电离辐射体外快速灭活SARS-CoV-2及其变异株——新的灭活模式与机制探究

王伟 ,  张筱荻 ,  俞嘉赓 ,  翁天豪 ,  余志扬 ,  吴志刚 ,  史丹蓉 ,  张素芬 ,  卢翔云 ,  Osama Alam ,  沈大航 ,  鲍茜 ,  叶庆富 ,  李兰娟 ,  姚航平

工程（英文） ›› 2025, Vol. 54 ›› Issue (11) : 219 -232.

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工程（英文） ›› 2025, Vol. 54 ›› Issue (11) : 219 -232. DOI: 10.1016/j.eng.2025.09.009
Research

电离辐射体外快速灭活SARS-CoV-2及其变异株——新的灭活模式与机制探究

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Rapid In-Vitro Inactivation of Various SARS-CoV-2 Strains Using Ionizing Radiation: New Inactivation Patterns and Mechanistic Insights

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摘要

电离辐射在病毒灭活领域展现出至关重要的应用价值，然而，其针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）的灭活效果及内在机制仍不明确。本研究选取了包含野生型及其变异亚型在内的共计20株病毒作为研究对象，深入分析SARS-CoV-2不同亚型对射线的敏感性及辐射诱导的生物学变化。结果显示，仅需1.2 kGy的电子束或0.9 kGy的X射线辐照，便能灭活99.99%的SARS-CoV-2颗粒。值得注意的是，Delta和Omicron变异株对辐射的敏感性显著高于野生型，在1.0 kGy和0.8 kGy的辐照剂量下即可达到99.99%的灭活率。此外，病毒载量的对数下降与辐射剂量之间遵循窄窗口剂量-效应模型。本研究首次发现辐射灭活新冠病毒的主要机制在于刺突（S）蛋白结构的破坏（触发其从融合前构象向融合后构象转变），而非普遍认为的核酸断裂效应（核酸完整性未受显著影响）。基于上述研究成果，本研究创新性地提出了以冠状病毒关键蛋白为靶点的灭活新策略，为传染性冠状病毒疾病的防控以及疫苗研发提供了全新的思路和方向。

Abstract

Ionizing radiation presents an important solution for virus inactivation. However, its efficacy for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) inactivation and the underlying mechanisms remain unclear. This study demonstrates radiosensitivity and radiation-induced biological changes in SARS-CoV-2 using 20 wild-type and mutant strains. The results show that 1.2 kGy of electron beam (E-beam) or 0.9 kGy of X-ray irradiation can eliminate 99.99% of SARS-CoV-2 particles. The Delta and various Omicron variants exhibit heightened sensitivity to radiation compared to the wild-type, showing nearly 99.99 % inactivation efficiency at 1.0 and 0.8 kGy. The relationship between irradiation dose and the logarithmic reduction in virus load adheres to a dose–response model, characterized by extremely narrow windows. Spike (S) protein disruption, rather than the commonly accepted nucleic acid cleavage, is identified as the primary inactivation mechanism (triggering a conformation transition of S protein from pre-fusion to post-fusion with minimal impact on nucleic acid integrity). This study introduces the concept of targeting critical proteins in coronavirus inactivation, offering valuable insight for infectious coronavirus disease control and vaccine development.

Graphical abstract

关键词

SARS-CoV-2 / 电离辐射 / 病毒灭活 / 分子机制 / 刺突蛋白

Key words

SARS-CoV-2 / Ionizing irradiation / Virus inactivation / Molecular mechanism / Spike (S) protein

引用本文

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王伟,张筱荻,俞嘉赓,翁天豪,余志扬,吴志刚,史丹蓉,张素芬,卢翔云,Osama Alam,沈大航,鲍茜,叶庆富,李兰娟,姚航平. 电离辐射体外快速灭活SARS-CoV-2及其变异株——新的灭活模式与机制探究[J]. 工程（英文）, 2025, 54(11): 219-232 DOI:10.1016/j.eng.2025.09.009

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1 引言

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）所致，至今仍在严重威胁着全球健康与经济发展。该病毒主要通过飞沫和气溶胶在人际间传播，同时也可经由接触受污染的物体表面发生间接传播[1‒4]。为应对这场全球性危机，各国普遍采取了特异性和非特异性相结合的综合防控措施[5]。特异性干预主要包括抗病毒药物的使用和以疫苗接种为主的主动免疫策略。非特异性预防则侧重于个人防护设备的使用和环境消毒。这些策略相互补充，共同构成了疫情防线。然而，由于SARS-CoV-2在持续发生变异，不断出现关切变异株（VOCs），使得疫情形势变得更加复杂和难以预测。近期研究显示，不断突变的变异株已具备逃避针对原始SARS-CoV-2免疫反应的能力[6]，并可能导致疲劳、呼吸困难和认知障碍等常见症状[7‒8]。这种持续演变的态势引发了人们对免疫逃逸能力更强变异株的担忧，也凸显了全球范围内迫切需要有效阻断SARS-CoV-2传播途径的策略[9]。因此，开发能够有效灭活病毒、阻断传播途径的方法，对于控制疫情蔓延和减轻感染至关重要。

SARS-CoV-2基因组由单链RNA构成，编码4种关键结构蛋白：刺突（S）蛋白、包膜（E）蛋白、膜（M）蛋白和核衣壳（N）蛋白。其中，S蛋白在病毒入侵宿主细胞的过程中发挥至关重要的作用[10‒11]。病毒利用宿主细胞的代谢机制合成自身蛋白并进行复制[12]。因此，破坏这些蛋白或损伤病毒基因组被认为是有效灭活病毒的手段，从而阻止其在宿主细胞内复制或感染[13]。目前常用的病毒灭活方法包括加热、化学消毒和紫外线（UV）照射等[14]。传统的热力灭菌能有效破坏病毒基因组，但可能对某些敏感材料和设备造成损害，这限制了其在特定场景下的应用[15‒16]。虽然乙醇、次氯酸钠和β-丙内酯等化学消毒剂对SARS-CoV-2具有较高的灭活效率，但存在化学物质残留的问题[17‒18]。紫外线辐射能够损伤病毒RNA，从而阻碍其转录和复制，但由于穿透力有限，主要用于表面消毒[19‒20]。臭氧消毒对SARS-CoV-2有效，但存在腐蚀风险[21]。此外，研究表明冠状病毒在低温下具有较强的生存能力，甚至在-60 ℃的条件下储存数年仍能保持大部分感染性[22‒24]。SARS-CoV-2在4 ℃下14天内感染性仍非常稳定[25]。因此，亟须开发一种在低温条件下快速、高效且环保的SARS-CoV-2灭活方法，以降低病毒传播的风险。

电离辐射技术目前已在多个领域得到广泛应用，包括病毒灭活、疫苗生产[26]、食品加工[27‒28]、实验室医疗设备消毒、新型材料制备[29]以及药品/药物的灭菌[30]。辐照灭活作为一种高效、无创且低成本的方法，无需使用任何消耗品，且通过采用经过验证的成熟技术，可以确保人员和环境的安全[31]。电离辐射[包括伽马射线、电子束（E-beam）和X射线]指能够从原子中移除电子，从而导致电离现象发生的能量[26]。传统的伽马射线是一种由放射性同位素发射的光子形成的电磁辐射。然而，由于其对安全防护的严格要求、高昂的使用成本以及放射性废物的处置问题，使得这种传统技术在商业应用上难以持续。近年来，基于加速器的电子束和X射线辐照技术逐渐兴起。这些新型技术不仅不会产生放射性废物，而且可以在不使用时随时关闭，兼具高效和环保的优点。研究证实，电离辐射能够有效地灭活存在于不同介质中的病毒，如污水污泥中的肠道病毒与轮状病毒、新鲜农产品中的诺如病毒、水中的腺病毒以及家禽中的禽流感病毒[16,32‒35]。此外，辐照可以完全灭活拉沙病毒（12 kGy）、马尔堡病毒（10 kGy）和埃博拉病毒（8 kGy），组织培养半数感染剂量（TCID50）中值为106.5 mL-1；类似地，10 kGy的辐照剂量能够在体外条件下完全灭活SARS-CoV-2 [36‒38]。

由于SARS-CoV-2活病毒的研究受到生物安全三级（BSL-3）实验室条件的限制，目前大多数灭活研究采用的是假病毒[15,39‒41]。例如，据报道，两种SARS-CoV-2假病毒，即猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒，在4 kGy的电子束照射下可以被完全灭活[39]。同样，3 kGy的剂量也可以完全灭活人类冠状病毒OC43（HCoV-OC43）[40]。一些研究表明，2 kGy的电子束照射可以将SARS-CoV-2灭活至检测不到的水平[40,42]，而伽马射线照射需要达10 kGy才能完全灭活该病毒[38]。尽管电离辐射在灭活SARS-CoV-2方面的潜力已经广为人知，但其辐射敏感性及相应的灭活机制仍不明确。

本研究选用了11种野生型（WT）毒株和9种变异株，深入探讨了SARS-CoV-2在电子束和X射线照射下的辐射敏感性及辐射灭活机制。本研究评估了不同辐射类型、剂量和剂量率对病毒灭活效果的影响，并分析了辐照剂量与SARS-CoV-2灭活效应之间的关系，发现这种关系符合具有特殊“窄窗口”辐照的剂量-效应曲线。通过细胞感染实验和免疫荧光分析（IFA），本研究还验证了辐照对病毒感染性和复制能力的影响。此外，结合冷冻电子显微镜（cryo-EM）、定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和核酸电泳技术，本研究还从蛋白质和RNA水平研究了辐照诱导SARS-CoV-2灭活的机制。这些发现为深入理解电离辐射的辐射生物学效应提供了新的视角，并有助于推动疫苗开发和快速工业灭菌实践的发展。

2 材料和方法

2.1 细胞培养

用于病毒扩增的非洲绿猴肾细胞（Vero细胞；ATCC CCL-81，美国）和人肝癌Huh-7细胞（JCRB0403，日本研究生物资源库）均在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。Vero细胞使用含10%胎牛血清（FBS; Gibco BRL）的MEM培养基（Gibco BRL，美国）培养。病毒分离实验中，Vero细胞以1 × 105 个∙mL-1的密度接种于T25培养瓶，待细胞密度达到80%~90%时进行实验。Huh-7细胞使用含10% FBS的杜氏改良MEM培养基（DMEM; Gibco BRL）培养，培养条件与Vero细胞一致。

2.2 样本收集与病毒分离

病毒分离流程参照既往文献[11]所述方法。研究样本主要来源于浙江大学医学院附属第一医院。为保证实验质量，样本采集后4 h内即被送至经中国合格评定国家认可委员会（CNAS No. BL0022）认证的BSL-3实验室进行病毒分离操作。

样本经预处理后，接种至Vero细胞进行培养，每日于35 ℃下观察细胞病变效应（CPEs），并采用qRT-PCR方法检测细胞培养上清液中病毒含量。当阈值循环（Ct）值小于或等于20（通常在4~5天后出现）时，通过离心富集活病毒颗粒。将病毒储存液以0.2 mL∙管-1分装至冻存管中，储存于-80 ℃超低温冰箱以供后续实验研究使用。

采用全基因测序确定病毒亚型。选择了以下原始毒株用于研究：11株WT毒株（按数字顺序命名，hCoV-19/Hangzhou/ZJU-01/2020~hCoV-19/Hangzhou/ZJU-11/2020）；Delta（hCoV-19/Hangzhou/ZJU-12/2021）；Omicron BA.5.2（hCoV-19/Zhejiang/ZJU-20/2023）、Omicron BF.7（hCoV-19/Zhejiang/ZJU-22/2022）、Omicron XBB.1.9.1（SKLID_ZJU-35_hCoV-19/2023）、Omicron XBB.1.16（SKLID_ZJU-30_hCoV-19/2023）；Omicron EG.5.1（SKLID_ZJU-S148_

hCoV-19/2023）；Omicron HK.13（SKLID_ZJU-167_hCoV-19/

2024）；Omicron JN.1（SKLID_ZJU-169_hCoV-19/2024）和Omicron JN.1.16（SKLID_ZJU-187_hCoV-19/2024）变异株。这些毒株的信息可从全球流感数据共享倡议（GISAID）或国家生物信息中心（CNCB）数据库平台获得。

病毒在T75培养瓶的Vero细胞中扩增。感染4天后，4000g离心30 min收集上清，辐照后用3%多聚甲醛（PFA）于4 ℃灭活48 h。上清液于4 ℃储存。所有传染性病毒实验均在BSL-3实验室进行。

将病毒样品用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至TCID50为1 × 105 mL-1，然后将适宜体积的病毒样品转移到2 mL冷冻管并固定在生物安全样品袋中，后送至浙江大学核农学研究所进行电子束或X射线辐照。在运输至辐照设施期间，使用干冰或碎冰以维持所需的温度。所有样品均在-20 ℃条件下进行辐照。

2.3 电子束和X射线辐照

电子束辐照使用10 MeV电子加速器（CIAE-DZ-10/20；中国原子能科学研究院）进行。X射线辐照在XL1606HD X-LAB辐照系统（同方威视技术股份有限公司，北京）上进行，该系统具有高达160 KeV和20 kW功率的可调宽带。目标电离辐射剂量通过改变输送机速度和聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）的能量屏障来实现。使用重铬酸钾剂量计进行吸收辐射剂量测定。

2.4 辐照后病毒感染分析

辐照后，病毒返回BSL-3实验室，将100 μL的辐照后病毒溶液接种到适当密度的Vero细胞中，同时建立了相应的阳性对照和细胞对照。处理2 h后，细胞用PBS洗涤3次，并加入2 mL MEM培养基继续培养3天。然后观察细胞病变效应，阳性对照中大多数细胞（> 50%）表现出各种病理效应，如细胞圆化、肿胀和脱落。随后对细胞上清液进行一系列分析，包括qRT-PCR和免疫荧光。

2.5 使用qRT-PCR测定病毒载量

通过用10倍稀释的辐照后病毒溶液接种Vero细胞来测定其感染性。将感染的细胞孵育2 h以保证病毒的充分结合，然后进行洗涤。此后，通过使用市售的SARS-CoV-2 qRT-PCR试剂盒（上海之江生物科技股份有限公司），根据制造商的说明计算Ct值以量化病毒拷贝数，较低的值表示较高的病毒拷贝数。由于细胞死亡会释放病毒颗粒，因此细胞上清液也包括在测定中。所有qRT-PCR靶向基因在所有实验中都高度一致（R2 > 0.99, P < 0.001）。因此，选择开放阅读框1ab基因（ORF1ab）用于后续分析。由于在阴性对照中未检测到显著信号，因此在当前测定条件下，Ct值40被指定为检测限。对于所有感染实验，病毒储存液调整为相同的感染复数（MOI = 0.5），并且每次解冻病毒储存液进行实验时都测量Ct值。

2.6 免疫荧光染色

将状态良好密度适宜的细胞使用80%丙酮在-20 ℃下固定并在4 ℃下孵育20 min。随后，使用冷PBS洗涤3次，并用1%牛血清白蛋白（BSA）封闭30 min。随后，细胞在4 ℃下与用PBS（含0.1% BSA）稀释（1∶1000）的兔单克隆抗-SARS-CoV-2刺突受体结合域（RBD）抗体（北京义翘神州科技股份有限公司）孵育过夜。孵育后，细胞用冷PBS洗涤3次，并用Alexa Fluor488®标记的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（Invitrogen，美国）[用PBS（含0.1% BSA）以1∶1500稀释]进行1 h室温避光染色。随后，将细胞洗涤3次，用0.5 μg∙mL-1 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）处理5 min以进行核DNA染色（北京索莱宝科技有限公司），最后再洗涤1次。使用Bio-Rad ZOE细胞成像仪（美国）的荧光模块捕获免疫荧光图像。

经0 kGy、0.8 kGy或2.0 kGy辐照的SARS-CoV-2样品被加入Huh-7细胞并在37 ℃培养48 h，以评估病毒介导的膜融合。

2.7 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测

将总病毒蛋白样品稀释至250 ng∙mL-1。ELISA板在4 ℃下每孔用100 μL病毒样品（25 ng∙孔-1）包被过夜。在PBS中洗涤后，用3% BSA室温下封闭板2 h。洗涤后，将板与SARS-CoV-2刺突S1兔单克隆抗体（mAb；货号为40150-R007）或SARS-CoV-2刺突S2兔多克隆抗体（pAb；货号为40590-T62）孵育。孵育2 h后，洗板3次，并添加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗。孵育1 h后，洗板3次，并添加3,3′,5,5′-四甲基联苯胺底物。10 min后用2 mol∙L-1硫酸终止反应。使用酶标仪在450 nm的光密度（OD450）处读板。

2.8 系统发育树分析

本研究共获得1057条SARS-CoV-2基因组序列，其中1048条从GISAID（2024年4月30日访问）和CNCB（2024年4月30日访问）数据库下载。所有序列的多重序列对齐使用分子进化遗传学分析版本11（MEGA 11）进行[43]。序列属于11株野生型毒株、9个突变毒株、999株重庆YC01病毒毒株、19株云南RaTG13病毒毒株和19株广东穿山甲病毒毒株。对于系统发育树，使用邻接对齐方法进行1000次自助检验的最大似然分析以获得可靠性。使用生命交互树用于可视化[44]。对不同分支和边界颜色的分析表明它们拥有共同的祖先。

2.9 冷冻电子断层扫描和电子显微镜

取100 mL病毒培养上清液用3%甲醛在4 ℃下处理48 h，暴露于0.8 kGy、2 kGy、3 kGy和8 kGy的辐照后，4 ℃下保存。所有涉及感染性病毒的实验均在BSL-3实验室中进行。灭活病毒的纯化、浓缩、生化分析和样品制备在BSL-2实验室中进行。固定的病毒颗粒在30%蔗糖垫上以100 000g、4 ℃离心3 h。病毒沉淀重新悬浮于60 μL N-（2-羟基乙基）-哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）盐缓冲液（10 mmol∙L-1 HEPES、pH = 7.3、150 mmol∙L-1 NaCl）。重新悬浮的病毒样品（7 μL）涂布在具有疏水碳支持的铜网格上，并浸入500 μL HEPES盐缓冲液1 s以除去蔗糖。随后，加入金标准珠（3 μL），然后将网格轻弹4.5 s。最后，使用冷冻柱在液态乙烷中实现快速玻璃化，并使用Talos F200C电子显微镜（Thermo Fisher Scientific，美国）在200 kV下进行成像。

2.10 辐照后病毒RNA完整性分析

使用病毒RNA试剂盒（Roche，德国）根据制造商的说明书从辐照和未辐照样品中提取高纯度病毒RNA。使用Qsep100片段分析仪（江苏光鼎生物科技股份有限公司）和NR1芯片（高灵敏度）评估RNA质量。简而言之，借助分析系统和NR1芯片，通过毛细管电泳分离RNA样品。荧光检测后，该软件生成电泳图像，从而可以分析辐照后样品中核酸的完整性。

2.11 统计分析

所有感染实验均独立进行3次。使用Microsoft Excel和GraphPad Prism软件进行数据分析。使用t检验分析收集的数据，P小于0.05被认为具有显著性差异。使用GraphPad Prism四参数非线性回归和相关分析工具计算R2值和P值，以建立Ct值与病毒载量之间的关系。

3 实验结果

3.1 利用qRT-PCR和感染性分析评估辐照对SARS-CoV-2的灭活情况

世界卫生组织（WHO）批准将SARS-CoV-2特异性qRT-PCR分析作为诊断COVID-19的最优方法并可用于病毒载量定量。鉴于该方法在检测活病毒和灭活病毒时效率近乎相同，因此在辐照后进行qRT-PCR检测以确定病毒的灭活率。随后，建立了辐照剂量与病毒拷贝数对数下降之间的动态关系：log10(Ni/N0)，其中N0代表辐照前的病毒拷贝数，Ni代表辐照后的病毒拷贝数。附录A中的图S1展示了在1~10 kGy的宽剂量范围内，SARS-CoV-2的辐照灭活效率。辐照1 kGy剂量使病毒拷贝数减少了约1.93个对数级（相当于98.82%的灭活率），而在2 kGy时，这一减少幅度提高到4个对数级（99.99%的灭活率）。

本研究进一步采用细胞感染和IFA评估了SARS-CoV-2的感染性。图1（a）和附录A中的图S2显示，未接受辐照的SARS-CoV-2细胞培养样品中出现了明显的CPE。刺突蛋白被绿色荧光蛋白（GFP）标记，显示分离出的SARS-CoV-2病毒颗粒紧密聚集在Vero细胞的内部。在1 kGy辐照后，仍可见细胞周围有少量病毒，这表明在此剂量下SARS-CoV-2未被完全灭活。相比之下，在接受超过2 kGy的辐照后，细胞未显示荧光信号，且呈现出正常的形态，与正常细胞对照形态相近。

随后，本文选择了11株具有不同遗传和生物学特性的野生型毒株（ZJU-01~11）在2 kGy 的辐照剂量下进一步测试其灭活情况（附录A表S1）。如图1（b）所示，这11株病毒分离株分布在已建立的SARS-CoV-2系统发育树的主要分支4、5、8和9上，每个分支用不同颜色的色块标记，代表不同的祖先谱系。因此，这一选择涵盖了广泛且具有深度的特征范围。结果显示，低剂量（2 kGy）的电离辐射能够以近99.99%的效率显著灭活这11株野生型毒株，阻碍了它们感染Vero细胞的能力（附录A表S1）。

3.2 SARS-CoV-2 的辐照敏感性

尽管已经确定2 kGy的辐照可以灭活SARS-CoV-2，但确定低剂量辐照敏感性以及评估处理方法将微生物种群减少90%的能力（D10值）至关重要。因此，使用PMMA阻挡辐照能量，以实现对10 MeV高能电子加速器的精确剂量控制，剂量率为9.5 kGy∙s-1。借此明确PMMA厚度与剂量吸收之间的相关性（附录A图S3），进而实现1~2 kGy之间的精确剂量控制。应用精细校准的0~3 kGy辐照剂量，并使用qRT-PCR定量病毒载量。使用Ct值确定辐照剂量与病毒拷贝数对数下降log10(Ni/N0)之间的相关性。该关系符合使用GraphPad Prism软件生成的四参数非线性回归模型的剂量-效应曲线（图2），拟合精度为R2 = 0.99（表1）。

上述分析揭示了辐照对SARS-CoV-2的确定性效应，阈值剂量为891 Gy。当辐射剂量达到阈值后，log10(Ni/N0)值出现显著下降趋势。这表明病毒被快速有效灭活，正如“窄”剂量窗口所示[图2（a）]。当剂量达1192 Gy时病毒灭活率达到99.99%。D10值代表90%的SARS-CoV-2被灭活，被确定为979 Gy。本实验中的D10值从冷冻样品获得，这通常代表最差情况，因为冷冻样品通常比室温样品需要更高的辐射剂量。

感染不同辐照剂量处理后病毒的Vero细胞产生了不同的病变效应[图3（a）]。SARS-CoV-2随着辐照剂量增加而逐渐被灭活，提供了与感染力相关的剂量-效应关系数据。在0.5 kGy和0.8 kGy辐照下观察到显著的细胞病变效应，此时未达到灭活阈值；将剂量增加到1.0 kGy，显示出病毒未完全灭活和轻微的细胞病变，此时处于剂量-效应曲线的线性反应区；一旦剂量达到1.2 kGy，灭活率达到99.99%，从而保护Vero细胞免受侵染，同时，免疫荧光亦未检测到GFP标记的SARS-CoV-2。

3.3 物理因素对辐照灭活 SARS-CoV-2 的影响

与前文中描述的电子束辐照灭活曲线类似，病毒载量与X射线剂量之间的关系也符合剂量-效应关系（表1）。X射线辐照对SARS-CoV-2存在确定性效应，阈值为768 Gy，D10值为861 Gy [图2（b）]。灭活99.99%的病毒最小剂量为925 Gy，这低于电子束辐照所需的剂量。以2.44 kGy·s-1、4.50 kGy·s-1和9.58 kGy·s-1的剂量率对SARS-CoV-2 进行辐照，当总吸收剂量为2 kGy时，所有样品均实现了99.99%的灭活率（附录A表S2）。不同剂量率的剂量-效应曲线呈现出相同的趋势（附录A图S4）。

此外，将病毒样本加载到2 cm或4 cm厚的预冷冻冰板上，以评估在冷冻条件下辐照的灭活效果。每个样本在2 kGy剂量下接受辐照，结果显示该剂量成功灭活在2 cm和4 cm冰覆盖下的活病毒，且效率超过99.99%（附录A表S3）。免疫荧光结果显示，辐照后的病毒失去感染能力[图3（b）]。因此，辐照对SARS-CoV-2的灭活效率主要取决于特定剂量阈值的达到，而不是辐照过程中的物理因素。

3.4 VOC辐照敏感性研究

随着SARS-CoV-2的持续传播，出现了一系列VOC，其感染性、免疫原性和致病性均发生一定改变。尽管如此，包括高致病性Delta变异株和主要流行株Omicron在内的VOC辐照敏感性尚未确证。在此，本文选择了WT（ZJU-05）、Delta（ZJU-12）、Omicron BA.5.2（ZJU-20）、Omicron BF.7（ZJU-22）、Omicron XBB.1.9.1（ZJU-35）、Omicron XBB.1.16（ZJU-30）、Omicron EG.5.1（ZJU-148）、Omicron HK.13（ZJU-167）、Omicron JN.1（ZJU-169）和Omicron JN.1.16（ZJU-187）毒株来探索辐照敏感性的变化（详见附录A表S4）。这些病毒株分布于系统发育树上的1、4、5、6和9分支，因此确保了变异株选择范围涵盖足够广[图1（b）]。结果显示所有毒株的辐照与灭活之间的相关性符合单一的剂量-效应曲线，其具体参数列于表2。

另一方面，实验结果显示出变异株比原始株具有更高的敏感性[图4（a）]。基于已建立的剂量-效应曲线，Delta变异株的D10值确定为0.79 kGy。Delta在0.2 kGy、0.5 kGy和0.8 kGy下表现出辐射抗性。当辐照剂量增加到1.0 kGy时，病毒载量下降3.55个对数级（99.95%灭活率），接近下渐近线。IFA [图4（b）]和细胞感染实验[图4（c）]证实Delta变异株在经历1.0 kGy以上剂量辐照后失去感染能力。

Omicron变异株在接受0.5~0.8 kGy的辐照剂量后被完全灭活。在未辐照和0.2 kGy辐照样本感染的细胞中可以观察到明显细胞病变和荧光标记[图4（b）、（c）]。在接受0.5 kGy辐照后，Omicron BF.7、Omicron EG.5.1和Omicron JN.1.16毒株的灭活率超过99.9% [图4（a）]，并且免疫荧光图像和细胞感染实验也证实了其失去感染性。从剂量-效应曲线获得的Omicron BF.7、Omicron EG.5.1 和Omicron JN.1.16的D10值分别为0.22 kGy、0.28 kGy和0.14 kGy（表2）。完全灭活Omicron BA.5.2、Omicron XBB.1.9.1、Omicron XBB.1.16、Omicron HK.13和Omicron JN.1毒株需要约0.8 kGy的较高剂量。本研究还确定了这些变异株的D10值，分别为0.62 kGy（Omicron BA.5.2）、0.63 kGy（Omicron XBB.1.9.1）、0.53 kGy（Omicron XBB.1.16）、0.64 kGy（Omicron HK.13）、0.42 kGy（Omicron JN.1）（表2）。总体而言，当辐照剂量达到0.8 kGy时，所有Omicron变异株的灭活率可达到99.99%[图4（a）]且病毒失去感染能力[图4（b）、（c）]。

3.5 辐照对SARS-CoV-2病毒颗粒的形态改变

本研究使用Cryo-EM研究了不同辐照剂量对SARS-CoV-2结构的影响。病毒在BSL-3实验室内的Vero细胞中繁殖，并以0.8 kGy、2 kGy、3 kGy和8 kGy的辐照剂量处理。如图5（a）所示，冠状病毒的外层由S蛋白组成，这赋予其独特的冠状外观。在0.8 kGy的电子束剂量辐照下，病毒粒子的结构似乎未受影响，并且仍能诱发细胞病变[图2（a）]。然而，当剂量增加到2~3 kGy 时，S蛋白发生了显著的形态变化，从冠状转变为针状。S蛋白单体由S1和S2亚基组成[图5（b）]，辐照导致S1解离，从而丧失感染性。在8 kGy辐照下，S蛋白表现出更显著的形态学变化，特别是其融合后状态。

如图5（c）所示，使用ELISA特异性检测在0 kGy、0.8 kGy和2.0 kGy辐照剂量下病毒样本中的S1和S2水平。结果表明相比未辐照对照组，2.0 kGy辐照样品显示出S1蛋白显著下降或不存在，而S2蛋白水平保持不变。这些发现表明辐照诱导S1亚基的解离，从而抑制病毒与宿主细胞血管紧张素转换酶2（ACE2）受体的结合。

免疫荧光染色结果表明，经2.0 kGy辐照的病毒无法在人肝癌（Huh-7）细胞中诱导膜融合，而未辐照和经0.8 kGy辐照的病毒仍可以有效地感染Huh-7细胞，导致显著的膜融合和多核巨细胞形成[图5（d）]。这些结果证实，辐照触发了S蛋白从预融合状态向融合后状态的结构转变，从而阻止了病毒的吸附和感染，进而抑制了细胞膜融合。

实验还选择了Delta和Omicron XBB.1.1.6进行2 kGy辐照后的冷冻电镜分析。研究结果显示，所有毒株均从预融合构象转变为融合后构象[图5（e）]。总之，辐照后破坏了原始株和突变株中病毒的S蛋白结构从而使其失去感染性，可能是该途径灭活病毒的潜在机制。

3.6 辐照后病毒RNA完整性分析

本研究使用qRT-PCR对WT（ZJU-01~ZJU-11）和代表VOC（Delta和Omicron）的辐照和未辐照悬浮液中的N基因和ORF1ab基因的病毒载量进行了量化。如图6（a）所示，辐照后立即进行的核酸分析表明ORF1ab或N基因的Ct值在WT和VOC之间无显著差异（P > 0.05），表明推荐的2 kGy辐照剂量对不同毒株的核酸水平无显著影响（P > 0.05）。早期分析发现1.2 kGy以上的辐照可有效地灭活病毒至检测不到的水平；然而如图6（b）所示，与未辐照对照相比，这些病毒基因在0~3 kGy辐照剂量范围内的Ct值仅显示出微小的变化。这表明在经辐照灭活的病毒中RNA未受影响；辐照后核酸电泳图谱显示一致的单峰[图6（c）和（d）]，亦表明病毒RNA在0~3 kGy的辐照剂量范围内保持稳定，未发生明显片段化。

4 讨论

SARS-CoV-2变异株不断出现，其传播能力、致病性等特征增强，这促使人们开发新的防控策略[9]。尽管电离辐射被认为是一种潜在的SARS-CoV-2灭活手段，但精确灭活剂量以及病毒对辐射暴露的分子水平反应仍未得到充分表征[38,40,42,45]。由于SARS-CoV-2相关研究仍需要在高防护等级实验室中处理，这使得许多灭活研究采用替代毒株，而这可能无法准确反映真实病毒的辐射敏感性，本研究填补了这一研究空白。本研究对包括WT和VOC的不同来源病毒样本进行了检测，系统评估了以下内容：①利用细胞生物学方法研究辐照对病毒复制和感染性的影响；②辐照剂量与灭活效率之间的定量关系；③物理因素对辐照灭活效果的影响；④辐照对SARS-CoV-2刺突蛋白结构和RNA完整性的影响。本研究的几个关键发现，有助于深入理解病毒灭活的机制。

4.1 SARS-CoV-2独特的辐射生物学效应特征

虽然电离辐射被公认为是一种高效、无残留的灭活方法，对多种病原体有效[46]，但病毒通常表现出比其他微生物更强的辐射抗性，病毒类型间存在显著差异[36,47‒48]。国际原子能机构建议，在无法直接评估污染情况时，标准辐照剂量为25 kGy。以往研究表明，25 kGy的剂量可完全灭活羊水中的人类免疫缺陷病毒，20 kGy的剂量足以完全灭活埃博拉病毒和马尔堡病毒[36]。导致21世纪大流行的SARS-CoV-2和MERS-CoV冠状病毒所需的完全灭活剂量分别为10 kGy和20 kGy [49‒50]。

然而，本研究发现，仅1.2 kGy的电子束辐射就足以灭活SARS-CoV-2，这与其他采用10 kGy伽马辐射完全灭活SARS-CoV-2的研究结果不同[38,49]。这种差异可能归因于基于电子和基于光子的电离辐射在穿透性和能量特性上的不同。已有研究表明，电子束和钴-60伽马辐射在病毒灭活效果上存在差异[31,48]。此外，病毒辐射敏感性的变化也可能受实验条件、辐射后处理以及受试毒株特性的影响。尽管伽马辐射作为一种病毒灭活方法已使用数十年，但如今，由加速器驱动的电子束和X射线技术因其环境友好、安全且具有商业可行性而受到青睐[20,26,34]。具体而言，本研究中电子束辐射的应用，使我们确定了一个对SARS-CoV-2有效的新型辐照剂量窗口，剂量范围为891~1192 Gy。与Wang等[40]发现2 kGy的电子束可有效灭活SARS-CoV-2研究结果不同，本研究中观察到独特的窗口效应，这可归因于使用PMMA实现精确阻挡校准辐射剂量以及剂量-效应曲线的建立。此外，大多数关于电子束灭活SARS-CoV-2的研究主要依赖替代病毒，这些替代病毒完全灭活大约需要10 kGy的剂量[15,31,39]，这些替代病毒与真实毒株间的生物学差异亦可能导致了剂量差异。此前的一项研究还指出，温度是影响冠状病毒在外界环境中存活的关键因素，温度越低灭活效率越低[24]。在本研究中，所有灭活参数均在冷冻条件下获得。使用推荐的安全辐射剂量2 kGy，在4 cm厚的冰层下实现了SARS-CoV-2的完全灭活。在现实场景如冷链食品灭菌或医疗设备消毒时，低剂量策略可提高处理效率并降低成本。综上，这些发现对于理解SARS-CoV-2的辐射敏感性以及制定精确的灭活方案至关重要。

4.2 主要的辐照灭活机制

冷冻电镜分析显示，辐照前的病毒粒子结构完整，其S蛋白三聚体呈冠状[10]，通过与ACE2相互作用介导宿主细胞感染[51]。S蛋白由S1和S2亚基组成，是一种跨膜蛋白，其中S1含有RBD受体结合域，负责启动病毒进入靶细胞的过程；S2呈杆状，插入病毒包膜，介导膜融合过程[52]。此前的研究表明，靶向作用S蛋白可能有效抑制病毒传播[53‒54]。本研究观察到当辐照剂量超过2 kGy时，S1亚基发生解离，使S蛋白由典型的冠状变为针状的融合后构象[39]。S1亚基的丢失阻断了病毒与宿主受体的结合及膜融合过程，实现了病毒灭活。细胞感染与免疫荧光分析进一步证实，辐照超过2 kGy可以完全抑制病毒的感染与融合能力。这与SARS-CoV-2假病毒辐照实验得出的结论基本一致，表明破坏S蛋白可能是一种潜在的灭活机制[55]。一些研究人员使用蒙特卡洛模拟方法研究了辐照离子与SARS-CoV-2的相互作用，指出虽然包膜蛋白层和S蛋白吸收了大部分电子能量，但辐照也会影响病毒RNA [56‒57]。因此，本文也评估了低剂量辐照对病毒核酸的影响。辐照后分析结果显示，在3 kGy以下的剂量下，核酸含量没有显著变化。然而，在低于2 kGy的剂量下即可观察到完全灭活现象，这表明RNA降解并非主要的灭活途径。这一观察结果与Luo等[39]和Wang等[40]的qRT-PCR研究结果部分一致。此外，本研究首次展示的辐照后病毒RNA电泳结果也未观察到明显的RNA片段化。传统的病毒辐射灭活方法通常采用20 kGy以上的剂量，旨在破坏核酸。本研究提出了一种新方法，即靶向作用S蛋白，在显著降低辐照剂量（2 kGy）的情况下实现病毒灭活，而不影响病毒核酸，从而实现精确、快速的病毒灭活。

4.3 病毒变异株的辐照敏感性

本研究还发现，SARS-CoV-2变异株对电离辐照的敏感性更高。SARS-CoV-2是一种单链RNA病原体，突变率极高。在演变过程中，Delta和Omicron变异株一度成为主要流行株[58]。VOC的突变多集中在S蛋白，可显著影响病毒的感染力与免疫逃逸能力[9,59‒60]。基于本研究结果，破坏S蛋白被认为是一种潜在的病毒灭活机制，而S蛋白的突变可能影响病毒的辐射敏感性。此前的一项研究发现，S蛋白的突变可能影响其血清中和活性[61]。在本研究中，野生型毒株达到99.99%的辐射灭活率需要1.2 kGy的辐照，而Delta和Omicron变异株分别仅需1.0 kGy和0.8 kGy即可被灭活。这种敏感性的增强可能是由于突变株的S1和S2亚基中存在更多的裂解位点，从而使S蛋白更易被辐照破坏。由于VOC比WT毒株表达更多的S蛋白，这也可能提高其受辐射损伤的风险。此外，在疫苗研发方面，抗原表位的破坏会降低疫苗效力[62]。因此，以WT毒株为例，建议采用约1.2 kGy的辐射剂量，通过平衡病毒灭活和最小化S蛋白降解来优化免疫原性，而VOC可适当降低剂量以保持免疫原性。在工业消毒中，2 kGy安全剂量可在低温条件下完全灭活本研究测试的WT和VOC病毒，展示了电子束技术在广泛株系上的普适性和高效性。考虑到SARS-CoV-2可能长期与人类共存并呈季节性流行趋势[63‒66]，这一低剂量辐照策略在应对未来潜在流行病方面具有重要意义。

本研究提出了一个新的灭活概念：靶向作用SARS-CoV-2感染过程中的关键蛋白（S蛋白），可在低于2 kGy剂量下实现对WT与VOC的完全灭活。这一剂量显著低于传统核酸靶向辐照所需的10 kGy以上剂量，且在冷链及医疗器械低温灭菌中具有可行性与优势。同时，本方法避免了化学残留和二次环境污染，为低温条件下病毒的快速精确灭活提供了新思路。整体而言，本研究不仅丰富了我们对电离辐射生物效应的认知，也为冠状病毒的防控和疫苗开发提供了新的技术路径。

5 结论

本研究利用电离辐射对多种SARS-CoV-2毒株的体外辐射敏感性进行了定量表征，并确定了一种具有“窄窗口”有效剂量范围的独特灭活模式。研究结果表明，新兴的病毒变异株相对于野生型毒株表现出更高的辐射敏感性，这暗示了它们在结构上可能更易受到影响。本研究进一步阐明了辐照诱导病毒灭活的主要机制是对刺突蛋白的破坏，这一发现对于控制病毒传播和开发新型疫苗具有深远意义。虽然本方法的实际落地还需要进一步的生物学验证，但本研究提出的靶向关键蛋白的新概念，为设计新一代疫苗和抗病毒策略提供了重要指导。本发现为应对冠状病毒大流行开辟了创新途径，并凸显了电离辐射有潜力成为一种在公共卫生紧急情况下快速灭活病毒的有力工具。

本文中用于复现和评估研究结论所需的全部数据均收录于正文或附录A中。野生型毒株可在GISAID数据库中公开获取，其登录号如下：EPI_ISL_415709、EPI_ISL_416042、EPI_ISL_416044、EPI_ISL_416046、EPI_ISL_415711、EPI_ISL_416047、EPI_ISL_416425、EPI_ISL_416473、EPI_ISL_416474、EPI_ISL_418990以及EPI_ISL_418991。VOC毒株信息来源于CNCB，对应编号为EPI_ISL_

3127444、C_AA019048.1、C_AA019050.1、C_AA017852.1、C_AA017847.1、C_AA057219.1、C_AA068111.1、C_AA068109.1以及C_AA068618.1。

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