单核RNA测序揭示新生儿缺氧缺血性脑病的发生机制及丹酚酸C的神经保护作用

牟璇 ,  李璐 ,  刘新月 ,  张奥林 ,  何涛 ,  饶宝凤 ,  张佳添 ,  陈仁杰 ,  Malte Spielmann ,  黄志超 ,  丛斌 ,  范骁辉

工程（英文） ›› 2025, Vol. 55 ›› Issue (12) : 269 -290.

PDF (7090KB)
工程（英文） ›› 2025, Vol. 55 ›› Issue (12) : 269 -290. DOI: 10.1016/j.eng.2025.09.010
研究论文

单核RNA测序揭示新生儿缺氧缺血性脑病的发生机制及丹酚酸C的神经保护作用

作者信息 +

Single-Nucleus RNA Sequencing Reveals the Mechanism of Neonatal Hypoxic–Ischemic Encephalopathy and the Neuroprotection Effects of Salvianolic Acid C

Author information +
文章历史 +
PDF (7259K)

摘要

新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）是围产期窒息引起的缺氧缺血性脑损伤（HIBD）所致的一种严重的神经系统疾病，会导致神经发育障碍，且目前尚无明确的治疗方法。多酚类天然化合物丹酚酸C具有抗氧化、抗炎和抗凋亡特性。本研究通过动物和人脑类器官实验评估了丹酚酸C治疗HIE的疗效；将人脑类器官作为转化平台，评估天然产物的疗效和预测临床效果；在两个时间点（HIBD和丹酚酸C给药后24 h和7 d）收集大鼠脑组织，进行单核RNA测序；采用包括微阵列和基因沉默在内的体外和体内实验来验证测序结果。研究结果表明，在HIBD的急性期，丹酚酸C抑制了信号转导及转录激活因子3阳性（Stat3+）星形胶质细胞驱动的急性神经炎症，减少了炎症因子的释放，并维持了神经胶质-免疫稳态。在亚急性期，丹酚酸C促进了少突胶质细胞的分化，并促进了抗炎性小胶质细胞与髓鞘化少突胶质细胞之间的交互，从而建立了再生微环境，并增强了神经调节蛋白3（NRG3）-受体酪氨酸蛋白激酶erbB‑4（ErbB4）信号轴的活性。这些协调机制突出了丹酚酸C在减轻早期损伤和驱动后期结构修复方面的双重能力。本研究以单细胞分辨率揭示了HIE的病理生理学机制，以及丹酚酸C针对该疾病的多靶点神经保护作用，从而为基于丹酚酸C治疗新生儿脑损伤奠定了理论基础。

Abstract

Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE), resulting from perinatal asphyxia-induced hypoxic-ischemic brain damage (HIBD), is a severe neurological disorder that impairs neurodevelopment, and no definitive therapies are available. The polyphenolic natural compound salvianolic acid C (SAC) exhibits antioxidant, anti-inflammatory, and antiapoptotic properties. In this study, we evaluated the efficacy of SAC in treating HIE via animal and human brain organoid experiments. Human brain organoids served as a translational platform for assessing natural product efficacy and clinical effect prediction. Rat brain tissues were harvested at two time points (24 h and 7 d after HIBD and SAC administration) for single-nucleus RNA sequencing. In vitro and in vivo experiments, including microarrays and gene silencing, were employed to confirm the sequencing findings. Our findings demonstrated that during the acute phase of HIBD, SAC suppressed signal transducer and activator of transcription 3+ (Stat3+) astrocyte-driven acute neuroinflammation, decreased inflammatory factor release, and maintained glial-immune homeostasis. During the subacute phase, SAC promoted oligodendrocyte differentiation and facilitated crosstalk between anti-inflammatory microglia and myelinating oligodendrocytes, establishing a regenerative microenvironment and enhancing neuregulin 3 (NRG3)-receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 (ErbB4) signaling axis activity. These coordinated mechanisms highlight the dual capacity of SAC in mitigating early injury and driving structural repair in the later stages. This study revealed the pathophysiology of HIE and the multitarget neuroprotective effects of SAC against this disorder at single-cell resolution, advancing the mechanistic foundations for SAC-based therapies in neonatal brain injury.

关键词

新生儿缺氧缺血性脑病 / 丹酚酸C / 人脑类器官 / 单核RNA测序

Key words

Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy / Salvianolic acid C / Human brain organoids / Single-nucleus RNA sequencing

引用本文

引用格式 ▾
牟璇,李璐,刘新月,张奥林,何涛,饶宝凤,张佳添,陈仁杰,Malte Spielmann,黄志超,丛斌,范骁辉. 单核RNA测序揭示新生儿缺氧缺血性脑病的发生机制及丹酚酸C的神经保护作用[J]. 工程（英文）, 2025, 55(12): 269-290 DOI:10.1016/j.eng.2025.09.010

登录浏览全文

4963

注册一个新账户 忘记密码

1 引言

新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）是指由围产期窒息引起的缺氧缺血性脑损伤（HIBD）。HIE是新生儿期危害性最高且最常见的疾病之一，常导致新生儿死亡和神经发育障碍。目前，针对HIBD尚无根本性的预防和治疗措施[1]。不同器官对缺氧的敏感性各不相同，其中脑细胞最为敏感[2]。HIBD的发病机制复杂多样，包括能量代谢紊乱、炎症反应、氧化应激、线粒体功能障碍和细胞凋亡[3]。治疗HIBD的药物开发进展缓慢，当下迫切需要阐明HIE发展的潜在机制，确定疾病靶点，开发有效的靶向疗法，并了解这些疗法的药理机制。

一些中药注射剂[如复方丹参注射液（又称“香丹注射液”）]在一些医院的HIE辅助治疗中显示出积极效果[4]，其能有效提高治疗效果，且副作用发生率较低[5]。丹酚酸C（SAC）主要来源于丹参，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡活性[6]。丹酚酸C是复方丹参注射液的活性单体之一[9]，可以调节卒中中的炎症细胞因子水平，并减少小胶质细胞极化[7‒8]。尽管有证据表明丹酚酸C具有神经保护作用，但尚无研究证明其在HIE治疗中的活性，且其具体作用机制仍不清楚。

目前大多数关于人类脑部疾病的研究集中在动物实验上[10]，导致HIE的研究进展有限。人脑类器官代表了这些研究的更优模型[11]。脑类器官的培养始于多能干细胞（PSCs），通过添加各种细胞因子将其分化成许多不同的细胞类型和成熟结构[12]。重要的是，这些类器官表现出与人脑相似的皮质结构[13]，如以T‑box脑蛋白2（TBR2）为标志的脑室下区（SVZ），该区域也是对缺氧最敏感的区域[14]。三维（3D）脑类器官的使用为研究临床医学中新生儿发育期间脑损伤所涉及的环境和遗传因素提供了一个桥梁[15]。

单核RNA测序（snRNA-seq）能够通过描绘单细胞分辨率下各种细胞类型的转录组图谱和动态特性，表征大脑中的细胞异质性[16]。这种方法能够增强人们对天然产物作用机制的理解，详细描述正常、病理和药物干预后的细胞多样性与分子变化，为疾病、药物靶点和信号通路的相关研究提供新的见解[17]。

因此，我们全面评估了丹酚酸C对大鼠和人脑类器官中HIE的药效作用。为了探索HIBD和丹酚酸C治疗的动态机制，我们在缺氧-缺血（HI）后不同时间点收集了大鼠脑组织样本进行snRNA-seq。本研究结果为HIBD机制的复杂性以及丹酚酸C在HIE治疗中的临床应用潜力提供了理论见解。

2 方法

2.1 动物实验

SD（Sprague-Dawley）乳鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。动物饲养于可控环境中，温度为24~26 ℃，相对湿度维持在适宜动物健康的水平。实验动物置于12 h光/暗周期环境，自由摄取清洁饮水及标准饲料。采用改良的Rice-Fannuzzi模型[18]，该模型是最常用的HIBD建模方法。7日龄哺乳鼠经异氟烷麻醉处理后，行右侧颈总动脉结扎，随后将幼鼠放回母鼠身边休息1.5~2 h，再置于37 ℃密闭低氧培养箱中（8% O2、92% N2）处理2 h。假手术组仅进行颈部皮肤切开，不行结扎或低氧处理。

随后对大鼠进行如下分组给药：假手术组和模型组腹腔注射等浓度生理盐水（0.01 mL∙g-1）；低剂量丹酚酸C组每日腹腔注射10 mg∙kg-1的丹酚酸C，高剂量丹酚酸C组每日腹腔注射20 mg∙kg-1的丹酚酸C。丹酚酸C（纯度≥ 98.0%，批号：DST240125-010）购自成都德斯特生物技术有限公司，以生理盐水溶解。首次给药在低氧处理结束后立即进行，此后每次给药间隔24 h。实验结束后对大鼠实施安乐死处理。

所有动物实验均经浙江大学动物实验中心动物福利与伦理委员会批准（批准号：ZJU20240849）。

2.2 人源PSC与脑类器官培养

H9人胚胎干细胞（hESCs; WA09）购自美国WiCell研究所；人源诱导PSC（hiPSC）-B1细胞（CTCC-001-0650）购自浙江美森细胞技术有限公司；hiPSC-DYR0100细胞购自中国科学院上海细胞资源中心。人源PSC（hPSC）在涂覆Matrigel（354277; Corning，美国）的细胞培养板上，使用mTeSR1培养基（85850; STEMCELL Technologies，加拿大）进行培养。未分化的hPSC细胞团通过Gentle Cell Dissociation Reagent（100-0485; STEMCELL Technologies）传代，并使用细胞刮刀进行收集。所有细胞系每3周进行一次支原体检测，结果均为阴性。

人脑类器官由H9 hESCs、hiPSC-B1细胞和hiPSC-DYR0100细胞利用STEMdiffTM Brain Organoid Kit（08570; STEMCELL Technologies）按照厂家操作说明制备。首先由hPSC形成胚状体（EBs），培养第5天，将EBs转移至诱导培养基；培养第7天将EBs包埋于Matrigel中，以促进神经上皮外生长。培养第10天后，采用STEMdiffTM Brain Organoid Maturation Kit（08571; STEMCELL Technologies）进行长期维持培养。

2.3 人脑类器官低氧处理与药物暴露

在体外分化第50天，将来自三种hPSC的人源脑类器官转移至可控氧环境的CO2培养箱（95% N2、5% CO2、O2 ≤ 1%、37 ℃；Thermo Fisher Scientific，美国）。培养基预先在1% O2、5% CO2、37 ℃条件下平衡12 h。经48 h低氧处理后，将脑类器官转入含21% O2和5% CO2的培养箱进行复氧24 h，并同期暴露于丹酚酸C。

2.4 细胞培养

大鼠脑星形胶质细胞（CTX-TNA2）、人少突胶质细胞系（MO3.13）及小鼠小胶质细胞（BV2）分别购自镜像绮点（上海）细胞技术有限公司、上海瑾原生物科技有限公司以及中国科学院上海细胞资源中心。细胞在含10%胎牛血清（FBS; Gibco）及1%青-链霉素混合液（P/S; Gibco）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM; Gibco，美国）中，于37 ℃、5% CO2条件下培养；当细胞融合度达80%时进行传代。

CTX-TNA2细胞转染时，使用Lipofectamine 2000转染试剂（11668019; Invitrogen，美国）转入小干扰RNA（siRNA）。靶向信号转导和转录激活因子3（siStat3）的小干扰RNA和阴性对照（NC）序列列于附录A中的表S1中。

BV2细胞使用10 ng∙mL-1白介素（IL）-4（HY-P70644; MedChemExpress，美国）与10 ng∙mL-1 IL-13（HY-P70460; MedChemExpress）处理24 h，以诱导抗炎型小胶质细胞。

2.5 氧糖剥夺/再灌注

氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）处理参照文献[19]方法进行。将CTX-TNA2、MO3.13与BV2细胞用新鲜培养基冲洗2次后，转入不含葡萄糖与FBS的DMEM培养基中，并置于缺氧培养箱（95% N2和5% CO2，Billups-Rothenberg,美国）中培养。随后将细胞转入富氧环境（95%空气和5% CO2）进行复氧。CTX-TNA2和MO3.13细胞缺氧6 h后复氧24 h；BV2细胞缺氧3 h后复氧6 h。OGD/R处理后，用50 μmol∙L-1丹酚酸C处理CTX-TNA2细胞，用10 μmol∙L-1或30 μmol∙L-1丹酚酸C或10 ng∙mL-1或50 ng∙mL-1神经调节蛋白3（NRG3）蛋白（HY-P75944; MedChemExpress）处理MO3.13细胞，用100 μmol∙L-1或200 μmol∙L-1丹酚酸C处理BV2细胞。

2.6 2,3,5-三苯四氮唑氯化物染色

HI处理后24 h，采集P8新生大鼠脑组织，于-20 ℃冷冻30 min，并切成约2 mm厚的冠状切片。在避光条件下，切片用0.25% 2,3,5-三苯四氮唑氯化物（TTC）溶液（G3005；北京索莱宝科技有限公司）染色30 min。随后将脑片浸入4%多聚甲醛中固定。脑梗死体积通过Image-Pro Plus软件测定。

2.7 苏木精-伊红及尼氏染色

大鼠脑组织样本制备：大鼠经异氟烷麻醉后心脏灌注生理盐水，随后灌注4%多聚甲醛固定。脑组织取出后浸入4%多聚甲醛中并包埋于石蜡中。

脑类器官样本制备：类器官用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，并浸入4%多聚甲醛中，于4 ℃保存。

石蜡包埋的样本切成4 μm厚切片。切片经脱蜡、复水处理后，用苏木精-伊红（H&E）染色液（HK2053；杭州浩克生物技术有限公司）或尼氏（Nissl）染色液（G1036；武汉赛维尔生物科技有限公司）染色。染色结果使用江风白光切片扫描仪（KF-PRO-120）采集，并使用ImageJ软件进行分析。

2.8 末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记染色

在位细胞凋亡检测采用一步法末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）试剂盒（HKI0011；杭州浩克生物技术有限公司）按照制造商说明进行。与工作液反应后，切片经4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染后封片，并使用抗荧光淬灭封片剂（HKI0007-1；杭州浩克生物技术有限公司）封固。

2.9 神经功能评分实验

2.9.1 翻正反射

将乳鼠仰卧放置于平板上，确保其头部、颈部和背部均接触平面，记录其从仰卧姿势翻转至四肢支撑直立姿势所需的时间。

2.9.2 悬崖回避

将乳鼠身体的三分之二置于平台边缘，记录其主动后退或离开边缘所需的时间。

2.9.3 负趋地性反射

将乳鼠置于相对于水平面呈45°倾角的粗糙木板上，朝向木板高端。乳鼠初始头部朝下放置，记录其开始向上攀爬所需的时间[20]。

2.10 血液生化与血常规检测

采用Catalyst Dx生化分析仪（Idexx Laboratories, 美国）检测大鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平。采用ProCyte Dx全自动血细胞分析仪（Idexx Laboratories）检测外周血常规指标，包括白细胞、红细胞、血红蛋白、淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞的数量和百分比。

2.11 免疫荧光染色与免疫组化

大鼠脑组织标本按前述方法制备4 μm厚石蜡切片。脑类器官经4%多聚甲醛固定过夜，转入30%蔗糖进行脱水后浸入明胶溶液并速冻，再切取16 μm厚切片。切片经复温、干燥、固定及清洗后，在微波炉中使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修复缓冲液进行抗原修复，并用过氧化氢抑制内源性过氧化物酶活性。随后使用3%牛血清白蛋白（BSA）封闭，加入一抗并于4 ℃孵育过夜。第二天加入相应二抗，在避光条件下孵育。所用抗体信息见附录A中表S2。

免疫荧光染色中，切片经信号放大试剂处理后用DAPI复染细胞核，最终使用抗荧光淬灭封片剂（HKI0007-1；杭州浩克生物技术有限公司）封固。免疫组化染色中，切片经冲洗后滴加3-3′二氨基联苯胺（DAB）显色液（PR30010；武汉三鹰生物技术有限公司）至出现棕黄色，再用纯水冲洗，苏木精复染、分化、蓝化、脱水，并经二甲苯透明处理，最后用中性树胶封片。染色完成后，使用白光切片扫描仪（KF-PRO-120）采集图像并进行分析。

2.12 速蓝染色

大鼠脑切片依次经二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，并以蒸馏水冲洗。切片在60 ℃条件下用0.1%速蓝（LFB）染色液（HK1050；杭州浩克生物技术有限公司）染色过夜，随后以自来水冲洗，并在显微镜指导下交替使用70%乙醇和0.05%碳酸锂进行分化，直至达到理想的灰质褪色程度。接着，用0.1%伊红复染，漂洗、自然晾干，经二甲苯透明，封固于中性树胶中。

2.13 微电极阵列记录

按既往报道的方法[21‒22]，将脑类器官接种于6孔微电极阵列（MEA）板（Axion Biosystems，美国）。使用Maestro MEA系统及AxIS软件（Axion Biosystems）进行记录。MEA板在Maestro系统中静置3 min后连续采集5 min数据。利用AxIS神经元信号分析工具鉴定动作电位（spike），若某电极每分钟记录大于或等于5个spike，则定义为“活跃电极”。以小于或等于100 ms作为峰间间隔（ISI）阈值，每个电极数据中大于或等于5个spike定义为一次放电簇（burst）；在相同ISI阈值下，网络放电簇（network burst）需包含大于或等于10个spike。使用20 ms的互相关图窗口计算同步指数。

2.14 snRNA-seq

2.14.1 大鼠脑单核制备

取假手术组、模型组及丹酚酸C组大鼠在HI后24 h和7 d的缺血侧半球脑组织（每组n = 4）。将组织加入裂解液与PBS混合液中剪切成小块，每组合并4只大鼠的组织制备单核悬液。为减少核分离过程中RNA降解，裂解缓冲液预冷并补加RNase抑制剂。在保持核完整的前提下温和匀浆，并优化裂解时间。随后在冰上用预冷裂解液进行初步裂解，加入预冷4% BSA稀释终止反应，经清洗和离心后，将细胞重悬于含4% BSA的裂解液中。每次清洗后于显微镜下检查核形态，确保其完整性。采用台盼蓝（Trypan Blue）染色评估核活性。使用Miltenyi Biotec试剂盒SOP（130-109-398; Miltenyi，德国）去除碎片。核重悬于1× PBS、2% BSA和0.1% RNase抑制剂混合液中，经20 μm滤膜过滤后计数，调节浓度至700~1200核∙μL-1 [23]。

2.14.2 单细胞文库制备与质控

根据10× Genomics Chromium Single-Cell 3试剂盒说明书，将单核悬液上样，捕获8000个单核细胞，随后进行cDNA文库制备。使用Illumina NovaSeq6000测序系统进行测序（双端多重测序，150 bp；美国），每细胞测序深度不少于20 000 reads。

质控方面，利用Illumina bcl2fastq 软件（版本5.01）进行测序数据解复用并转换为FASTQ文件。使用Cell Ranger（版本6.0.1）流程比对至大鼠参考基因组，生成原始基因表达矩阵，并在R软件（版本4.1.3）中使用Seurat（版本4.4.0）进行后续分析。质控标准包括：去除检测到的基因数少于500个的低质量细胞，以及线粒体编码转录本比例大于25%的细胞；使用Doublet Finder （版本2.0.4）去除双核细胞。

利用Seurat的对数归一化（log-normalization）方法计算基因表达值用于可视化，并根据合适的分辨率进行细胞聚类。使用均匀流形近似与投影（UMAP）进行二维（2D）可视化。

2.14.3 生物信息学分析

使用Seurat鉴定差异表达基因（DEGs），筛选标准：min.pct = 0.25，P_val < 0.05，avg_log2FC ≥ 0.25，min.diff.pct = 0.1。利用ClusterProfiler与Metascape进行基因本体（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，确定关键生物过程和信号通路，并筛选显著富集条目（P < 0.05）进行可视化[24]。

利用Monocle2描绘细胞发育轨迹，并通过GeneTest函数评估细胞状态变化，随后使用plot_cell_trajectory函数在拟时序（pseudo-time）上排列细胞。

使用CellChat分析细胞间配体-受体（LR）对的表达，揭示细胞间相互作用网络，并比较不同细胞亚群之间的相互作用数量与强度。

结合SCENIC与snRNA-seq数据构建基因调控网络，鉴定转录因子（TFs）及靶基因共表达模块，推测直接靶基因，并计算调控子活性与细胞类型特异性评分。

部分生物信息分析结果通过OmicStudio在线工具（https://www.omicstudio.cn/tool）分析获得。

2.15 血清炎性因子芯片检测

采用Luminex液相悬浮芯片（上海华盈生物医药科技有限公司）检测大鼠血清炎性细胞因子。使用Bio-Plex Pro Rat Cytokine 23-plex Kit（12005641; Bio-Rad，美国）按照厂家说明操作。简言之，芯片与样品孵育1 h，加入相应抗体，再加入链霉亲和素-R-藻红蛋白。使用Bio-Plex阵列检测仪（Bio-Rad）进行读取。

2.16 实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）

使用TRIZOL试剂（R0016；上海碧云天生物技术股份有限公司）提取总RNA，采用HiFiScript cDNA 合成试剂盒（CW2569M；江苏康为世纪生物科技股份有限公司）进行反转录。利用SYBR Green PCR试剂盒（11184ES；上海翊圣生物科技有限公司）在CFX-TouchTM 96实时定量PCR系统（Bio-Rad）中结合所需引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]检测基因表达。特异性引物序列见附录A中表S1。相对表达量按照ΔΔCt法计算并归一化。本实验重复3次。

2.17 蛋白质印迹（Western blotting）

蛋白质经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至聚偏二氟乙烯膜，室温下用5%脱脂奶粉封闭1 h，4 ℃条件下一抗孵育过夜。于室温使用辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗[在含有5%脱脂牛奶的Tris缓冲盐水和Tween 20（TBST）中以1∶5000稀释]孵育1 h，TBST洗涤3次后，加入化学发光底物显色，并曝光检测蛋白条带[25]。所用抗体见附录A中表S2。

2.18 乳酸脱氢酶释放实验

采用乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（c0016；上海碧云天生物技术股份有限公司）评价细胞毒性。收集各孔脑类器官培养上清液，与检测试剂工作液孵育，使用Infinite M1000 Pro微孔板检测仪（Tecan，瑞士）测定吸光度。

2.19 酶联免疫吸附试验

使用IL-6与IL-1β酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（KE20024, KE20005；武汉三鹰生物技术有限公司）分别检测CTX-TNA2细胞培养上清液（IL-6）和裂解液（IL-1β）中的细胞因子水平。样品与标准品加至预包被捕获抗体的酶标板中孵育，IL-6采用辣根过氧化物酶标记二抗检测，IL-1β则采用生物素化抗体与链霉亲和素-HRP检测。加入3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）底物显色，在450 nm（参考波长630 nm）测定吸光度，并通过四参数逻辑曲线拟合计算浓度。

BV2细胞上清液中NRG3水平采用NRG3 ELISA试剂盒（SYP-M2228-T1；杭州臻优品生物科技有限公司）检测，具体步骤与上述类似。

2.20 核蛋白提取

按照试剂盒（EX1470；北京索莱宝科技有限公司）说明从CTX-TNA2细胞中提取核蛋白。简要方法如下：细胞经冰PBS洗涤后加入A液裂解，轻摇混匀并离心。沉淀重悬于B液，并加入蛋白酶及磷酸酶抑制剂，离心收集含核蛋白的上清，于-80 ℃保存。

2.21 液相色谱-质谱分析

通过靶向液相色谱-质谱（LC-MS）定量分析评估腹腔注射后7日龄（P7）大鼠脑内丹酚酸C分布。大鼠按20 mg∙kg-1、40 mg∙kg-1、80 mg∙kg-1剂量给予丹酚酸C（20 mg∙kg-1作为实验剂量），给药30 min后深度麻醉并取脑，于-80 ℃保存。样品前处理步骤如下：冻存脑组织加入1 mL预冷80%甲醇匀浆，超声30 min后离心取上清，沉淀再加入1 mL 80%甲醇重复提取，合并上清减压干燥后用200 μL 50%甲醇重溶。采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（1.7 μm, 2.1 × 100 mm; Waters, 美国）结合Nexera X2 UHPLC系统（Shimadzu, 日本）与5500 QTRAP质谱仪（AB SCIEX, 美国）在负离子模式分析。流动相为水（A）和乙腈（B），流速为300 μL∙min-1，梯度洗脱程序如下：0~4 min，B从30%升至90%；4~6 min，B保持90%；6~7 min，B从90%降至30%；7~10 min，B保持30%。在多反应监测（MRM）模式下监测定量离子对m/z 491.2至293，定性离子对m/z 491.2至311，使用Analyst 软件（版本1.6.3）对色谱峰面积进行定性与定量分析。

2.22 统计分析

所有数据以均数±标准差（SD）表示。当比较多于两组时，采用单因素方差分析（ANOVA）；两组间比较使用非配对Student t检验。显著性水平设定为P小于0.05。数据分析使用GraphPad Prism 8.0软件完成。

3 结果

3.1 丹酚酸C减轻HIBD大鼠的脑损伤

为评估丹酚酸C的疗效，我们对于假手术组、模型组及丹酚酸C（10 mg∙kg-1和20 mg∙kg-1）处理组，在HI后24 h采用TTC染色测定脑梗死体积。结果显示，10 mg∙kg-1与20 mg∙kg-1剂量的丹酚酸C均可显著降低脑梗死体积，且呈剂量依赖性[图1（a）和（b）]。因此，后续实验选择20 mg∙kg-1作为研究剂量。丹酚酸C组乳鼠的体重显著高于模型组[图1（c）]。在HI后7 d对各组大鼠的脑形态进行比较，发现模型组出现严重的脑水肿与液化，缺血半球显著缩小，而经丹酚酸C处理后相关症状均得到明显改善[图1（d）]。在HIBD相关研究中，大鼠非缺血半球被视为具有正常质量，因此采用右侧与左侧半球质量比值评估HIBD所致的脑质量丢失[26]。结果表明，丹酚酸C处理可显著减少HIBD大鼠脑质量丢失[图1（e）]。此外，行为学测试结果提示，丹酚酸C可缓解HI所致的神经功能损伤[图1（f）]。

病理染色结果显示，模型组缺血半球存在严重损伤，大脑皮质与海马区细胞排列紊乱且数量减少，尼氏体分布及结构异常[图1（g）和（h）]。丹酚酸C处理后，神经元形态与数量均得到改善，脑的结构完整性得以恢复[图1（g）和（h）]。同时，丹酚酸C能减轻HI诱导的凋亡[图1（i）和（j）]。在低倍镜观察的整体染色切片中，可清晰区分梗死核心区、半暗带及未损伤区域[附录A中图S1（a）]。梗死核心区表现为严重的结构崩解与密集的TUNEL阳性凋亡细胞；半暗带区域存在部分神经元丢失、H&E染色紊乱、尼氏体碎裂，以及散在的TUNEL阳性细胞；未损伤区域的细胞结构保持完整。

此外，我们对20 mg∙kg-1剂量丹酚酸C的毒性进行了评估。HI后7 d持续进行丹酚酸C给药，丹酚酸C组大鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺及肾脏未见明显损伤[附录A中图S1（b）]。与假手术组相比，模型组与丹酚酸C组血清ALT及AST水平无显著差异[图1（k）]。血常规分析结果显示，丹酚酸C可逆转HI诱导的炎性细胞数量增多，尤其是中性粒细胞[附录A中图S1（c）]。因此，20 mg∙kg-1剂量的丹酚酸C连续给药7 d处理后，未观察到明显毒性反应。

3.2 丹酚酸C挽救HIE脑类器官中的神经元凋亡并恢复神经网络完整性

我们进一步评估了丹酚酸C治疗在人脑类器官中的药效学作用。脑类器官模型的构建如图2（a）所示。免疫荧光染色显示这些脑类器官中存在丰富的细胞类型和结构[附录A中图S2（a）]。

随后，基于人脑类器官建立了HIE模型，如图2（b）所示。为验证HI损伤，本文在多个层面严格监测病理生理参数。蛋白质印迹和免疫荧光染色结果显示，在缺氧和复氧后，脑类器官中出现低氧金标准指标——低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达[图2（c）~（f）]。病理学染色提示，HIE后脑类器官的细胞形态及数量均发生显著变化，证实了HI诱导的脑类器官损伤[附录A中图S2（b）和（c）]。本研究还进一步确认，HIE可促进多种形式的细胞死亡[附录A中图S2（d）~（g）]。此外，通过加入抗凋亡和促凋亡抑制剂，本研究证明该HIE脑类器官模型可用于药物评价[附录A中图S2（h）~（j）]。这些结果与现有缺氧脑类器官模型研究报道一致[14,27‒28]。

为评估丹酚酸C在HIE中的治疗效果，本研究使用了三种人多能干细胞系（H9 hESC、hiPSC-B1和hiPSC-DYR0100）生成脑类器官[附录A中图S3（a）]。将1 μmol∙L-1、5 μmol∙L-1和10 μmol∙L-1丹酚酸C处理组分别设定为低、中、高剂量组。在HIE建模前，所有脑类器官随机分配至三组，统计结果显示各组脑类器官面积无显著差异，从而保证了实验的准确性[图2（g）]。在HIE建模及丹酚酸C干预后，对脑类器官面积及培养液中细胞碎片进行评估，结果表明，5 μmol∙L-1丹酚酸C在减少HIE脑类器官细胞死亡和损伤方面效果最为显著[图2（g）、附录A中图S3（b）]。进一步结果显示，5 μmol∙L-1丹酚酸C可显著降低HIE诱导的细胞毒性[图2（h）]。因此，选择5 μmol∙L-1作为后续研究的处理浓度。

接着，本研究检测了TBR2的表达，发现HIE造模显著降低了脑类器官中TBR2信使RNA（mRNA）水平，这提示神经发生受损，因为TBR2是神经发生过程中在中间前体细胞中表达的重要转录因子[14]，其在径向胶质细胞转变为成熟神经元的过程中发挥关键作用。丹酚酸C治疗显著恢复了TBR2的表达水平[图2（i）]，提示其在HIE损伤后具有潜在的神经保护作用。免疫荧光染色结果显示，丹酚酸C可显著减少凋亡[图2（j）和（k）]，且凋亡主要发生于此前鉴定出的神经元中[附录A中图S2（a）]。在体实验使用大鼠脑组织验证了这一结果。Ki67/双皮质蛋白（DCX）双染色、神经元特异性III类β-微管蛋白（TUJ-1）及生长相关蛋白43（GAP43）免疫组化结果显示，丹酚酸C治疗可逆转HIBD导致的阳性细胞减少[附录A中图S3（c）~（e）]，提示其能够促进神经发生。蛋白质印迹结果进一步表明，丹酚酸C可显著逆转HI诱导的活化半胱天冬酶（cleaved caspase）-3和B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）相关X蛋白（BAX）上调及Bcl-2下调[附录A中图S3（f）~（i）]，这与人脑类器官的凋亡检测结果一致。

随后，在人脑类器官中进行的电生理检测显示，与对照组相比，模型组的放电次数、活跃电极数和网络放电簇均减少，反映了神经元功能减弱及网络同步性受损。丹酚酸C干预逆转了上述变化，增强了神经信号传递与网络完整性[图2（l）~（n），附录A中图S3（j）~（m）]。

综上所述，本研究通过分子学、组织学及功能学等多种方法的综合研究确认，HIE脑类器官模型能够重现HIE的关键病理生理特征，包括缺氧诱导的分子反应、结构性损伤、异常神经发生及神经网络活动障碍。此外，这些结果为丹酚酸C缓解HIE所致损伤并发挥神经保护作用提供了有力证据。

3.3 HIBD大鼠丹酚酸C治疗的实验流程及单核转录组图谱

为探究HIBD及丹酚酸C治疗的转录组图谱与作用机制，我们使用10× Genomics平台对假手术组（Sham）、模型组（Model）及丹酚酸C处理组在HI后24 h与7 d的大鼠脑组织进行snRNA-seq，每组选择4只具有代表性的大鼠进行检测。在HIBD中，HI后最初的24 h普遍被认为是急性期，此阶段主要发生急性神经元死亡及炎症反应[29]；至第7天，疾病进入亚急性期，神经修复和再生逐渐成为主要过程，同时大鼠脑的功能恢复也在此阶段启动[30]。实验流程如图3（a）所示。经大规模数据过滤后，共检测到59 282个细胞：24 h_Sham、24 h_Model、24 h_SAC、7 d_Sham、7 d_Model和7 d_SAC组分别获得9997个、12 141个、10 546个、9294个、8465个和8839个细胞[附录A中图S4（a）]。随后数据在分辨率为0.8条件下进行降维处理，并通过UMAP进行可视化[附录A中图S4（b）]。

为确认30个细胞簇的身份，我们基于经典标志基因鉴定出13种细胞类型[图3（b）]。各组不同细胞谱系的比例差异显著[图3（c）]。这些细胞类型包括：星形胶质细胞[ACs；通过水通道蛋白4（Aqp4）、胶质纤维酸性蛋白（Gfap）、tenascin C（Tnc）及溶质载体家族1成员2（Slc1a2）的表达进行鉴定]；Cajal-Retzius 细胞[reelin（Reln）、肿瘤蛋白p73（Tp73）及神经元衍生神经营养因子（Ndnf）]；内皮细胞[MDS1和EVI1复合位点（Mecom）、fms相关受体酪氨酸激酶1（Flt1）、半胱/酪氨酸富集蛋白1（Cyyr1）及黏附型G蛋白偶联受体L4（Adgrl4）]；兴奋性神经元[cAMP调节磷蛋白21（Arpp21）及溶质载体家族17成员7（Slc17a7）]；抑制性神经元[谷氨酸脱羧酶1（Gad1）及谷氨酸脱羧酶 2（Gad2）]；小胶质细胞[MG；组织蛋白酶 S（Ctss）、C-X3-C基序趋化因子受体1（Cx3cr1）、LYN原癌基因Src家族酪氨酸激酶（Lyn）及细胞因子运输因子8（Dock8）]；神经前体细胞[NPCs；核仁和纺锤体相关蛋白1（Nusap1）、DNA拓扑异构酶II α（Top2a）及着丝粒蛋白F（Cenpf）]；少突胶质细胞[OLs；髓鞘碱性蛋白（Mbp）、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白（Mobp）、SRY框转录因子10（Sox10）及UDP糖基转移酶8（Ugt8）]；少突胶质前体细胞[OPCs；髓鞘转录因子1（Myt1）、多EGF样结构域蛋白11（Megf11）及血小板源性生长因子受体α（Pdgfra）]；周细胞[pericytes；Ⅲ型胶原α1链（Col3a1）、ATP结合盒转运蛋白C亚家族成员9（Abcc9）及Ⅰ型胶原α1链（Col1a1）]，如图3（d）~（e）和附录A中图S4（c）所示。与假手术组相比，模型组兴奋性神经元比例显著下降，而星形胶质细胞比例在多个时间点均明显升高[图3（c）]，提示HIBD导致神经元损伤与死亡。这些细胞分布的变化在丹酚酸C治疗后得到了恢复。值得注意的是，从HI后24 h到7 d，小胶质细胞的比例显著升高，此结果与既往报道一致[31‒32]，相应报道认为幼鼠中枢神经系统在出生后前两周处于活跃发育期，小胶质细胞数量逐渐增多，且形态多样性增加。此外，轴突的发育及突触的形成也可能在此期间刺激小胶质细胞的增殖[33]。

3.4 丹酚酸C降低Stat3+ 星形胶质细胞比例并减轻急性炎症

星形胶质细胞在HIBD的病理生理过程中发挥重要作用，因为它们在调节炎症反应和应答损伤方面具有多重功能[3]。为深入探讨星形胶质细胞的异质性，本研究根据其特征基因将其聚类为8个亚群[图4（a）、附录A中图S5（a）]。研究观察到，这些亚群的变化主要发生在HI后24 h [图4（b）]。利用基于基因集富集分析（GSEA）数据库的星形胶质细胞激活评分结果，我们发现HI后星形胶质细胞活化水平升高，而丹酚酸C处理可使其下降[附录A中图S5（b）]。

值得注意的是，星形胶质细胞中最显著的变化是Stat3+ AC亚群比例在模型组HI后24 h急剧增加，成为主要亚群，占比达43.02%，而假手术组相应亚群仅为0.26% [图4（b）]。Stat3+ AC的特征基因富集于急性炎症反应和细胞应激调控过程[附录A中图S5（a）]。基于GSEA数据库基因集，Stat3+ AC急性炎症反应评分最高[图4（c）]。此外，该亚群高表达典型促炎星形胶质细胞标志基因，如Gfap、S100b和Stat3 [图4（d）]。

HI显著上调了Stat3+ AC中大多数与急性炎症相关的基因表达，而丹酚酸C能够逆转这一效应[图4（e）]。另外，我们检测了该亚群中多种炎症反应相关转录因子，包括芳烃受体（AHR）、原癌基因c-Rel（REL）、B细胞淋巴瘤3蛋白（BCL3）、叉头框蛋白O3（FOXO3）、PBX/knotted 1同源盒蛋白1（PKNOX1）、干扰素调节因子3（IRF3）以及碱性螺旋-环-螺旋家族成员e41（BHLHE41），结果发现，丹酚酸C处理后这些转录因子的活性总体下降[图4（f）]。其中，REL参与多种炎症反应及核因子κB（NF-κB）信号转导[34‒35]；BCL3在细胞核中作为转录激活因子，促进NF-κB靶基因的转录[36‒37]。丹酚酸C对Stat3+ AC炎症相关转录因子的特异性抑制[附录A中图S5（c）]，提示该细胞群在HIBD发病机制及丹酚酸C的治疗作用中具有重要意义。与此一致，HI损伤显著提高了多种促炎细胞因子基因的表达[附录A中图S5（d）]。

本研究结果支持如下机制：HI诱导的REL和BCL3在星形胶质细胞中发生核转位，激活NF-κB信号通路及Stat3表达，驱动促炎细胞因子的释放并放大急性炎症反应。为验证该机制，我们在HI后24 h采用蛋白芯片检测大鼠血清炎症因子谱，结果显示丹酚酸C抑制了多种由HI诱导的促炎因子释放[图4（g）]。ELISA与免疫荧光染色进一步显示，大鼠脑组织中IL-6、IL‑18和巨噬细胞集落刺激因子（M‑CSF）的表达变化与血清炎症因子谱结果一致[附录A中图S5（e）~（g）]。免疫荧光定量验证了丹酚酸C在HIBD后特异性抑制Stat3+ AC扩增[图4（h）和（i）]，该亚群主要分布于缺血半球的梗死核心及半暗带区域[附录A中图S5（h）]。此外，大鼠脑切片的多重免疫荧光染色结果显示，在Stat3+ AC内，模型组核内REL与BCL3表达显著高于假手术组，提示这些炎症相关转录因子的活性升高[附录A中图S5（i）和（j）]，而丹酚酸C处理可逆转此效应。结合snRNA-seq数据中Stat3+ AC促炎基因表达下降的结果[图4（e）、附录A中图S5（c）]，这些有力证据表明丹酚酸C在缺血损伤的中枢神经系统（CNS）局部，直接调节神经炎症。

在体外实验中，使用CTX-TNA2星形胶质细胞OGD/R模型验证发现，OGD/R可诱导Stat3、Bcl2和Rel mRNA表达上调，并增加REL蛋白核定位，而丹酚酸C对其表现出明显的抑制作用[图4（j）、附录A中图S5（k）~（l）]，这与Stat3+ 亚群数量及转录因子活化的变化一致。ELISA和免疫荧光染色进一步证实，丹酚酸C可显著改善星形胶质细胞中包括IL-6与IL-1β在内的炎症因子表达[图4（k）、附录A中图S5（m）~（n）]。蛋白质印迹检测显示，模型组显著激活了星形胶质细胞的STAT3通路，而丹酚酸C有效抑制STAT3蛋白的磷酸化[图4（l）和（m）]，总蛋白水平的变化与上述结果一致[附录A中图S5（o）]。瞬时转染沉默CTX-TNA2细胞中Stat3基因表达，可显著降低OGD/R建模后星形胶质细胞炎症因子的释放水平[图4（n）和（o）]，丹酚酸C可能还存在STAT3非依赖的协同抗炎机制。上述体外结果为丹酚酸C在星形胶质细胞中直接发挥抗炎作用提供了机制支持，星形胶质细胞也是CNS神经炎症中的主要效应细胞类型之一[3]。

为进一步验证跨物种的保守机制，本文检测了人脑类器官中Stat3+ AC的激活情况。人脑类器官切片的免疫荧光染色结果表明，在GFAP高表达的星形胶质细胞区域中，HIE诱导后STAT3表达显著升高[图4（p）和（q）]，提示HIE脑类器官中STAT3 + GFAP + 细胞数量增加。值得注意的是，丹酚酸C处理可显著抑制HIE诱导的人脑类器官中Stat3+ AC的增多[图4（p）和（q）]。这一跨物种验证与大鼠脑组织的snRNA-seq结果一致，证实了STAT3介导的星形胶质细胞缺血反应机制在不同物种间具有保守性。

综上所述，本研究通过体内与体外的功能实验（包括细胞因子检测、Stat3基因沉默及其他分子生物学研究）提供了有力证据，证明Stat3+ AC亚群在HIE急性期病理中具有促炎作用，并验证了Stat3是丹酚酸C的关键药理学作用靶点。这些发现强调了靶向星形胶质细胞介导的炎症反应在CNS损伤治疗中的潜在价值。

3.5 丹酚酸C治疗改善小胶质细胞免疫稳态

小胶质细胞是中枢神经系统的固有免疫细胞，在HIBD发生后的炎症级联反应中发挥关键作用，在病理过程中发生显著的分子和功能改变[38]。通过综合聚类分析，本研究鉴定出8个具有独特基因特征的小胶质细胞亚群[图5（a）、附录A中图S6（a）]。每个亚群的前100个差异表达基因功能注释的GO富集分析结果见图5（b）。值得注意的是，Cped1+ MG亚群在HI后24 h显著减少，并在7天内保持低水平[图5（b）]，其特征是趋化相关基因[胰凝乳蛋白酶样弹性蛋白酶1（Cela1）、Cx3cr1、C‑C基序趋化因子受体5（Ccr5）、slit导向配体2（Slit2）、semaphorin 6A（Sema6a）、细胞因子转运蛋白4（Dock4）、整合素α9亚基（Itga9）、外切核苷酸三磷酸二磷酸水解酶1（Entpd1）、整合素α6亚基（Itga6）、星形支持蛋白1（Astn1）、原钙黏蛋白7（Pcdh7）以及选择素P配体（Selplg）]高表达[图5（c）]，并发挥与趋化相关的生物学功能[图5（b）]。由于趋化对于向损伤部位的定向迁移至关重要[39]，该亚群的耗竭提示小胶质细胞监视功能受损及损伤应答机制减弱。基于GSEA数据库基因集评分，本研究观察到与模型组相比，丹酚酸C治疗能够减弱小胶质细胞活化[附录A中图S6（b）]。在所有亚群中，Grial1+ MG表现出最低的活化状态[附录A中图S6（c）]，其位于分化轨迹的起始位置[图5（d）]，具有维持CNS稳态所需的静息状态表型，并通过突触调节发挥生物学功能[40]，如图5（b）所示。根据比例分析，丹酚酸C能有效保护静息型小胶质细胞群体，并在HI后各时间点维持趋化能力[图5（c）]。

在急性HI阶段，本研究观察到与DNA复制生物学功能相关的增殖性Pola1+ MG亚群扩增[图5（b）、附录A中图S6（d）]，反映了CNS早期损伤应答中小胶质细胞增殖的典型特征。增殖性小胶质细胞是脑缺血性疾病（如卒中）的关键靶点[41]。DEGs分析显示，丹酚酸C可能促进Pola1+ MG分泌细胞因子并调节中性粒细胞趋化及T细胞增殖，从而增强免疫应答[图5（e）、附录A中图S6（e）]，同时抑制HI诱导的铁死亡及自噬通路[图5（e）]，避免细胞功能受损[42]。

随着HIBD进展，Mx1+ MG和吞噬性Kif26b+ MG比例逐渐增加[图5（b）]。Mx1+ MG高表达多种干扰素应答相关基因[多聚（ADP-核糖）聚合酶家族成员14（Parp14）、多聚（ADP-核糖）聚合酶家族成员9（Parp9）、干扰素调节因子1（Irf1）、含解旋酶C结构域的干扰素诱导蛋白1（Ifih1）以及2'-5'-寡腺苷酸合成酶2（Oas2）]，并参与经典NF-κB信号的正向调控[图5（b）、附录A中图S6（f）]。热图及基因集评分结果显示，Mx1+ MG和Cd163+ MG分别具有促炎和抗炎功能[图5（f）、附录A中图S6（g）~（h）]。所用标志基因均为已被广泛报道的促炎型和抗炎型小胶质细胞表型的经典标志物[43‒44]。此外，本研究结果显示，Cd163+ MG亚群在体内高表达IL‑10，进一步证实其具备抗炎特性[附录A中图S6（i）]。因此，我们推测，随着缺血时间延长，小胶质细胞逐步由免疫应答早期阶段向炎症反应调控阶段转变。此外，结果提示丹酚酸C可能通过提高一些转录因子[如ELL相关因子6（EAF6）、肌细胞增强因子2C（MEF2C）以及Krüppel样因子13（KLF13）]的活性，增强Cd163+ MG驱动基因[如免疫球蛋白κ链J区重组信号结合蛋白（Rbpj）]的表达，从而发挥抗炎作用[图5（g）、附录A中图S6（j）]。免疫荧光分析显示，HI后7 d丹酚酸C可抑制M1型极化[图5（h）~（i）]，与拟时序分析结果一致[附录A中图S6（k）]。

此外，Npl+ MG亚群呈现与膜脂代谢相关的动态时间变化[图5（b）]。HI早期脂质转运功能受抑制，而模型组中Npl+ MG晚期扩增提示其可能通过产生生物活性脂质介质和清除碎片参与神经修复[45‒46]。丹酚酸C介导的Npl+ MG水平稳定性与炎症及组织损伤的减轻相关[图5（b）]，这支持了小胶质细胞代谢重编程作为潜在治疗靶点的可行性。

据此，本文提出丹酚酸C具有小胶质细胞免疫调节能力，即能够动态调节小胶质细胞活化状态，平衡促炎与抗炎表型，恢复稳态，调控迁移与增殖，并促进修复功能。

综上，丹酚酸C在HIBD不同阶段以多模式调节多种小胶质细胞亚群的活化状态，从早期的增殖与损伤应答，到后期的炎症控制与修复，凸显了其通过调节小胶质细胞异质性来恢复CNS稳态的治疗潜力。

3.6 丹酚酸C通过保护原钙黏蛋白相关15阳性（Pcdh15+ ）神经祖细胞和MER原癌基因酪氨酸激酶阳性（Mertk+ ）少突胶质前体细胞增强神经修复能力

除炎症反应外，HIBD病理过程中内源性祖细胞的动态变化也值得关注。因此，本文系统分析了HI后祖细胞的动态变化。

首先，本研究将神经祖细胞聚类为5个具有特异性基因的亚群[图6（a）、附录A中图S7（a）]，并描述了各组之间亚群比例的差异[图6（b）]。基于GSEA数据库基因集的分化评分显示，Pcdh15+ NPC具有较强的分化能力[图6（c）]。Pcdh15+ NPC特异性表达转录因子SOX10[图6（d）]，而SOX10为少突胶质生成所必需[47]。RNA比率分析进一步证实了其向少突胶质谱系表型的分化轨迹[图6（d）]。

本研究注意到，Pcdh15+ NPC高表达神经发育调控因子[结直肠癌缺失蛋白（Dcc）、roundabout导向受体1（Robo1）]以及Pdgfra [附录A中图S7（b）]，其中Pdgfra是驱动少突胶质前体细胞增殖的关键因子。丹酚酸C在HI后各时间点均能维持Pcdh15+ NPC亚群比例[图6（b）]，恢复内吞功能并稳定对细胞内稳态至关重要的代谢通路[附录A中图S7（c）]，从而抵消了缺血条件下HI所致的祖细胞耗竭。

随后，本研究将少突胶质前体细胞聚类为5个亚群[图6（e）、附录A中图S7（d）]，并展示了各组之间比例的差异[图6（f）]。Mertk+ OPC亚群特异性表达免疫调节型酪氨酸激酶Mertk [图6（e）]，该酶可调节胶质细胞分化与免疫监视[48]。GO富集分析同样显示Mertk+ OPC在免疫反应中的作用[附录A中图S7（e）]。少突胶质前体细胞能够调控中枢神经系统稳态，并感知和应答多种神经炎症反应[49‒50]。值得注意的是，对于Mertk+ OPC亚群，其少突胶质前体细胞标志基因Pdgfra和硫酸软骨素蛋白聚糖4（Cspg4）的表达水平较低，而定向分化型少突胶质前体细胞（COP）的标志基因G蛋白偶联受体17（Gpr17）和骨形态发生蛋白4（Bmp4）的表达水平更高[图6（g）]，提示其处于少突胶质前体向少突胶质细胞过渡的中间阶段[51]。拟时序轨迹分析进一步证实了这种过渡状态[附录A中图S7（f）]。丹酚酸C促进COP的扩增[图6（f）]，可通过HI后7天BMP4 + 少突胶质细胞转录因子2阳性（Oligo2 + ）细胞数量的增加证实[图6（h）和（i）]，这提示其加速了少突胶质细胞的成熟过程。

综上所述，本研究结果表明，丹酚酸C能够调节HI后的祖细胞动态，通过保护具有少突胶质生成潜能的Pcdh15+ NPC维持神经祖细胞群体，并促进少突胶质谱系中由COP介导的分化承诺（differentiation commitment）。这些协同效应提示，丹酚酸C可通过促进少突胶质细胞再生来增强内源性修复过程，从而有助于HIBD的白质重建及功能恢复。

3.7 丹酚酸C促进少突胶质细胞分化与成熟，并改善抗炎型小胶质细胞与少突胶质细胞之间的通信

本研究对直接参与髓鞘再生的少突胶质细胞进行聚类分析，得到了7个在转录水平上存在差异的亚群[图7（a）、附录A中图S8（a）]。有趣的是，不同亚群少突胶质细胞的比例在新生大鼠出生后发育过程中呈现动态变化[图7（b）]。根据标志基因富集结果，巢蛋白1阳性（Nid1+ ）OL、少突胶质髓鞘旁节点及内环蛋白阳性（Opalin+ ）OL，以及序列同源性家族124成员A阳性（Fam124a+ ）OL与髓鞘形成及少突胶质细胞分化密切相关[图7（b）]。利用GSEA数据集评分显示，Opalin+ OL和Fam124a+ OL具备更强的分化能力，且在HI后7 d经丹酚酸C处理后其分化能力进一步增强[图7（c）、附录A中图S8（b）]。拟时序轨迹分析将这些亚群定位于末端分化阶段[图7（d）]，其特征是髓鞘成熟标志物[Mbp、髓鞘调节因子（Myrf）以及2',3'-环状核苷酸3'-磷酸二酯酶（Cnp）]表达水平升高[图7（e）]。丹酚酸C处理可抵消HI在24 h内诱导的急性成熟少突胶质细胞耗竭，并促进其持续恢复，尤其是Fam124a+ OL亚群的修复效果最为突出[图7（b）]。这些结果得到了免疫荧光检测结果的验证[图7（f）和（g）]。LFB染色进一步证实丹酚酸C可减轻HI导致的髓鞘结构损伤及病理性改变[附录A中图S8（c）]。MBP免疫荧光染色与LFB染色直接揭示了丹酚酸C对少突胶质细胞成熟及髓鞘修复的神经保护作用，提示丹酚酸C促进少突胶质细胞的分化与成熟。

既往研究报道，抗炎型小胶质细胞对少突胶质细胞的再髓鞘化功能至关重要[52]。这些小胶质细胞通过抑制炎症反应、清除髓鞘碎片并促进少突胶质细胞成熟来支持髓鞘再生[53]。因此，本研究利用CellChat分析HI后7 d在不同处理组中Cd163+ MG与Nid1+ OL、Opalin+ OL及Fam124a+ OL之间的细胞通信情况。结果显示，HI降低了来源于Cd163+ MG亚群的信号数量和强度，提示细胞间互作功能障碍，而丹酚酸C处理可恢复信号的复杂性[图7（h）]。

进一步分析发现，本研究鉴定出显著的LR对，揭示了Cd163+ MG与Nid1+ OL、Opalin+ OL及Fam124a+ OL之间的互作关系[图7（i）]。在模型组中，NRG3-ErbB4和神经调节蛋白2（NRG2）-ErbB4配对的通信概率显著下降，尤其是NRG3-ErbB4，但这一趋势在丹酚酸C处理后逆转[图7（i）]。本文还比较了不同组间这些LR配对的表达水平[附录A中图S8（d）]。神经调节蛋白（NRGs）广泛分布于神经系统，参与多种神经发育过程。在小胶质细胞中，NRG信号通路可抑制炎症反应、减轻神经元损伤[54]，并促进神经轴突及髓鞘的再生[55]。NRG3作为NRG家族成员，可与ErbB4受体结合[56]。Erbb4在少突胶质细胞中高表达，编码一种跨膜受体酪氨酸激酶，与配体结合后，在病理状态下的再髓鞘化中具有关键作用[57]。免疫荧光共定位实验首次证实了抗炎型小胶质细胞与有髓少突胶质细胞之间的NRG3-ErbB4配对互作[图7（j）]。

本研究在BV2和MO3.13细胞中对上述发现进行了体外验证。BV2细胞的实验流程如图8（a）所示，通过IL‑4和IL‑13刺激诱导抗炎型表型。免疫荧光染色显示刺激后的BV2细胞CD163表达显著上调[图8（b）和（c）]，蛋白质印迹结果亦证实ARG1表达明显增加[图8（d）]，与测序数据中抗炎型小胶质细胞标志基因的表达特征一致。在这些极化细胞中进行OGD/R处理及丹酚酸C干预后，ELISA结果显示OGD/R模型组的NRG3蛋白分泌显著下降[图8（e）]，表明OGD/R损害了抗炎型小胶质细胞分泌NRG3配体的能力，而丹酚酸C可呈浓度依赖性地逆转这一现象[图8（e）]。在MO3.13细胞研究中，本研究进一步发现，OGD/R造模显著降低了少突胶质细胞中ErbB4受体的激活水平及MBP表达，而NRG3重组蛋白的添加及丹酚酸C干预可呈浓度依赖性地恢复这些指标[图8（f）~（i）]。上述结果表明，丹酚酸C可促进NRG3蛋白分泌，并增强其与少突胶质细胞ErbB4受体的结合，从而激活受体介导信号通路，促进髓鞘修复。

综上所述，本研究的结果提示，丹酚酸C可能通过缓解成熟少突胶质细胞损伤及重塑细胞通信微环境来促进髓鞘的恢复与再生，该作用主要通过抗炎型小胶质细胞与成熟少突胶质细胞间的NRG3-ErbB4信号轴实现。

4 讨论

4.1 研究创新概述

与2D细胞培养相比，类器官展现出更加复杂和多样化的细胞类型，并具有与体内细胞相似的结构特征，可反映细胞与细胞外微环境之间的相互作用[58]。因此，类器官模型有效弥补了细胞模型在完整性和异质性方面的局限[58‒59]。更重要的是，本研究通过监测HIF-1α（评估缺氧相关细胞反应的金标准生物标志物）验证了HIE类器官模型的建立。在缺氧期和复氧期均采用蛋白水平检测方法对HIF-1α表达进行定量分析，确保了类器官系统在病理模拟上的可靠性。本研究所用的人脑类器官模型重现了新生儿HIE的关键特征[14,60]，包括新生儿缺氧易感脑区关键因子表达的变化、缺氧诱导的标志性分子反应、多种类型的神经元死亡以及神经网络功能障碍。因此，该模型是研究HIE发病机制及评估潜在治疗干预有效性的有力工具。本研究利用HIE人脑类器官评估天然产物在脑缺血性疾病中的治疗效果，从而减少了动物模型中物种特异性差异的干扰，有助于更全面、精准地阐明药理作用机制。

HIBD是一种常见的围产期神经损伤，长期以来一直是神经科学研究中的难点[61]。本研究精确追踪了缺血缺氧损伤后单核转录组的时间动态，首次在单细胞水平揭示了HIBD的病理过程及药物干预下的修复过程[62]。亚低温治疗被认为是临床治疗HIE常用的方法，但其疗效有限[63]。将亚低温疗法与药物注射相结合的策略正日益受到关注[5]，凸显了本研究的重要性。与其他疾病研究相比，本研究采用的snRNA-seq技术具有显著优势，包括在新生儿脑疾病研究中首次应用、对脑组织分析有技术优越性以及减少技术缺陷，从而能够更深入地解析HIE的病理生理过程及丹酚酸C治疗的作用机制。本研究所得结果填补了新生儿大鼠脑的单细胞数据空白，并发现了许多可作为HIE诊断或辅助治疗靶点的潜在生物标志物。

4.2 结果的深入分析

本研究选择HIBD后24 h与7 d两个时间点，用于捕捉疾病进展的不同阶段。24 h时间点反映急性期，其特征为兴奋性神经元死亡[图3（c）]、神经炎症（图4）及神经胶质-免疫稳态的破坏（图5）。这些过程与临床上早期HIE病理生理中的能量衰竭、兴奋性毒性和急性炎症相一致[29]。7天时间点反映亚急性期，在此阶段，大脑开始启动修复过程，包括神经前体细胞的分化以及少突胶质细胞的成熟，这些均是髓鞘再生所必需的；同时炎症微环境逐渐转为再生状态。此阶段的关键过程包括少突胶质细胞分化与成熟（图6和图7）、小胶质细胞重编程（图5）及髓鞘再生的启动[附录A中图S8（c）]。这些结果与临床亚急性期[30]相一致，该时期以内源性修复为主，但往往不足以完全恢复功能。药物剂量方面，大鼠实验选用20 mg∙kg-1丹酚酸C剂量，参考了以往脑缺血模型中丹酚酸C神经保护作用的报道[7]，并结合我们在10 mg∙kg-1与20 mg∙kg-1剂量间的初步比较结果。脑类器官实验中选择中等剂量5 μmol∙L-1，能够最优地减轻HIE诱导的损伤，并在疗效与毒性之间保持平衡。

LC-MS分析证实，腹腔注射的丹酚酸C能够穿过血脑屏障并在脑组织中分布。在所有丹酚酸C处理组（20 mg∙kg-1、40 mg∙kg-1、80 mg∙kg-1）中均检测到明显的丹酚酸C峰（保留时间为1.45 min），而在生理盐水对照组未检测到[附录A中图S9（a）~（e）]。峰面积随给药剂量的增加而增大，提示丹酚酸C在脑内累积呈剂量依赖性。这些结果为丹酚酸C可穿越血脑屏障提供了直接证据。

持续性脑炎症是影响发育期脑功能的重要机制[64]。本研究揭示了胶质细胞的时间依赖性反应。HI早期，星形胶质细胞主要参与急性炎症反应，表现为Stat3+ AC大幅增多，同时小胶质细胞增殖显著；外周血促炎细胞因子水平升高可能加重HI引起的神经损伤[65]。已有研究报道，星形胶质细胞STAT3参与HIBD后的炎症反应[66‒69]，可能通过调控IL-6信号[66]和IL-1β表达[67]实现。有研究在HIE患者脑组织中观察到STAT3调控的炎症标志物（如C3）上调[66]，且在星形胶质细胞特异性敲除Stat3的动物模型中，IL-1/IL-6应答性星形胶质细胞减少，神经炎症减轻且功能恢复改善[66]。上述动物实验结果与本研究一致。靶向抑制STAT3可能成为治疗HIE的一种策略[70]。然而，丹酚酸C对该靶点的作用尚不明确。

在本研究中，丹酚酸C显著抑制Stat3+ AC亚群的产生，并降低其促炎转录因子活性，从而清除炎症介质、缓解急性炎症。尤其是在类器官水平观察到丹酚酸C治疗可使Stat3+ AC显著减少，进一步支持了结果的可转化性；且该结果与大鼠脑组织snRNA-seq数据一致，提示该机制在物种间具有保守性。文献显示，REL可与κB抑制蛋白（IκB）相互作用，炎症信号可激活IκB激酶复合物，导致IκB磷酸化与降解，从而激活经典NF-κB通路[71]。进入细胞核后，REL可直接激活促炎基因，并进一步激活STAT3 [71]。BCL3可与抑制性p50同源二聚体结合，将其转化为转录激活复合物[72]，或移除抑制性p50二聚体，从而增强NF-κB活性并放大炎症反应[73]。此外，NF-κB与STAT3通路之间存在串扰[74]，可产生协同放大效应，进一步增强炎症反应[75]。在本研究中，丹酚酸C抑制了Rel与Bcl3的表达[图4（j）]以及REL与BCL3转录因子的核定位[附录A中图S5（f）~（i）]，可能阻断NF-κB激活，并减弱与STAT3通路间的协同放大作用，从而降低炎症因子释放并减轻炎症反应。丹酚酸C下调促炎基因的表达，为其在中枢神经系统中调控神经炎症提供了直接证据。本研究在体外的基因沉默实验进一步确认Stat3是丹酚酸C的主要药理靶点。细胞模型中的功能验证进一步支持了Stat3抑制与丹酚酸C缓解神经炎症级联反应之间的机制关联。针对丹酚酸C可能存在与STAT3无关的协同抗炎机制，其可能通过调控转录因子活性抑制NF-κB通路。Stat3沉默仅部分缓解炎症，可能由Stat3沉默效率不足及siRNA潜在的脱靶效应所致。丹酚酸C在神经炎症早期的调节作用通过创造一个更有利的微环境，间接影响了亚急性期的再生过程，从而促进少突胶质细胞的分化与成熟[76‒77]。

此外，本研究发现Mx1+ MG的比例随着病程的延长逐渐增加，并表现出更高水平的M1型小胶质细胞标志物的表达。既往研究报道，脑缺血后前14天内，M1型小胶质细胞数量增加[78]。在脑损伤24 h内，保护性小胶质细胞可填充缺血核心；在第7天，边缘区和缺血核心的CD68表达显著增加，并伴随小胶质细胞吞噬功能的逐渐增强，同时保护性小胶质细胞标志基因的表达下降[78]。在Cd163+ MG中，本研究提示丹酚酸C可能通过增强KLF13等转录因子的活性来促进部分驱动基因（如Rbpj）的调控。既往研究表明，缺失Klf13会引起神经系统免疫应答的改变，并最终导致神经功能损伤[79]。Rbpj表达的增加可能通过介导Notch同源蛋白1（Notch1）信号通路来调节细胞分化，从而减轻脑出血损伤[80]。因此，本文推测，丹酚酸C可能通过激活转录因子KLF13上调Rbpj的表达，从而介导Notch1信号通路，调节炎症反应并缓解HI引起的脑损伤。

既往研究在HI损伤后药物疗效评价中主要关注神经保护作用，关于神经修复与再生的报道较少，且新生儿在HI后的神经发生反应机制尚不明确[81‒83]。本研究观察到丹酚酸C处理后Pcdh15+ NPC显著增加，该细胞群与细胞黏附及突触结构维持相关。神经前体细胞可通过分泌多种生长因子和细胞外基质成分间接参与细胞黏附过程[84]。在哺乳动物中枢神经系统内，内源性神经前体细胞主要存在于侧脑室室管膜下区和齿状回颗粒下区[85]，能够在损伤区域增殖并分化为功能性神经元和胶质细胞，从而完成再生与修复[86]。

髓鞘是中枢神经系统的保护性外壳，对神经信号传导至关重要，其发育异常或损伤将导致传导功能障碍，并可能在儿童期造成长期不良后果[87]。在新生儿白质发育的关键时期，HI损伤可破坏白质少突胶质细胞前体细胞及未成熟少突胶质细胞，导致髓鞘形成受损[88]。因此，髓鞘发育异常或脱髓鞘是HIE的主要病理表现之一[89]。然而，目前针对髓鞘再生的特异性治疗策略仍较为有限。本研究揭示了脑缺血后少突胶质细胞谱系的动态变化过程，涵盖少突胶质细胞前体增殖到成熟少突胶质细胞的分化。正如预期，大鼠出生后成熟少突胶质细胞数量逐渐增加，提示髓鞘发育进程持续进行。HI损伤导致成熟少突胶质细胞几乎完全损耗，而丹酚酸C处理可显著发挥保护作用。在急性期挽救成熟少突胶质细胞（如Fam124a+ OL）不仅有助于减轻早期脱髓鞘，还为亚急性期快速再髓鞘化奠定了细胞基础，这对髓鞘完整性及神经功能的恢复至关重要。

此外，丹酚酸C还可通过促进小胶质细胞与少突胶质细胞之间的相互作用来缓解HIBD症状。丹酚酸C可能促进抗炎性小胶质细胞分泌NRG3，当NRG3激活少突胶质细胞表面的ErbB4受体时，可启动一系列下游信号通路，从而促进髓鞘修复并发挥神经保护作用。从这一角度来看，本研究结果也为与髓鞘再生相关的HIE临床治疗提供了新的思路。

4.3 研究局限与未来展望

本研究存在一定局限性。本研究建立的人脑类器官缺乏血管结构及免疫细胞[90]，而这些是脑微环境的重要组成部分，在缺血性疾病中发挥关键作用。缺乏血管化和固有免疫成分可能影响类器官内的营养和氧气扩散，从而影响细胞存活及损伤反应，并制约了对神经炎症及免疫相关通路相互作用研究的开展[91‒92]。尽管近年来相关研究取得了诸多突破[93]，但仍需进一步优化。由于从脑类器官中提取和分离不同类型胶质细胞存在技术挑战，本研究未能在该模型中广泛验证胶质细胞内的信号通路与作用靶点。此外，本研究尚未深入研究HIBD的长期病理变化及丹酚酸C的长期药理效应。

为进一步验证相关作用机制，未来研究应聚焦于利用条件性敲除大鼠进行在体靶点验证，开展纵向研究以评估长期神经发育结局，并在临床样本（如脑脊液或血液）中验证生物标志物。类器官血管化和免疫系统优化可通过引入内皮祖细胞或血管类器官共培养体系[94]、开发生物工程化的芯片类器官平台[95]以及整合由hPSC衍生的小胶质细胞[96]来实现。将单细胞转录组与空间转录组分析应用于含有小胶质细胞的血管化人脑类器官，可通过确认在动物模型中观察到的保守分子特征和细胞相互作用，加强跨物种验证[97‒98]，以弥合临床前动物研究与人类临床结果之间的关键差距。解决关键转化瓶颈（如结合质谱成像与空间代谢组学的药代动力学研究、制剂开发及临床试验设计）也是临床应用前的重要步骤。尤其需要指出，低温疗法联合其他神经保护策略是目前HIE的标准治疗方案[63]，将低温疗法与丹酚酸C结合应用，有望进一步改善治疗效果，值得开展深入临床研究。此类研究将有助于进一步验证丹酚酸C的治疗潜力，并为临床转化提供剂量方案参考。

5 结论

本研究通过单核RNA测序全面解析了HIBD转录组动态变化机制及丹酚酸C的治疗作用机制。结果显示，丹酚酸C能有效抑制由Stat3+ 星形胶质细胞介导的急性炎症反应，同时维持胶质-免疫稳态。在亚急性期，丹酚酸C进一步促进少突胶质细胞的分化与成熟，改善胶质细胞间的相互作用，并促进髓鞘再生。总体而言，丹酚酸C在HIBD中展现了广泛的神经保护作用。本研究强调了丹酚酸C治疗HIBD的重要性，并提出了潜在的HIE诊断新型生物标志物。所构建的数据资源为深入研究HIE的病理机制及新型药物开发提供了有力支持。

参考文献

原文顺序 | 出版日期 | 本文引用
[1]

Jacobs SE, Berg M, Hunt R, Tarnow-Mordi WO, Inder TE, Davis PG. Cooling for newborns with hypoxic ischaemic encephalopathy. Cochrane Libr 2013;2013(1):CD003311. . 10.1002/14651858.cd003311.pub3
[2]

Wang Q, Lv H, Lu L, Ren P, Li L. Neonatal hypoxic‒ischemic encephalopathy: emerging therapeutic strategies based on pathophysiologic phases of the injury. J Matern Fetal Neonatal Med 2019;32(21):3685‒92. . 10.1080/14767058.2018.1468881
[3]

You Q, Lan X, Liu N, Du J, Ma L, Yang J, et al. Neuroprotective strategies for neonatal hypoxic‒ischemic brain damage: current status and challenges. Eur J Pharmacol 2023;957:176003. . 10.1016/j.ejphar.2023.176003
[4]

Huang XF, Wang JM, Chen Q, Wei YY, Chen HW. Meta-analysis on effect of compound Danshen injection in treating neonatal hypoxic‒ischemic encephalopathy. China J Chin Mater Med 2015;40(1):141‒8. Chinese.
[5]

Zhang C, Guo J, Yin H, Yin C, Peng Y. Traditional Chinese medicine for neonatal hypoxic‒ischemic encephalopathy: a Bayesian network meta-analysis. J Ethnopharmacol 2024;319:117317. . 10.1016/j.jep.2023.117317
[6]

Tang HJ, Zhang XW, Yang L, Li W, Li JH, Wang JX, et al. Synthesis and evaluation of xanthine oxidase inhibitory and antioxidant activities of 2-arylbenzo[b]-furan derivatives based on salvianolic acid C. Eur J Med Chem 2016;124:637‒48. . 10.1016/j.ejmech.2016.08.019
[7]

Guo W, Xu X, Xiao Y, Zhang J, Shen P, Lu X, et al. Salvianolic acid C attenuates cerebral ischemic injury through inhibiting neuroinflammation via the TLR4‒TREM1‒NF-κB pathway. Chin Med 2024;19(1):46. . 10.1186/s13020-024-00914-0
[8]

Shen H, Pei H, Zhai L, Guan Q, Wang G. Salvianolic acid C improves cerebral ischemia reperfusion injury through suppressing microglial cell M1 polarization and promoting cerebral angiogenesis. Int Immunopharmacol 2022;110:109021. . 10.1016/j.intimp.2022.109021
[9]

Shi B, Li Q, Feng Y, Dai X, Zhao R, Zhao Y, et al. Pharmacokinetics of 13 active components in a rat model of middle cerebral artery occlusion after intravenous injection of Radix Salviae miltiorrhizae‒Lignum dalbergiae odoriferae prescription. J Sep Sci 2020;43(2):531‒46. . 10.1002/jssc.201900748
[10]

Sjöstedt E, Zhong W, Fagerberg L, Karlsson M, Mitsios N, Adori C, et al. An atlas of the protein-coding genes in the human, pig, and mouse brain. Science 2020;367(6482):eaay5947. . 10.1126/science.aay5947
[11]

Ol E, Ja K. Human cerebral organoids—a new tool for clinical neurology research. Nat Rev Neurol 2022;18(11):661‒80. . 10.1038/s41582-022-00723-9
[12]

Lancaster MA, Renner M, Martin CA, Wenzel D, Bicknell LS, Hurles ME, et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature 2013;501(7467):373‒9. . 10.1038/nature12517
[13]

Lancaster MA, Knoblich JA. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc 2014;9(10):2329‒40. . 10.1038/nprot.2014.158
[14]

Pașca AM, Park JY, Shin HW, Qi Q, Revah O, Krasnoff R, et al. Human 3D cellular model of hypoxic brain injury of prematurity. Nat Med 2019;25(5):784‒91. . 10.1038/s41591-019-0436-0
[15]

Gaston-Breton R, Maïza Letrou A, Hamoudi R, Stonestreet BS, Mabondzo A. Brain organoids for hypoxic‒ischemic studies: from bench to bedside. Cell Mol Life Sci 2023;80(11):318. . 10.1007/s00018-023-04951-0
[16]

Yu L, Yan J, Zhan Y, Li A, Zhu L, Qian J, et al. Single-cell RNA sequencing reveals the dynamics of hepatic non-parenchymal cells in autoprotection against acetaminophen-induced hepatotoxicity. J Pharm Anal 2023;13(8):926‒41. . 10.1016/j.jpha.2023.05.004
[17]

Shao X, Wang Z, Wang K, Lu X, Zhang P, Guo R, et al. A single-cell landscape of human liver transplantation reveals a pathogenic immune niche associated with early allograft dysfunction. Engineering 2024;36(5):193‒208. . 10.1016/j.eng.2023.12.004
[18]

Vannucci RC, Vannucci SJ. Perinatal hypoxic‒ischemic brain damage: evolution of an animal model. Dev Neurosci 2005;27(2‒4):81‒6.
[19]

Shin JA, Kim YA, Kim HW, Kim HS, Lee KE, Kang JL, et al. Iron released from reactive microglia by noggin improves myelin repair in the ischemic brain. Neuropharmacology 2018;133:202‒15. . 10.1016/j.neuropharm.2018.01.038
[20]

Xie T, Shuang L, Liu G, Zhao S, Yuan Z, Cai H, et al. Insight into the neuroprotective effect of genistein-3′-sodium sulfonate against neonatal hypoxic‒ischaemic brain injury in rats by bioinformatics. Mol Neurobiol 2023;60(2):807‒19. . 10.1007/s12035-022-03123-8
[21]

Negraes PD, Trujillo CA, Yu NK, Wu W, Yao H, Liang N, et al. Altered network and rescue of human neurons derived from individuals with early-onset genetic epilepsy. Mol Psychiatry 2021;26(11):7047‒68. . 10.1038/s41380-021-01104-2
[22]

Trujillo CA, Rice ES, Schaefer NK, Chaim IA, Wheeler EC, Madrigal AA, et al. Reintroduction of the archaic variant of NOVA1 in cortical organoids alters neurodevelopment. Science 2021;371(6530):eaax2537. . 10.1126/science.aax2537
[23]

Pan J, Wang Z, Huang X, Xue J, Zhang S, Guo X, et al. Bacteria-derived outer-membrane vesicles hitchhike neutrophils to enhance ischemic stroke therapy. Adv Mater 2023;35(38):e2301779. . 10.1002/adma.202301779
[24]

Zhang Q, Liu J, Shen J, Ou J, Wong YK, Xie L, et al. Single-cell RNA sequencing reveals the effects of capsaicin in the treatment of sepsis-induced liver injury. MedComm 2023;4(5):e395. . 10.1002/mco2.395
[25]

Zhou C, Li Z, Li Y, Li Y, Wang W, Shang W, et al. TRABD modulates mitochondrial homeostasis and tissue integrity. Cell Rep 2024;43(6):114304. . 10.1016/j.celrep.2024.114304
[26]

Li C, Wu Z, Xue H, Gao Q, Zhang Y, Wang C, et al. Ferroptosis contributes to hypoxic‒ischemic brain injury in neonatal rats: role of the SIRT1/Nrf2/GPx4 signaling pathway. CNS Neurosci Ther 2022;28(12):2268‒80. . 10.1111/cns.13973
[27]

Kim MS, Kim DH, Kang HK, Kook MG, Choi SW, Kang KS. Modeling of hypoxic brain injury through 3D human neural organoids. Cells 2021;10(2):234. . 10.3390/cells10020234
[28]

Wang SN, Wang Z, Wang XY, Zhang XP, Xu TY, Miao CY. Humanized cerebral organoids-based ischemic stroke model for discovering of potential anti-stroke agents. Acta Pharmacol Sin 2023;44(3):513‒23. . 10.1038/s41401-022-00986-4
[29]

Vannucci RC, Vannucci SJ. A model of perinatal hypoxic‒ischemic brain damagea. Ann N Y Acad Sci 1997;835(1):234‒49. . 10.1111/j.1749-6632.1997.tb48634.x
[30]

Fang M, Liu J, Zhang Z, Li Y, Zhu J, Lin Z. Chloroquine protects hypoxia/ischemia-induced neonatal brain injury in rats by mitigating blood‒brain barrier disruption. ACS Chem Nerosci 2023;14(10):1764‒73. . 10.1021/acschemneuro.2c00650
[31]

Dalmau I, Vela JM, González B, Finsen B, Castellano B. Dynamics of microglia in the developing rat brain. J Comp Neurol 2003;458(2):144‒57. . 10.1002/cne.10572
[32]

Monier A, Adle-Biassette H, Delezoide AL, Evrard P, Gressens P, Verney C. Entry and distribution of microglial cells in human embryonic and fetal cerebral cortex. J Neuropathol Exp Neurol 2007;66(5):372‒82. . 10.1097/nen.0b013e3180517b46
[33]

Duffy AS, Eyo UB. Microglia and astrocytes in postnatal neural circuit formation. Glia 2025;73(2):232‒50. . 10.1002/glia.24650
[34]

DeLaney AA, Berry CT, Christian DA, Hart A, Bjanes E, Wynosky-Dolfi MA, et al. Caspase-8 promotes c-Rel-dependent inflammatory cytokine expression and resistance against Toxoplasma gondii . Proc Natl Acad Sci USA 2019;116(24):11926‒35. . 10.1073/pnas.1820529116
[35]

Giridharan S, Srinivasan M. Mechanisms of NF-κB p65 and strategies for therapeutic manipulation. J Inflamm Res 2018;11:407‒19. . 10.2147/jir.s140188
[36]

Collins PE, Somma D, Kerrigan D, Herrington F, Keeshan K, Nibbs RJB, et al. The IκB-protein BCL-3 controls Toll-like receptor-induced MAPK activity by promoting TPL-2 degradation in the nucleus. PNAS 2019;116(51):25828‒38. . 10.1073/pnas.1900408116
[37]

Liu H, Zeng L, Yang Y, Guo C, Wang H. Bcl-3: a double-edged sword in immune cells and inflammation. Front Immunol 2022;13:847699. . 10.3389/fimmu.2022.847699
[38]

Quan H, Zhang R. Microglia dynamic response and phenotype heterogeneity in neural regeneration following hypoxic‒ischemic brain injury. Front Immunol 2023;14:1320271. . 10.3389/fimmu.2023.1320271
[39]

Lau SF, Wu W, Wong HY, Ouyang L, Qiao Y, Xu J, et al. The VCAM1‒ApoE pathway directs microglial chemotaxis and alleviates Alzheimer’s disease pathology. Nat Aging 2023;3(10):1219‒36. . 10.1038/s43587-023-00491-1
[40]

Nayak D, Roth TL, McGavern DB. Microglia development and function. Annu Rev Immunol 2014;32(1):367‒402. . 10.1146/annurev-immunol-032713-120240
[41]

Zhang Y, Li J, Zhao Y, Huang Y, Shi Z, Wang H, et al. Arresting the bad seed: HDAC3 regulates proliferation of different microglia after ischemic stroke. Sci Adv 2024;10(10):eade6900. . 10.1126/sciadv.ade6900
[42]

Tang D, Chen X, Kang R, Kroemer G. Ferroptosis: molecular mechanisms and health implications. Cell Res 2021;31(2):107‒25. . 10.1038/s41422-020-00441-1
[43]

Lan X, Han X, Li Q, Yang QW, Wang J. Modulators of microglial activation and polarization after intracerebral haemorrhage. Nat Rev Neurol 2017;13(7):420‒33. . 10.1038/nrneurol.2017.69
[44]

Chen T, Huang X, Zhao YX, Zhou Z, Zhou W. NEAT1 inhibits the angiogenic activity of cerebral arterial endothelial cells by inducing the M1 polarization of microglia through the AMPK signaling pathway. Cell Mol Biol Lett 2024;29(1):29. . 10.1186/s11658-024-00579-5
[45]

Yan B, Liao P, Liu Y, Han Z, Wang C, Chen F, et al. Therapeutic potential of microglia-derived extracellular vesicles in ischemic stroke. Int Immunopharmacol 2024;139:112712. . 10.1016/j.intimp.2024.112712
[46]

Fumagalli M, Lombardi M, Gressens P, Verderio C. How to reprogram microglia toward beneficial functions. Glia 2018;66(12):2531‒49. . 10.1002/glia.23484
[47]

Negintaji K, Ghanbari A, Frozanfar M, Jafarinia M, Zibara K. Pregnenolone enhances the proliferation of mouse neural stem cells and promotes oligodendrogenesis, together with Sox10, and neurogenesis, along with Notch1 and Pax6. Neurochem Int 2023;163:105489. . 10.1016/j.neuint.2023.105489
[48]

Miao YR, Rankin EB, Giaccia AJ. Therapeutic targeting of the functionally elusive TAM receptor family. Nat Rev Drug Discov 2024;23(3):201‒17. . 10.1038/s41573-023-00846-8
[49]

Akay LA, Effenberger AH, Tsai LH. Cell of all trades: oligodendrocyte precursor cells in synaptic, vascular, and immune function. Genes Dev 2021;35(3‒4):180‒98.
[50]

Haroon A, Seerapu H, Fang LP, Weß JH, Bai X. Unlocking the potential: immune functions of oligodendrocyte precursor cells. Front Immunol 2024;15:1425706. . 10.3389/fimmu.2024.1425706
[51]

Jin C, Shi Y, Shi L, Leak RK, Zhang W, Chen K, et al. Leveraging single-cell RNA sequencing to unravel the impact of aging on stroke recovery mechanisms in mice. Proc Natl Acad Sci USA 2023;120(25):e2300012120. . 10.1073/pnas.2300012120
[52]

Kent SA, Miron VE. Microglia regulation of central nervous system myelin health and regeneration. Nat Rev Immunol 2024;24(1):49‒63. . 10.1038/s41577-023-00907-4
[53]

Song S, Oft H, Metwally S, Paruchuri S, Bielanin J, Fiesler V, et al. Deletion of Slc9a1 in Cx3cr1+ cells stimulated microglial subcluster CREB1 signaling and microglia‒oligodendrocyte crosstalk. J Neuroinflammation 2024;21(1):69. . 10.1186/s12974-024-03065-z
[54]

Kataria H, Hart CG, Alizadeh A, Cossoy M, Kaushik DK, Bernstein CN, et al. Neuregulin-1 beta 1 is implicated in pathogenesis of multiple sclerosis. Brain 2021;144(1):162‒85. . 10.1093/brain/awaa385
[55]

Santhosh KT, Alizadeh A, Karimi-Abdolrezaee S. Design and optimization of PLGA microparticles for controlled and local delivery of neuregulin-1 in traumatic spinal cord injury. J Control Release 2017;261:147‒62. . 10.1016/j.jconrel.2017.06.030
[56]

Kataria H, Alizadeh A, Shahriary GM, Saboktakin Rizi S, Henrie R, Santhosh KT, et al. Neuregulin-1 promotes remyelination and fosters a pro-regenerative inflammatory response in focal demyelinating lesions of the spinal cord. Glia 2018;66(3):538‒61. . 10.1002/glia.23264
[57]

Tao F, Li Q, Liu S, Wu H, Skinner J, Hurtado A, et al. Role of neuregulin-1/ErbB signaling in stem cell therapy for spinal cord injury-induced chronic neuropathic pain. Stem Cells 2013;31(1):83‒91. . 10.1002/stem.1258
[58]

Mou X, Zhang A, He T, Chen R, Zhou F, Yeung TC, et al. Organoid models for Chinese herbal medicine studies. Acta Materia Med 2023;2(1):64‒71. . 10.15212/amm-2022-0047
[59]

Bowles KR, Silva MC, Whitney K, Bertucci T, Berlind JE, Lai JD, et al. ELAVL4, splicing, and glutamatergic dysfunction precede neuron loss in MAPT mutation cerebral organoids. Cell 2021;184(17):4547‒4563.e17. . 10.1016/j.cell.2021.07.003
[60]

Deng Q, Parker E, Duan R, Yang L. Preconditioning and posttreatment strategies in neonatal hypoxic‒ischemic encephalopathy: recent advances and clinical challenges. Mol Neurobiol 2025;62(8):10020‒44. . 10.1007/s12035-025-04896-4
[61]

Rasineni GK, Panigrahy N, Rath SN, Chinnaboina M, Konanki R, Chirla DK, et al. Diagnostic and therapeutic roles of the “omics” in hypoxic‒ischemic encephalopathy in neonates. Bioengineering 2022;9(10):498. . 10.3390/bioengineering9100498
[62]

Chen J, Zhang Q, Guo J, Gu D, Liu J, Luo P, et al. Single-cell transcriptomics reveals the ameliorative effect of rosmarinic acid on diabetic nephropathy-induced kidney injury by modulating oxidative stress and inflammation. Acta Pharm Sin B 2024;14(4):1661‒76. . 10.1016/j.apsb.2024.01.003
[63]

Zheng Y, Li L, Chen B, Fang Y, Lin W, Zhang T, et al. Chlorogenic acid exerts neuroprotective effect against hypoxia‒ischemia brain injury in neonatal rats by activating Sirt1 to regulate the Nrf2‒NF-κB signaling pathway. Cell Commun Signal 2022;20(1):84. . 10.1186/s12964-022-00860-0
[64]

Altamentova S, Rumajogee P, Hong J, Beldick SR, Park SJ, Yee A, et al. Methylprednisolone reduces persistent post-ischemic inflammation in a rat hypoxia‒ischemia model of perinatal stroke. Transl Stroke Res 2020;11(5):1117‒36. . 10.1007/s12975-020-00792-2
[65]

Alsbrook DL, Di Napoli M, Bhatia K, Biller J, Andalib S, Hinduja A, et al. Neuroinflammation in acute ischemic and hemorrhagic stroke. Curr Neurol Neurosci Rep 2023;23(8):407‒31. . 10.1007/s11910-023-01282-2
[66]

Leng K, Rose IVL, Kim H, Xia W, Romero-Fernandez W, Rooney B, et al. CRISPRi screens in human iPSC-derived astrocytes elucidate regulators of distinct inflammatory reactive states. Nat Neurosci 2022;25(11):1528‒42. . 10.1038/s41593-022-01180-9
[67]

Yang XL, Wang X, Shao L, Jiang GT, Min JW, Mei XY, et al. TRPV1 mediates astrocyte activation and interleukin-1β release induced by hypoxic ischemia (HI). J Neuroinflammation 2019;16(1):114. . 10.1186/s12974-019-1487-3
[68]

Wang C, Zhang P, Li Y, Wang X, Guo L, Li J, et al. Downregulation of TRIM27 alleviates hypoxic‒ischemic encephalopathy through inhibiting inflammation and microglia cell activation by regulating STAT3/HMGB1 axis. J Chem Neuroanat 2023;129:102251. . 10.1016/j.jchemneu.2023.102251
[69]

Zhou Y, Wang S, Zhao J, Fang P. Asiaticoside attenuates neonatal hypoxic‒ischemic brain damage through inhibiting TLR4/NF-κB/STAT3 pathway. Ann Transl Med 2020;8(10):641. . 10.21037/atm-20-3323
[70]

Hristova M, Rocha-Ferreira E, Fontana X, Thei L, Buckle R, Christou M, et al. Inhibition of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) reduces neonatal hypoxic‒ischaemic brain damage. J Neurochem 2016;136(5):981‒94. . 10.1111/jnc.13490
[71]

Yu H, Lin L, Zhang Z, Zhang H, Hu H. Targeting NF-κB pathway for the therapy of diseases: mechanism and clinical study. Signal Transduct Target Ther 2020;5(1):5. . 10.1038/s41392-020-00312-6
[72]

Hayden MS, Ghosh S. NF-κB, the first quarter-century: remarkable progress and outstanding questions. Genes Dev 2012;26(3):203‒34. . 10.1101/gad.183434.111
[73]

Schuster M, Annemann M, Plaza-Sirvent C, Schmitz I. Atypical IκB proteins—nuclear modulators of NF-κB signaling. Cell Commun Signal 2013;11(1):23. . 10.1186/1478-811x-11-23
[74]

Grivennikov SI, Karin M. Dangerous liaisons: STAT3 and NF-κB collaboration and crosstalk in cancer. Cytokine Growth Factor Rev 2010;21(1):11‒9. . 10.1016/j.cytogfr.2009.11.005
[75]

Fan Y, Mao R, Yang J. NF-κB and STAT3 signaling pathways collaboratively link inflammation to cancer. Protein Cell 2013;4(3):176‒85. . 10.1007/s13238-013-2084-3
[76]

Berghoff SA, Spieth L, Sun T, Hosang L, Schlaphoff L, Depp C, et al. Microglia facilitate repair of demyelinated lesions via post-squalene sterol synthesis. Nat Neurosci 2021;24(1):47‒60. . 10.1038/s41593-020-00757-6
[77]

Song S, Hasan MN, Yu L, Paruchuri SS, Bielanin JP, Metwally S, et al. Microglial‒oligodendrocyte interactions in myelination and neurological function recovery after traumatic brain injury. J Neuroinflammation 2022;19(1):19. . 10.1186/s12974-022-02608-6
[78]

Perego C, Fumagalli S, De Simoni MG. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation 2011;8(1):174. . 10.1186/1742-2094-8-174
[79]

McCamy KM, Rees KA, Winzer-Serhan UH. Peripheral immune challenges elicit differential up-regulation of hippocampal cytokine and chemokine mRNA expression in a mouse model of the 15q13.3 microdeletion syndrome. Cytokine 2022;159:156005. . 10.1016/j.cyto.2022.156005
[80]

Yang H, Gao X, Xiao W, Su J, Li Y, Ni W, et al. Minocycline alleviates white matter injury following intracerebral hemorrhage by regulating CD4+ T cell differentiation via notch1 signaling pathway. Oxid Med Cell Longev 2022;2022(1):3435267. . 10.1155/2022/3435267
[81]

Beldarrain G, Hilario E, Lara-Celador I, Chillida M, Catalan A, Álvarez-Diaz AÁ, et al. The long-term neuroprotective effect of the endocannabinoid 2-AG and modulation of the SGZ’s neurogenic response after neonatal hypoxia‒ischemia. Pharmaceutics 2023;15(6):1667. . 10.3390/pharmaceutics15061667
[82]

Kadam SD, Mulholland JD, McDonald JW, Comi AM. Neurogenesis and neuronal commitment following ischemia in a new mouse model for neonatal stroke. Brain Res 2008;1208:35‒45. . 10.1016/j.brainres.2008.02.037
[83]

Yu TS, Washington PM, Kernie SG. Injury-induced neurogenesis: mechanisms and relevance. Neuroscientist 2016;22:61‒71. . 10.1177/1073858414563616
[84]

Barenys M, Gassmann K, Baksmeier C, Heinz S, Reverte I, Schmuck M, et al. Epigallocatechin gallate (EGCG) inhibits adhesion and migration of neural progenitor cells in vitro . Arch Toxicol 2017;91(2):827‒37. . 10.1007/s00204-016-1709-8
[85]

Beldarrain G, Chillida M, Hilario E, Herrero De La Parte B, Álvarez A, Alonso-Alconada D. URB447 is neuroprotective in both male and female rats after neonatal hypoxia‒ischemia and enhances neurogenesis in females. Int J Mol Sci 2024;25(3):1607. . 10.3390/ijms25031607
[86]

Leker RR, Lasri V, Chernoguz D. Growth factors improve neurogenesis and outcome after focal cerebral ischemia. J Neural Transm 1996;2009(116):1397‒402.
[87]

Guardia Clausi M, Paez PM, Pasquini LA, Pasquini JM. Inhalation of growth factors and apo-transferrin to protect and repair the hypoxic‒ischemic brain. Pharmacol Res 2016;109:81‒5. . 10.1016/j.phrs.2016.01.010
[88]

Fancy SPJ, Harrington EP, Yuen TJ, Silbereis JC, Zhao C, Baranzini SE, et al. Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination. Nat Neurosci 2011;14(8):1009‒16. . 10.1038/nn.2855
[89]

Yıldız EP, Ekici B, Tatlı B. Neonatal hypoxic ischemic encephalopathy: an update on disease pathogenesis and treatment. Expert Rev Neurother 2017;17(5):449‒59. . 10.1080/14737175.2017.1259567
[90]

Yang C, Hawkins KE, Doré S, Candelario-Jalil E. Neuroinflammatory mechanisms of blood‒brain barrier damage in ischemic stroke. Am J Physiol Cell Physiol 2019;316(2):C135‒53. . 10.1152/ajpcell.00136.2018
[91]

Naderi-Meshkin H, Cornelius VA, Eleftheriadou M, Potel KN, Setyaningsih WAW, Margariti A. Vascular organoids: unveiling advantages, applications, challenges, and disease modelling strategies. Stem Cell Res Ther 2023;14(1):292. . 10.1186/s13287-023-03521-2
[92]

Huang R, Gao F, Yu L, Chen H, Zhu R. Generation of neural organoids and their application in disease modeling and regenerative medicine. Adv Sci 2025;12(29):e01198. . 10.1002/advs.202501198
[93]

Tang XY, Wu S, Wang D, Chu C, Hong Y, Tao M, et al. Human organoids in basic research and clinical applications. Signal Transduct Target Ther 2022;7(1):168. . 10.1038/s41392-022-01024-9
[94]

Ji Y, Chen X, Wang Z, Meek CJ, McLean JL, Yang Y, et al. Alzheimer’s disease patient brain extracts induce multiple pathologies in novel vascularized neuroimmune organoids for disease modeling and drug discovery. Mol Psychiatry 2025; 30: 4558‒75. . 10.1038/s41380-025-03041-w
[95]

Pai V, Singh BN, Singh AK. Transformative advances in modeling brain aging and longevity: success,challenges and future directions.Ageing Res Rev 2025;108:102753. . 10.1016/j.arr.2025.102753
[96]

Yi S, Huang M, Xian C, Kong X, Yin S, Peng J, et al. Single-cell transcriptomics of vascularized human brain organoids decipher lineage-specific stress adaptation in fetal hypoxia-reoxygenation injury. Theranostics 2025;15(14):7001‒24. . 10.7150/thno.117001
[97]

Sun F, Li H, Sun D, Fu S, Gu L, Shao X, et al. Single-cell omics: experimental workflow, data analyses and applications. Sci China Life Sci 2025;68(1):5‒102. . 10.1007/s11427-023-2561-0
[98]

Yang P, Jin K, Yao Y, Jin L, Shao X, Li C, et al. Spatial integration of multi-omics single-cell data with SIMO. Nat Commun 2025;16(1):1265. . 10.1038/s41467-025-56523-4

AI Summary AI Mindmap
PDF (7090KB)

7992

访问

0

被引

详细
导航
相关文章

AI思维导图

/

〈 〉