茶碱还能被N-甲基化为咖啡因（图8中14）[144‒147]。与上述两种药物相比，多索茶碱（DOXO）属于甲基黄嘌呤类衍生物，在哮喘和慢性阻塞性肺疾病治疗中是二线药物；其疗效好、安全窗宽[148]。与其他嘌呤类化合物不同，DOXO的主要代谢位点集中在其N-7位独特的环状缩醛结构（1,3-二氧戊环）上。代谢反应表型的研究进一步发现DOXO主要通过CYP1A2催化1,3-二氧戊环的开环氧化反应生成茶碱乙醛，这是DOXO代谢的起始步骤和限速步骤。但其反应类型不属于N-脱烷基化，与其他嘌呤类的代谢不同，DOXO嘌呤环上的N-去甲基化代谢产物几乎很难检出，是含N衍生物中的特例[149]。

吡啶类结构药物在氮杂环中的占比也较小，如尼古丁通过CYP2A6和CYP2B6去甲基化为可替宁[150]。可替宁在人血浆和大鼠脑中的半衰期分别是尼古丁的6倍和3倍。在体外实验中，CYP2A13比CYP2A6能更有效地催化尼古丁的N-去甲基化[151]。桥联双环氮杂环化合物由于其复杂的三维结构，主要通过CYP3A4进行代谢，这可能由空腔主导结合模式来决定。曲贝替定是一种具有桥联双环氮杂环结构的海洋生物碱，其在欧洲获批为用于治疗软组织肉瘤的新型强效抗癌药[152‒153]。其主要通过CYP3A4进行N-去甲基化反应形成代谢产物去甲基衍生物ET-729 [154]。吗啡和羟考酮也是具有桥联双环氮杂环结构的药物。吗啡主要通过CYP2B6、CYP3A4和CYP2C8进行N-去甲基化反应，而羟考酮主要通过CYP3A4进行N-去甲基化反应（图8中11和12）[155‒156]。

4.1.2 含脂肪胺结构底物的N-脱烷基化反应

我们分析了55个脂肪族胺类底物，包括44个叔胺和11个仲胺化合物，其中54.5%表现出多亚型代谢。代谢分布如下：55%由CYP3A4代谢，33%由CYP2D6代谢，27%由CYP1A2代谢，25%由CYP2B6代谢。这些底物的分子量分布情况为69.1%的分子量范围为200~400 Da，10.9%的分子量小于200 Da，另有20%的分子量超过400 Da（表S2）。叔胺结构在脂肪族胺类底物中尤为常见，主要参与N-去甲基化反应。典型的叔胺结构包括N-二甲基和N-单甲基基团，其中甲基部分极易被氧化，并最终通过P450s催化去除，生成相应的胺类代谢产物。除N-去甲基化外，含有叔胺和仲胺的化合物中还常发生N-脱烷基化反应。最常见的N-脱烷基基团包括乙基、正丙基、异丙基、烯丙基和苄基。

在N-脱烷基化过程中，仲胺主要发生N-单甲基结构的N-去甲基化，偶尔也会发生丙基或异丙基部分的脱烷基化。中空腔CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19和小空腔CYP2B6是代谢这些底物的主要酶，这些底物通常是微小至中等大小的化合物。例如，CYP2D6和CYP2C19主要代谢几种具有仲胺结构的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRIs），如西酞普兰、氟西汀、舍曲林和帕罗西汀[157‒160]。此外，CYP2C9和CYP3A4在体外代谢途径中也起着重要作用。具体而言，西酞普兰主要通过CYP2D6和CYP2C19代谢为N-去甲基西酞普兰，随后进一步去甲基化为双去甲基西酞普兰[161‒162]。氟西汀作为一种强效SSRI抗抑郁药，主要通过CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9和CYP3A4经N-去甲基化代谢生成去甲氟西汀（图8中的23）[163]。在低浓度下，CYP2D6是通过N-去甲基化将氟西汀转化为R-和S-去甲氟西汀的主要酶。随着底物浓度增加且CYP2D6饱和，CYP3A4和CYP2C9的贡献变得更加显著[160,164]。此外，3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺（MDMA）主要通过CYP2D6经N-去甲基化代谢为3,4-亚甲二氧基苯丙胺，而CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4对MDMA的N-去甲基化亲和力较低（图8中的24）[165‒168]。

在N-去甲基化反应中，N-二甲基和N-单甲基结构是最为常见的叔胺结构，其中N-二甲基结构的底物占比较大。这些底物大多为中小分子，主要通过大空腔的CYP3A4以及中等空腔的CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19和CYP1A2进行代谢。例如，阿米替林显现出多亚型的底物交叉性，主要由CYP2C19、CYP2C9、CYP1A2和CYP3A4进行N-去甲基化生成去甲替林，此外，E-10-羟基阿米替林也能通过N-去甲基化生成E-10-羟基去甲替林（图8中的15）[169‒170]。氯丙帕明是一种三环类叔胺抗抑郁药，主要通过CYP2C19、CYP1A2和CYP3A4转化为其活性代谢物去甲基氯丙帕明（图8中的17）[171‒172]。敌草隆是一种广泛使用的除草剂和杀虫剂[173]，在人肝微粒体中，仅形成N-去甲基敌草隆，重组CYP1A1、CYP1A2、CYP2C19和CYP2D6等多个亚型参与敌草隆的N-去甲基反应，其中，CYP1A2、CYP2C19和CYP3A4对肝脏中敌草隆N-去甲基化代谢的相对贡献分别为60%、14%和13%（图8中的16）[174]。N-单甲基叔胺结构底物主要是通过CYP3A4、CYP2B6、CYP1A2进行代谢。司来吉兰是一种用于治疗帕金森病的选择性不可逆单胺氧化酶（MAO-B）抑制剂[175‒176]，主要通过CYP2D6进行N-去甲基化反应，生成去甲基苯丙胺（M1）；同时，司来吉兰也通过CYP3A4和CYP1A2进行N-脱丙基化，生成甲基苯丙胺（M2）（图8中的21）[177]。维拉帕米是一种钙离子拮抗剂，常用于治疗心律失常、心绞痛和高血压。由于会发生广泛的首过代谢，导致其药物生物利用度较低，并且治疗血药浓度存在较大变异性[178]。维拉帕米主要通过CYP3A4和CYP1A2进行N-去甲基化，生成去甲维拉帕米。此外，CYP2C8也能将S-和R-维拉帕米代谢为去甲维拉帕米（图8中的18）[179]。

除了上述两种主要的叔胺结构（N-二甲基和N-单甲基）之外，N-乙基、正丙基、异丙基、烯丙基和苄基等也是常见的叔胺结构，这些结构主要通过CYP2C8和CYP3A4进行代谢。在较为常见的N-乙基结构药物中，胺碘酮是一种III类抗心律失常药，用于治疗危及生命的室上性和室性心律失常，如室颤或血流动力学不稳定的室性心动过速[180‒181]。胺碘酮主要通过CYP3A4和CYP2C9进行N-去甲基化代谢，生成无活性代谢物去乙基胺碘酮（图8中的22）。

在临床相关浓度下，CYP3A4和CYP2C8在肝脏代谢中起主要作用，而CYP1A2、CYP2C19和CYP2D6的贡献较小[182‒184]。N-异丙基基团常见于某些抗组胺药和抗炎药中。例如，氟伐他汀是一种广泛使用的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，其主要通过CYP2C9代谢，该酶催化吲哚部分的N-去异丙基化，生成N-去异丙基氟伐他汀（图8中的19）[185‒186]。类似地，含有N-氯乙基部分的药物，如环磷酰胺和异环磷酰胺，主要通过CYP3A4和CYP2B6经N-去氯乙基化代谢，形成无活性的去氯乙基代谢物和有毒副产物（包括氯乙醛）[187‒190]（图8中的20）。

为对比N-脱烷基化与O-脱烷基化作用，我们分析了34种O-脱烷基化底物，其中63.6%经多种CYP同工酶代谢。主要参与的酶为CYP2D6（占底物的45.5%）、CYP3A4（39.4%）和CYP1A2（27.3%）。这些底物的分子量分布如下：27.3%的分子量超过400 Da，69.7%处于200~400 Da范围内，3%的分子量低于200 Da（详见附录A中的表S3和表S4）。

根据N-脱烷基化与O-脱烷基化的对比研究，CYP3A4对N-脱烷基化底物具有相对更高的代谢亲和力和活性。CYP3A4的代谢稳定性是药物开发中的关键因素，尤其对于需要进行N-脱烷基化的药物而言。相反，CYP2D6对发生O-脱烷基化的底物表现出更强的代谢亲和力。在分子量介于200~400 Da的分子中，N-脱烷基化与O-脱烷基化的代谢效率存在显著差异。

以报道的1,8-萘酰亚胺类骨架为例，我们发现CYP1A介导的O-脱烷基化反应易发生在多环芳烃类和其他芳香类底物中[191‒192]，且CYP1A1和CYP1A2的催化特性难以区分。CYP1A空腔富含羟基氨基酸，其空腔（260 Å³）只比CYP2A6的活性空腔略大，却远小于CYP3A4和CYP2C8的活性空腔（约1400 Å³）[27‒28,45‒49]，偏好芳香烃类底物和O-脱烷基化反应，我们根据上述特征，以200~400 Da范围内的1,8-萘酰亚胺类双光子荧光化合物为母体，在4位引入甲基基团，首次成功设计并合成可用于特异性检测活细胞和组织中CYP1A的双光子比率型荧光底物探针。虽然，上述修饰改造可以将CYP1A的选择性很好地与其他CYP亚型区分开来，但CYP1A亚家族中的两个亚型CYP 1A1和CYP 1A2的催化特性仍难以区分。

我们进一步根据CYP1A1和CYP1A2的活性空腔差异[即CYP1A2展现出相对紧凑的活性空腔（空腔体积为375 Å³，CYP1A1的活性空腔体积为524 Å³），偏好芳香胺类或杂环化合物]，设计出在平面结构的四侧有卤素取代的结构，在4位引入氯乙基基团，首次获得了双光子比率型的CYP1A1荧光高选择性探针[191‒192]。

具体而言，在N-脱烷基化反应中，含氮杂环类底物主要包括哌嗪类和哌啶类结构，这两类结构因较大的分子量和独特的电子密度分布，更倾向于被大空腔的CYP3A4代谢。七元氮杂环类结构主要包括苯二氮䓬类和环己亚胺类化合物，其分子量大多在300 Da左右。苯二氮䓬类底物主要通过CYP2C19和CYP3A4代谢，而环己亚胺类结构底物则主要通过CYP2D6和CYP3A4代谢。嘌呤类结构底物通常是小分子，且种类较少，主要通过CYP1A2代谢。桥联双环氮杂环化合物由于其复杂的三维结构，主要通过CYP3A4进行代谢。在仲胺类脂肪胺结构中，N-单甲基结构是最主要的类型，主要涉及N-去甲基化反应，少数情况下会脱去丙基或异丙基等基团。这些底物大多是中小分子，主要通过中等空腔的CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19以及小空腔的CYP2B6进行代谢。在N-去甲基化反应中，N-二甲基和N-单甲基结构是最为常见的叔胺结构，其中N-二甲基结构的底物占比较高。这些底物大多是中小分子，主要通过大空腔的CYP3A4以及中等空腔的CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19和CYP1A2进行多亚型交叉代谢。除了上述两种主要的叔胺结构（N-二甲基和N-单甲基）外，N-乙基、正丙基、异丙基、烯丙基和苄基等结构也是常见的叔胺类型。这些结构大多存在于大分子化合物中，因此，主要通过CYP2C8和CYP3A4进行代谢。根据这些研究结果，小至中分子的N-脱烷基化代谢途径与其化学结构的相关性显著强于与分子量的相关性。含有不同含氮结构基序的底物在异构体特异性方面表现出显著差异。底物分子量与CYP酶在N-脱烷基化反应中异构体的关系总结于图9。

然而，这些总体趋势中也有一些显著的例外情况。例如，哌嗪类化合物右佐匹克隆的分子量尽管高达388.8 Da，却能被CYP2E1代谢。这是因为在脂肪酸配体存在的情况下，CYP2E1的活性位点腔的大小和拓扑结构会发生显著变化。具体而言，CYP2E1的空腔体积不再是标准的190 Å³，而是增加了一倍以上，使得较大的分子能够进入酶的活性位点[193]。此外，CYP2E1的活性位点中存在特定的氨基酸残基Thr303，能够与右佐匹克隆形成有效的相互作用，从而促进其进入酶的活性位点。因此，CYP2E1对右佐匹克隆的代谢具有较高的内在清除率，这是一例极少见的违反空腔偏好性假设的案例。即使底物分子较大，CYP2E1也能有效地进行N-脱烷基化代谢[194]。

其他一些值得注意的特例包括哌嗪化合物氯桂利嗪和桂利嗪，以及哌啶类化合物西沙必利。尽管这些化合物的分子量较大，但由于其分子结构具有一定的柔性，能够以不同的构象进入酶的活性位点，从而可通过小空腔的CYP2A6进行N-脱烷基化代谢。此外，CYP2E1活性位点中的特定氨基酸残基Asn297能够与底物形成有效的相互作用，进一步促进底物进入活性位点。除此之外，叔胺类的大分子底物洛哌丁胺和左旋-α-醋美沙朵（LAAM）能够被CYP2B6代谢。CYP2B6的活性位点中存在特定的氨基酸残基Glu301和Thr302，这些残基能够与底物形成有效的相互作用，从而促进底物进入活性位点。在某些情况下，其他蛋白质（如细胞色素b5）的共表达可以显著增强CYP2B6对LAAM的代谢能力[195]。这些特殊情况表明，小空腔酶（如CYP2A6和CYP2B6）的活性空腔具有很强的柔韧性和灵活性，能够在与底物结合时发生构象变化，从而适应中等分子量的底物。这种柔韧性使得这些酶能够代谢一些通常被认为超出其空腔大小限制的底物。

4.2 N-氧化反应

我们对26种经历N-氧化的底物进行了统计学分析。这些底物的结构可分为两类：脂肪族胺结构和含氮杂环结构。这两类分别包含10种和16种底物，其中46%的底物被多种不同的CYP同工酶交叉代谢。具体代谢分布如下：46%由CYP3A4代谢，38%由CYP1A2代谢。大多数N-氧化底物为中小分子，其中96%的底物分子量低于400 Da，分子量分布如下：46%的底物分子量在200~300 Da之间，27%位于300~400 Da范围内，23%低于200 Da，4%高于400 Da（附录A表S3和表S4）。

4.2.1 含N-杂环结构底物的N-氧化反应

在本研究关注的十种含N-杂环结构底物中，半数可被多种CYP同工酶可交叉代谢。具体而言，CYP3A4代谢约70%的底物，而CYP1A2可能代谢约50%的底物。这些底物的特定结构分类包括：1种嘧啶类、2种哌嗪类、3种吡咯类、1种吡啶类以及1种苯二氮䓬类。其分子量分布如下：80%位于200~400 Da范围内，10%低于200 Da，另有10%超过400 Da（表S3）。

哌嗪类结构具有较大的分子量，这使得CYP1A2和CYP3A4对其具有更高的选择性。例如，伊马替尼是一种高选择性且强效的蛋白酪氨酸激酶抑制剂，能够抑制裂点簇区-Abelson（BCR-ABL）酪氨酸激酶，该酶是慢性髓细胞白血病中因费城染色体异常而产生的组成性异常酪氨酸激酶[196‒198]。伊马替尼主要通过CYP3A4进行N-氧化反应代谢，生成的主要代谢产物包括哌嗪-N-4-氧化物（CGP 72383）和吡啶N-氧化物（CGP 71422），其中哌嗪环上的N-氧化物是主要的氧化代谢产物（图10中的1）[199‒200]。

吡咯类结构由于分子量较小，容易在小空腔酶CYP2A6和CYP1A2的作用下发生N-氧化反应。例如，依来曲普坦是一种5-羟色胺₁B/₁D（5-HT₁B/₁D）受体的选择性激动剂，用于治疗偏头痛[201]。在人体中，依来曲普坦被迅速吸收并广泛代谢。其口服生物利用度约为50%，半衰期适中。依来曲普坦的吡咯烷结构主要通过CYP1A2进行N-氧化代谢（图10中的2）[202]。在吡咯类化合物中，尼古丁含有两个叔氨基作为潜在的N-氧化位点：碱性更强的吡咯烷N-原子（pK_a = 7.9，pK_a为酸解离常数的负对数，是衡量碱性强弱的指标，pK_a数值越大代表碱性越强）和碱性更弱的吡啶N-原子（pK_a = 3.1）。N-氧化反应仅发生在碱性更强的吡咯烷N-原子上，因此产物具有区域选择性[99]。嘧啶环结构的药物，如第二代广谱三唑类抗真菌剂伏立康唑，对多种临床显著病原体（包括曲霉菌、念珠菌、单孢菌和镰孢菌属）表现出强效活性[203‒204]。伏立康唑主要通过肝脏代谢，少于2%的剂量以原型形式排泄[205]。伏立康唑主要通过CYP2C19和CYP2C9代谢，也有少量通过CYP3A4进行N-氧化催化代谢。其氟嘧啶环的N-氧化物（UK-121）是人体内的主要循环代谢物（图10中的3）[206‒208]。

4.2.2 含脂肪胺结构底物的N-氧化反应

涉及脂肪族胺的N-氧化反应包括伯胺、仲胺和叔胺。伯胺和仲胺主要生成N-羟胺产物，而叔胺则形成N-氧化物。与母体分子相比，N-氧化物的理化特性最显著的两个变化是亲水性增强和碱性降低[107]。这些反应中，氮原子上的取代基团可以是甲基、乙基、正丙基等烷基链。我们收集了16种脂肪胺结构的底物，其中包括10种伯胺类、2种仲胺类和4种叔胺类底物。这些底物的代谢分布如下：38%由CYP1A2代谢，25%由CYP1A1代谢，25%由CYP3A4代谢。分子量分布情况如下：69%的底物分子量介于200~400 Da之间，31%的底物分子量低于200 Da（表S4）。

伯胺结构主要通过N-氧化反应生成N-羟胺产物，且大多为小分子化合物。因此，这些化合物主要通过中等空腔的CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2和CYP1A1进行代谢。例如，美西律是一种伯胺类抗心律失常药物，用于治疗和预防急性和长期室性心律失常。它可以通过口服给药，半衰期为6~12 h；在人体中，小于口服剂量的10%是以原形经尿液排泄的[209‒212]。美西律主要通过CYP1A2进行N-氧化反应，生成N-羟胺代谢产物；然而，CYP2E1和CYP2B6也在较小程度上参与这一过程（图10中的9）[213]。另一种伯胺类药物是氨基黄酮，它对人乳腺癌MCF7细胞具有显著的体外生长抑制活性[214]。研究表明，CYP1A1在生成N5-OH-氨基黄酮（M-II）和N4'-OH-氨基黄酮（M-III）方面比CYP1A2具有更强活性。与CYP1A1和CYP1A2类似，重组CYP2C9和CYP2C19也参与氨基黄酮的N-羟基化反应，生成M-II和M-III（图10中的10）[215]。

大多数仲胺类底物属于小分子化合物，且相对少见。CYP1A1和CYP1A2主要通过N-氧化作用代谢这些物质，生成N-羟胺衍生物。例如，CYP1A1和CYP1A2通过N-氧化作用使镇痛药非那西丁[216‒217]发生生物活化，生成活性物质N-羟基-对乙氧基苯胺（图10中的7）[218‒220]。胍那苄（guanabenz）作为中枢作用的β₂肾上腺素受体激动剂，具有降压功效和降压特性[221]，主要通过CYP1A2的N-氧化作用代谢（图10中的8）。胍那苄与胍诺莎苄之间的相互转化[222]，是评估CYP1A2活性的重要指标之一。

叔胺类结构化合物大多是中小分子量物质，主要通过CYP3A4和CYP1A2进行代谢，生成N-氧化物。例如，佐替平是一种非典型的叔胺类抗精神病药物，主要用于治疗急性和慢性精神分裂症[223]。佐替平在人体中发生广泛代谢，只有少量以原型药物形式经尿液排泄[224]。其主要代谢途径是通过CYP3A4进行N-氧化反应（图10中的4）[225]。佐米曲普坦是一种5-HT₁B/₁D受体激动剂，用于治疗偏头痛[226]。佐米曲普坦在新鲜分离的人肝细胞中被广泛代谢，生成多种产物。其中，主要的代谢产物之一是有活性的N-氧化物，其形成主要由CYP1A2催化（图10中的5）[227]。利多卡因是一种Ib类抗心律失常药和局部麻醉剂，用于治疗心脏手术或心肌梗死期间发生的室性心律失常，也用作局部麻醉剂[228‒229]。利多卡因主要通过CYP1A2和CYP3A4进行N-氧化代谢（图10中的6）[230]。

为了与N-氧化进行比较，我们对164种经历羟基化反应的底物进行了统计分析，其中48.8%由多种同工酶交叉代谢。具体代谢分布如下：34.1%可由CYP3A4代谢，25.6%由CYP2D6代谢，20.1%由CYP2C9代谢，18.9%由CYP2A6代谢，20.1%由CYP1A2代谢。这些底物的分子量分布如下：14.6%的底物分子量大于400 Da，16.5%的分子量低于200 Da，68.9%的分子量介于200~400 Da之间（附件A表S5）。通过与N-氧化的比较分析发现，N-氧化底物倾向于经历同工酶特异性代谢。例如，CYP3A4对N-氧化底物的代谢亲和力和活性显著高于其对羟基化底物的代谢亲和力和活性。在药物开发中，对于含有可氧化氮原子的化合物，考虑CYP3A4的代谢作用至关重要。在我们统计的N-氧化反应中，底物主要是中小分子，其96%的底物分子量在400 Da以下，但这些底物的N-氧化修饰仍主要由CYP3A4代谢。相比之下，在羟基化反应中，分子量达到400 Da以上的底物才更倾向于通过CYP3A4进行催化代谢。综上所述，通过对比N-氧化和羟基化两种氧化反应的代谢特性，可以为新药研发中的代谢稳定性和药物结构优化提供重要的理论依据。

本研究对P450介导的羟基化反应进行了系统分析，重点探讨了CYP3A4与CYP3A5之间的差异。这两种同工酶的氨基酸序列同源性约为83%，且底物特异性存在显著重叠。总体而言，这些同工酶参与约50%市售药物的代谢过程，其代谢贡献成为药物代谢与药代动力学（DMPK）领域研究的重大挑战。以五味子果实提取的二苯并环辛二烯木脂素为研究模型，我们发现CYP3A酶系内部存在不同的代谢偏好。例如，具有6个甲氧基的五味子甲素作为CYP3A4和CYP3A5的共同底物[231]；而C-7位羟基化的二苯并环辛二烯木脂素——戈米辛A和五味子素，则仅被CYP3A4选择性代谢[232‒233]。类似地，天然存在的二苯并环辛二烯木脂素五味子素E（具有C-6位苯甲酰基和C-12位羟基）则被CYP3A5选择性代谢[234]。

研究人员还对另一类天然蟾蜍二烯内酯类化合物进行了研究，这类物质同样对CYP3A同工酶表现出独特的代谢偏好。研究结果表明，C-16位带有乙酰基的蟾蜍二烯内酯类化合物（如华蟾蜍精和蟾蜍他灵）可同时被CYP3A4和CYP3A5代谢[235]。相比之下，缺乏C-16乙酰基的两种天然蟾蜍二烯内酯类化合物——布福吉宁和蟾毒灵——则被CYP3A4选择性代谢，形成相应的5β-羟基化产物[236]。后续研究表明，这些蟾蜍二烯内酯类化合物的C-3位羟基和C-14/15位环氧基团是CYP3A4催化氧化的关键结构，而C-16位的乙酰基取代基可能有助于提高CYP3A5的代谢效率[237]。

特别地，具有含氮杂环结构的药物在N-氧化过程中表现出独特的代谢特征。由于分子量较大，哌嗪类化合物主要通过CYP1A2和CYP3A4代谢。相比之下，分子量较小的吡咯类化合物更可能通过中小空腔酶亚型（如CYP2A6和CYP1A2）催化N-氧化反应。在脂肪族胺结构中，伯胺主要通过N-氧化生成N-羟胺产物，且主要是小分子化合物。因此，这些化合物主要由中空腔酶亚型（包括CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2和CYP1A1）代谢。CYP2D6、CYP2C9、CYP1A2和CYP1A1等中空腔酶同样代谢仲胺底物，这些底物也主要是小分子且较为罕见。由于分子量较小，仲胺底物更容易被上述酶代谢。相比之下，具有中等分子量特征的叔胺化合物主要通过CYP3A4和CYP1A2代谢。通过与羟基化反应的比较，我们发现N-氧化底物通常经历多亚型代谢，而羟基化反应在识别特定代谢酶亚型（包括CYP3A4和CYP3A5）方面具有更高的特异性。

这一区分为药物代谢研究中的反应表型分析和酶鉴定提供了宝贵的分子工具。底物分子量与CYP酶在N-氧化过程中的亚型关系总结如图11所示。

5 细胞色素P450酶介导含S化合物的代谢

S-氧化是由P450s催化的关键反应，该反应将含硫化合物氧化为相应的亚砜和砜类化合物。我们分析了29种发生S-氧化的底物，包括13种含硫杂环结构和17种硫醚及亚砜类化合物。这两类底物之间存在交叉反应底物。其中52.7%的底物可被多种CYP同工酶代谢。代谢分布如下：57%由CYP3A4代谢，17%由CYP1A2代谢，17%由CYP2C19代谢，17%由CYP2D6代谢。S-氧化中的大多数底物为小分子，分子量分布如下：80%介于200~400 Da之间，17%介于400~500 Da之间，3%超过500 Da（附录A表S6和表S7）。

5.1 含S杂环化合物的S-氧化反应

我们分析了13种含硫杂环底物，包括7种吩噻嗪类、2种噻吩类、2种噻唑类、1种异噻唑类和1种七元含硫杂环底物。其中53.8%的底物可被多种CYP同工酶代谢，代谢分布如下：46%由CYP3A4代谢，37%由CYP1A2代谢，37%由CYP2D6代谢。分子量分布如下：76.9%的分子量介于200~400 Da之间，23.1%超过400 Da（表S6）。

在含硫杂环结构化合物中，吩噻嗪衍生物是最主要的代谢类型，占此类化合物的54%。这些化合物通过CYP2D6、CYP3A4和CYP1A1催化的S-氧化反应生成亚砜产物。例如，吩噻嗪类药物丙嗪在人体内主要通过CYP1A2和CYP3A4对噻嗪环进行S-氧化代谢，这是其主要代谢途径之一（图12中的4号途径）[238‒239]。非镇静型长效吩噻嗪组胺H₁受体拮抗剂美索哒嗪[240]，主要通过CYP2D6在人肝微粒体中对吩噻嗪结构侧链进行S-氧化代谢（图12中的1）[241‒242]。硫利达嗪是一种哌啶类吩噻嗪类抗精神病药，对精神分裂症症状有效[120]，其代谢途径与美索哒嗪类似：CYP1A2和CYP3A4驱动5-亚砜形成，而CYP2D6催化2-S-氧化生成美索哒嗪（一种亚砜）。该亚砜进一步被氧化为硫利达嗪砜。CYP3A4还介导硫利达嗪的直接2-S-氧化（图12中的3）。硫利达嗪的5-亚砜是一种环状亚砜，对多巴胺能或去甲肾上腺素能受体无活性，但可能参与硫利达嗪诱导的心脏毒性[121‒122,243]。

其他已鉴定的含硫杂环底物结构包括噻吩、噻唑和七元硫杂环化合物，不过这些结构相对少见。噻吩结构主要通过CYP3A4的高效S-氧化代谢形成亚砜。此外，其他中空腔CYP同工酶（如CYP2D6、CYP2C9和CYP2C19）也可介导S-氧化代谢。例如，噻氯匹定、氯吡格雷和普拉格雷均为噻吩-吡啶二磷酸腺苷（ADP）受体拮抗剂[244‒246]。噻氯匹定是一种强效长效血小板聚集抑制剂，其通过抑制嘌呤能受体P2Y12（P2RY12）受体发挥功能[247‒248]。噻氯匹定经重组人CYP2C19和CYP2D6催化S-氧化，形成噻吩-S-氧化二聚体（M2）（图12中的6）[249‒250]。七元硫杂环是不常见的S-氧化底物。例如，佐替平是一种在日本和德国用于治疗急性和慢性精神分裂症的非典型抗精神病药物[223]。佐替平在大鼠和人体内均发生广泛代谢，仅少量以原形经尿液排泄。其主要代谢途径是CYP3A4催化的S-氧化，CYP3A5、CYP1A1、CYP1A2和CYP2B6也以较低效率参与（图12中的2）[225,251]。

5.2 硫醚和亚砜类结构底物的S-氧化反应

我们分析了17种具有硫醚和亚砜结构的底物，其中包括10种硫醚和7种亚砜。其中41.2%的化合物可被多种CYP同工酶代谢。具体代谢分布如下：65%由CYP3A4代谢，18%由CYP2C19代谢。分子量分布如下：82.4%处于200~400 Da范围内，17.6%超过400 Da（表S7）。这些化合物广泛存在于药物和内源性物质中，其硫原子取代基包括烷基、芳基或更复杂的官能团。

硫醚类底物主要通过CYP3A4代谢，并经CYP酶氧化生成相应的亚砜[252]。作为硫醚氧化中间体的亚砜，在CYP酶催化作用下可进一步氧化为砜类化合物。例如，含磷硫醚类农药（包括硫醚有机磷化合物和氨基甲酸酯类化合物）通常通过CYP酶氧化并解毒[253‒254]。在甲拌磷、乙拌磷、硫丙磷和甲硫威这四种含硫醚化合物中，甲硫威主要通过CYP1A2进行硫氧化反应，将硫醚化合物转化为亚砜产物（图12中的7和8）。这些硫醚类杀虫剂是CYP2C9的非典型底物，可能是由于CYP2C9倾向于代谢酸性化合物[255]。

亚砜底物主要通过大腔酶CYP3A4和中腔亚型（如CYP2D6、CYP2C9和CYP2C19）同工酶经S-氧化转化为砜类物质进行代谢。一个典型的例子是质子泵抑制剂（PPI），包括奥美拉唑、泮托拉唑、兰索拉唑和雷贝拉唑，这些药物都具有非手性苯并咪唑亚砜核心结构[256]。CYP2C19主导PPI代谢，而CYP3A4和CYP2C9的贡献较小[257‒262]。奥美拉唑主要通过CYP3A4和CYP2C19经S-氧化转化为奥美拉唑砜（图12中的10）进行广泛的肝脏代谢[257,263]。兰索拉唑是一种第二代PPI，用于治疗消化性溃疡、卓-艾综合征和其他高分泌性疾病[264]，其砜类化合物的形成完全通过CYP3A4催化的反应实现（图12中的11）[262]。泮托拉唑主要用于短期治疗胃食管反流病引起的食管糜烂和溃疡[265‒266]，同样通过CYP3A4催化的S-氧化反应代谢产生砜类化合物（图12中的9）。尽管泮托拉唑的药物相互作用风险相对较低，但它可能影响其他依赖胃酸水平的药物（如酮康唑或地高辛）的吸收[267]。雷贝拉唑用于治疗消化性溃疡和胃食管反流病，也是根除幽门螺杆菌方案中的有效成分[268]。体外研究表明，雷贝拉唑的代谢主要由肝脏中的CYP3A4介导，产生砜类代谢物。然而，与其他PPIs不同，该药物还会发生非酶促还原反应生成雷贝拉唑硫醚，这两种代谢物均可在人血浆中检测到[269‒270]。

通过对S-氧化底物的分析，我们发现CYP3A4在S-氧化过程中参与度最高，占病例总数的57%。这表明CYP3A4对含硫底物具有强烈的亲和力和显著的代谢活性。S-氧化主要发生在小至中分子量（200~400 Da）的化合物中，这类分子构成了底物库的主体。因此，在药物研发过程中，必须充分考虑CYP3A4代谢可能引发的代谢不稳定性，并评估S-氧化代谢与该分子量范围内含硫化合物结构特征之间的重叠性。相比之下，分子量为400~500 Da的底物（占病例的17%）仍易发生S-氧化，而CYP3A4作为主要代谢酶仍保持主导地位。

总体而言，经历S-氧化的底物主要包括含硫杂环的吩噻嗪衍生物。这些物质可被CYP2D6、CYP3A4和CYP1A1高效代谢，通过S-氧化生成亚砜及后续的砜类化合物。对于五元硫杂环化合物（如噻吩衍生物），CYP3A4主要催化其发生S-氧化生成砜类。此外，中空腔酶（包括CYP2D6、CYP2C9和CYP2C19）也参与该代谢过程。相比之下，七元硫杂环化合物作为S-氧化底物较为罕见。在硫醚和亚砜底物中，硫醚主要由CYP3A4代谢；亚砜则主要由CYP3A4代谢，同时中空腔酶（CYP2D6、CYP2C9和CYP2C19）也参与代谢。底物分子量与CYP亚型参与S-氧化的关系总结于图13。

我们还发现了一个特殊案例——硫丹（Endosulfan），其作为高分子量砜类底物，主要通过CYP2B6酶代谢。这可能归因于该分子的结构灵活性，其能够通过构象适应进入CYP2B6酶的受限活性位点。CYP2B6活性位点中的特定氨基酸残基（如Glu301和Thr302）可能与硫丹产生有效相互作用，从而促进催化反应。CYP2B6对硫丹表现出相对较高的固有清除率，这代表了CYP2B6介导的高分子量底物代谢的独特范例[271]。总之，与羟基化和N-氧化相比，S-氧化表现出独特的特征，值得进一步研究。

6 结论与展望

本文总结了139种含氮和含硫底物在三种反应类型（N-脱烷基化、N-氧化和S-氧化）中CYP介导的代谢特征。分析表明，与羟基化和O-脱烷基化反应相比，这些反应的底物特异性更为复杂。CYP亚型与底物的交叉反应性增强，不同结构类型间代谢模式的异质性也有所扩大。虽然分子量大于500 Da或小于200 Da的底物在代谢上与羟基化和O-脱烷基化底物相似，但在200~400 Da范围内，酶腔大小已不再是底物特异性的唯一决定因素，甚至可能完全不是关键因素。相反，底物的化学结构和官能团占据了更为重要的地位。

在N-脱烷基化过程中，不同的CYP亚型表现出显著的代谢特异性和多样性。CYP3A4主要代谢大分子量和中分子量的底物，包括含氮杂环结构（如哌嗪、哌啶、苯二氮䓬、环己胺和桥联双环含氮杂环）以及叔胺结构（如N-二甲基、N-单甲基、N-乙基、正丙基、异丙基、烯丙基和苄基）。CYP2D6主要代谢脂肪胺仲胺（如N-单甲基）和叔胺（如N-二甲基），同时也参与环己胺结构的代谢。脂肪胺仲胺（如N-单甲基）、叔胺（如N-二甲基）和苯二氮䓬类化合物均由CYP2C9和CYP2C19代谢。CYP1A2主要代谢嘌呤结构，同时也参与叔胺（如N-二甲基）的代谢。CYP2B6主要代谢脂肪胺仲胺（如N-单甲基）。CYP2C8代谢大分子叔胺（如N-乙基、正丙基、异丙基、烯丙基和苄基）。这种系统分类明确了CYP亚型在N-脱烷基化中的偏好性和功能范围，为理解P450s的底物特异性提供了关键见解。

在N-氧化和S-氧化过程中，不同的CYP亚型表现出显著的特异性和多样性。CYP3A4在N-氧化过程中分解哌嗪和叔胺化合物，而CYP1A2则分解伯胺、仲胺、吡咯、哌嗪和叔胺。CYP1A1、CYP2D6和CYP2C9共同作用于伯胺、仲胺，而CYP2A6仅氧化吡咯。对于S-氧化，CYP3A4代谢含有五元S杂环结构（如噻吩）和硫醚结构的底物，这些结构参与吩噻嗪结构的S-氧化。CYP2D6代谢吩噻嗪、亚砜和硫醚；CYP2C9和CYP2C19参与硫醚和亚砜结构的S-氧化。CYP1A1代谢含有吩噻嗪结构的底物。这一分类阐明了亚型特异性的代谢偏好和在N-/S-氧化中的功能，为P450s底物特异性提供了有价值的见解。

综上所述，我们的系统性研究证明对于中等分子量（200~400 Da）的化合物，化学结构（包括杂原子类型、官能团取向和电子密度分布）而非活性位点尺寸才是决定底物特异性的主要因素，这与主流的空腔中心范式形成鲜明对比。虽然CYP3A4通过其宽大的空腔结构能广泛代谢大分子底物（> 500 Da），但在中等分子量底物中的作用则退居次要地位，其关键在于结构识别模式。值得注意的是，不同的结构特征（N-脱烷基化中的哌嗪环、氧化反应中的叔胺几何构型，以及S-氧化反应中的噻吩平面性）比分子大小更能决定亚型选择性。与被动空腔适应机制不同，本研究提出了一种精炼的框架：协同作用的电子性质与活性位点可塑性相互作用共同决定底物-酶互补性。这些发现为整合拓扑学和电子参数的预测模型提供了理论基础，推动了药物设计和代谢稳定性优化的精准化进程。本研究为理解P450s催化机制提供了更清晰的逻辑框架，同时为优化现有P450s催化模式、开发代谢反应表型分析的分子工具以及提升新药代谢稳定性提供了重要指导。

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