复方苦参注射液通过调控氧化应激缓解放射性肺损伤的机制研究

汪博洋; 孔德飞; 杨智茹; 康君; 孙德阳; 段秀梅; 金晶; 张霆宇; 刘清源; 尹辉; 李梢

doi:10.1016/j.eng.2025.09.018

工程（英文） ›› 2025, Vol. 55 ›› Issue (12) : 254 -268. DOI: 10.1016/j.eng.2025.09.018

研究论文

复方苦参注射液通过调控氧化应激缓解放射性肺损伤的机制研究

汪博洋 ^a ,
孔德飞 ^b ,
杨智茹 ^c ,
康君 ^c ,
孙德阳 ^a ,
段秀梅 ^d ,
金晶 ^e ,
张霆宇 ^a ,
刘清源 ^a ,
尹辉 ^b ,
李梢 ^a

作者信息 +

Revealing the Mechanisms of Compound Kushen Injection on Oxidative Stress Regulation in the Treatment of Radiation-Induced Lung Injury

Boyang Wang ^a ,
Defei Kong ^b ,
Zhiru Yang ^c ,
Jun Kang ^c ,
Deyang Sun ^a ,
Xiumei Duan ^d ,
Jing Jin ^e ,
Tingyu Zhang ^a ,
Qingyuan Liu ^a ,
Hui Yin ^b^,^* ,
Shao Li ^a^,^* ,

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摘要

放射性肺损伤（RILI）是肿瘤放射治疗过程中常见且临床上难以有效干预的并发症之一。复方苦参注射液（CKI）作为一种传统中药复方制剂，已广泛应用于放射相关疾病的治疗及肿瘤辅助治疗，并显示出一定疗效。然而，其在RILI中的作用机制及其作为肿瘤辅助治疗手段的分子基础仍有待系统阐明。本研究在优化既有统计方法的基础上，整合了CKI中活性成分的定量信息，构建了基于网络的整体靶点模型，并进一步发展出模块化生物网络框架，以解析CKI在RILI中的模块化调控机制。基于上述网络分析，本研究鉴定出CKI中具有关键作用的生物碱类成分，这些成分共同介导其对RILI的缓解效应。结合转录组学分析结果，本研究进一步证实氧化应激在CKI治疗RILI过程中处于核心调控地位。动物辐射模型实验表明，CKI通过多层级模块化调控，可显著缓解氧化应激、抑制炎症反应、调节免疫稳态并减少细胞凋亡，从而发挥整体治疗作用。机制研究显示，核因子E2相关因子2（NRF2）是CKI抗氧化效应的关键调控节点。CKI中的代表性生物碱成分苦参碱（matrine）和氧化苦参碱（sophoridine）能够与NRF2发生相互结合。CKI促进NRF2向细胞核转位，并激活其下游抗氧化通路[包括血红素加氧酶-1（HO-1）和醌氧化还原酶1（NQO1）]，从而有效抑制RILI中的氧化应激。进一步地，CKI通过该通路下调炎症相关因子的表达，包括白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）及诱导型一氧化氮合酶（iNOS），同时增强抗氧化酶[如超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX-4）]的活性，最终发挥对RILI的综合性保护作用。

Abstract

Radiation-induced lung injury (RILI) is a common complication of cancer radiotherapy, yet effective treatments remain elusive. Compound Kushen injection (CKI), a traditional Chinese medicine (TCM) formula, is widely used in clinical practice for treating radiation-related diseases and as an adjunct therapy for cancer and has demonstrated some effectiveness. However, the mechanisms underlying CKI intervention in RILI and its role in cancer adjunctive therapy remain unclear. In this study, we refined previous statistical approaches and successfully integrated quantitative data on the compounds in CKI. We constructed a network-based holistic target model and developed modular biological networks to explore the modular regulatory effects of CKI in RILI. Through this network-based analysis, we identified specific alkaloid components of CKI that contribute to its therapeutic effect in alleviating RILI. Furthermore, through transcriptomic analysis, we confirmed that oxidative stress plays a central role in the treatment of RILI by CKI. The modular regulatory effects of CKI have been validated in animal models of irradiation, demonstrating the ability of CKI to alleviate oxidative stress, reduce inflammation, regulate immune responses, and inhibit apoptosis. In addition, we demonstrated that nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2) serves as a key mediator of the antioxidant effects of CKI. Matrine and sophoridine, representative alkaloids in CKI, exhibit binding interactions with NRF2. CKI promotes the nuclear translocation of NRF2, and NRF2 activates its downstream targets, such as heme oxygenase-1 (HO-1) and NAD(P)H quinone dehydrogenase 1 (NQO1), to suppress oxidative stress in RILI. This, in turn, inhibits the expression of inflammatory molecules, including interleukin (IL)-6, tumor necrosis factor (TNF)-α, and inducible nitric oxide synthase (iNOS), while promoting the activity of antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase-4 (GPX-4), thereby exerting therapeutic effects on RILI.

关键词

放射性肺损伤 / 复方苦参注射液 / 转录组学 / 网络靶标 / 氧化应激

Key words

Radiation-induced lung injury / Compound Kushen injection / Transcriptomics / Network target / Oxidative stress

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汪博洋,孔德飞,杨智茹,康君,孙德阳,段秀梅,金晶,张霆宇,刘清源,尹辉,李梢. 复方苦参注射液通过调控氧化应激缓解放射性肺损伤的机制研究[J]. 工程（英文）, 2025, 55(12): 254-268 DOI:10.1016/j.eng.2025.09.018

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1 引言

放射性肺损伤（RILI）是放射治疗过程中最常见的并发症之一，其典型特征包括炎症反应、纤维化进展以及肺功能受损。其发生发展涉及多重病理过程，包括炎症信号激活、氧化应激增强以及免疫细胞浸润，最终导致细胞损伤与组织重塑[1‒3]。临床上，RILI可表现为急性放射性肺炎，并进一步进展为不可逆的慢性肺纤维化。放射治疗在肺癌管理中具有核心地位，尤其适用于无法手术切除的局部肿瘤患者[4‒6]。然而，尽管放疗能够有效杀伤肿瘤细胞，但其对正常肺组织的非选择性损伤亦不可避免，从而诱发RILI [7‒9]。更为复杂的是，放疗诱导的免疫与炎症反应在抗肿瘤与组织损伤之间形成“双刃剑”效应，使肺癌治疗与RILI干预相互交织，显著增加临床管理难度。

复方苦参注射液（CKI）是一种以传统中药苦参（Kushen, KS; Sophora flavescens）和白土苓（Baitulin, BTL; Heterosmilax japonica）为主要成分的中药注射剂，自1995年上市以来已广泛应用于临床[10‒13]。CKI具有清热利湿、凉血解毒、散结止痛等功效，主要用于缓解肿瘤相关疼痛及出血症状。在临床实践中，CKI不仅被用于放射性损伤的治疗[14‒18]，也广泛作为多种肿瘤的治疗及辅助治疗手段[19‒22]。然而，其在放射相关疾病中的分子作用机制，尤其是在RILI中的系统性调控模式，仍未被阐明。

网络药理学（network pharmacology）作为一门交叉学科，旨在解析药物-靶点-疾病之间的复杂相互作用网络，从系统层面揭示潜在治疗机制并优化药物研发策略[23‒25]。其中，“网络靶标”（network target）理论作为中医药网络药理学的核心概念之一，被提出用于应对中药多成分、多靶点、多通路的系统复杂性问题[26‒30]。通过整合系统生物学与多组学技术，该理论能够在全基因组尺度上预测中药复方的作用靶点，并构建多层级的模块化生物网络，从而为中药作用机制的解析提供整体性理论框架。

本研究在既有方法基础上对中药整体靶点的统计建模策略进行了改进[31]，通过引入化合物定量检测数据，提高了模型对实际成分贡献的刻画能力。基于此改进方法及CKI的定量成分信息，本研究构建了CKI的整体靶点模型。进一步结合转录组学数据，本研究系统预测了CKI干预RILI的关键分子机制，并在辐射动物模型中进行了实验验证。

2 材料及方法

2.1 CKI治疗RILI的网络靶标分析

2.1.1 加权整体靶点模型

基于山西振东制药股份有限公司既往已发表及未发表研究数据，本研究共收集到CKI的107种化学成分，包括42种黄酮类、30种生物碱类、5种糖类、4种三萜皂苷类、2种酚苷类、2种苯丙素类化合物以及22种未分类成分。同时获取了多类成分（如生物碱、糖类及黄酮类）的定量分析结果，以及部分主要生物碱的精确定量数据。所有化合物均在PubChem数据库中进行结构注释。随后，基于“网络靶标的中西药智能定量分析技术与系统”（UNIQ）中的核心算法drugCIPHER [24,32]，对CKI中每种化合物进行全基因组尺度的生物效应谱预测，从而构建其潜在作用靶点空间。

针对中药复方这一复杂系统，既往研究提出了一种整体靶点预测的统计策略[31]。为进一步整合实际检测得到的成分定量信息，本研究在此基础上对该方法进行了改进。对于已知部分化合物含量的情况，本研究引入加权采样策略以更真实地反映各成分在整体作用中的贡献。设某中药或复方包含总计n种化合物，其中有m种化合物的含量比例已知，记为

p k

。在给定采样次数N的情况下，通过概率采样构建新的复方组成，其权重定义如下：

W e i g h t k = p k, k ∈ m 1 - ∑ k ∈ m p k n - m, k ∉ m

进一步地，若仅已知某一类化合物（而非单一化合物）的总体含量比例

P k

，则属于该类别的每个化合物按照类别内均分权重参与采样，其权重定义为

W e i g h t k = P k m k, k ∈ m 1 - ∑ k ∈ m p k n - m, k ∉ m

式中，

m k

表示化合物k所属类别中的化合物总数量。

在此基础上，将上述采样过程与整体靶点模型相结合，对构建得到的复方组成（视为包含n个化合物）进行全局靶点计算，从而获得考虑定量信息的整体靶点谱。此外，对于中药复方中某一特定类别的化合物，本研究同样应用该策略计算其整体靶点分布，其概率形式定义为

p r K = k = ∑ A ∈ F k ∏ i ∈ A p i ∏ j ∈ A c 1 - p j

式中，

p r K = k

表示第k种成分靶点谱中某靶点出现的概率；

F k

表示由k种成分构成的所有子集集合；A为其中任一子集，

A c

为其补集；

p i

和

p j

分别表示对应成分预测靶点谱中相应靶点出现的概率。

2.1.2 网络靶标分析

为解析RILI的潜在发病机制，本研究系统检索相关文献并整合分子证据。具体而言，从基因表达综合（GEO）数据库获取RILI相关数据集GSE206426，进一步结合比较毒理基因组学数据库（CTD）[33]、Gendoo算法[34]以及既有研究报道[1‒3]，系统收集RILI相关分子。首先，本文通过富集分析识别RILI相关通路机制，以及CKI及其成分可能调控的通路或生物过程。随后，结合文献证据保留交集通路或生物过程，用于构建CKI治疗RILI的模块化调控效应。基于这些通路或生物过程中的关键分子，以及CKI在相应通路中的整体靶点，进一步构建多层级生物网络。

具体而言，CKI整体靶点及RILI相关分子的京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体论（GO）富集分析采用R包clusterProfiler [35]完成。多层级生物网络基于既往报道的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建 [36]。GSE206426的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据采用R包Seurat [37]进行分析，用于识别两种动物模型（C57BL/6N和C3H/HeN小鼠）中对照组与辐射组之间的差异表达基因（DEGs）。各化合物的类药性定量评估（QED）评分通过rdkit中的QED函数计算。RILI相关分子与特定化合物预测靶点之间的相似性，则采用R包GoSemSim [39]中实现的网络算法[38]进行预测。

2.2 小鼠辐射模型的建立

2.2.1 实验动物

选取8~10周龄、体重20~25 g的野生型（WT）雄性C57BL/6小鼠，饲养于无特定病原体（SPF）环境中。实验动物购自广东省医学实验动物中心，许可证号为SCXK（粤）2022-0002。动物饲养于广东药科大学实验动物中心，动物伦理批准号为GDPULACSPF2022234。饲养条件为室温(23 ± 2) ℃，相对湿度40%~52%，12 h光照/12 h黑暗循环，小鼠可自由摄食和饮水。

2.2.2 实验动物分组

C57BL/6小鼠随机分为以下6组（每组10只）：非辐射对照组（CON组）、15 Gy辐射模型组（NC组）、CKI低剂量组（CKI-L组）、CKI中剂量组（CKI-M组）、CKI高剂量组（CKI-H组）以及氨磷汀阳性对照组（150 mg·kg^-1，ALT组）。

2.2.3 药物配制

NC组给予100 μL 0.9% NaCl；CKI-L组给予75 μL 0.9% NaCl + 25 μL CKI；CKI-M组给予50 μL 0.9% NaCl + 50 μL CKI；CKI-H组给予100 μL CKI；ALT组给予100 μL氨磷汀溶液（150 mg·kg^-1）。

2.2.4 小鼠肺部辐射模型建立

小鼠经腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉后，取仰卧位固定于X射线生物辐照仪上。采用定制铅板遮挡头颈部、腹部及四肢，仅暴露肺部区域，暴露范围为3 cm × 2 cm。给予15 Gy单次肺部照射。照射时间根据剂量率和照射速度计算，以确保剂量准确；照射参数为160 kV、25 mA，默认剂量率为6.031 Gy·min^-1，照射时间为149 s。

2.3 样本采集

血液采集：处死C57BL/6小鼠后，通过摘眼球法采血。待血液凝固后分离血清，并保存于-80 ℃，用于后续酶联免疫吸附测定（ELISA）及超氧化物歧化酶（SOD）检测。

肺组织采集：将小鼠仰卧固定于手术台上，以75%医用酒精棉球消毒胸部皮肤。剪开胸骨暴露胸腔，小心取出肺组织并进行肉眼观察。左肺上叶固定于4%多聚甲醛中，用于组织病理学检测；左肺下叶及右肺组织迅速置于液氮中冻存。

2.4 肺组织病理学检测

2.4.1 肺组织石蜡切片制备

肺组织置于4%多聚甲醛中，于4 ℃固定24 h以上。随后用自来水冲洗12~16 h。经梯度脱水后，组织依次置于50%、70%、80%和90%乙醇中各30 min，再依次置于95%乙醇I、95%乙醇II、100%乙醇I和100%乙醇II中各1 h。之后，组织分别置于二甲苯I和二甲苯II中透明各1 h。石蜡包埋时，组织依次置于低熔点、中熔点和高熔点石蜡中各1 h，随后在石蜡包埋机中制备蜡块。

使用切片机将石蜡包埋组织切成3~5 μm厚切片。修整蜡块至表面平整后进行切片，切下的组织片置于42 ℃水浴中展片。随后将切片贴附于预先标记的载玻片上，自然晾干后置于37 ℃烘箱中烘干，以去除多余水分。

2.4.2 苏木精-伊红（H&E）染色

组织切片经脱蜡和梯度复水后，用苏木精染液染色3~5 min，随后分别用自来水和蒸馏水冲洗1 min。之后用伊红染液染色1 min，并用促染液短暂冲洗。染色完成后，于组织表面滴加中性树胶并轻轻覆盖盖玻片，避免产生气泡。最后，在显微镜下观察肺组织形态学改变。

2.4.3 肺组织免疫荧光染色

石蜡切片经二甲苯和梯度乙醇脱蜡复水后，置于含柠檬酸和枸橼酸三钠的柠檬酸盐缓冲液中，于压力锅内加热15 min进行抗原修复。切片冷却至室温后，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。随后以正常山羊血清室温封闭45 min。加入一抗后，于4 ℃孵育过夜。次日，切片经0.05% Tween 20-PBS（PBST）洗涤后，避光加入二抗并于37 ℃孵育1 h。随后以4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染5 min，洗涤后加入抗荧光淬灭封片剂封片。图像采用倒置荧光显微镜采集。

2.5 肺组织测序及分析

2.5.1 样本检测

为确保用于转录组测序的样本质量合格，对提取的总RNA纯度、浓度及完整性进行严格检测。RNA质量检测方法如下：①采用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Scientific，美国）检测RNA纯度和浓度；②采用Agilent 2100（Agilent Technologies，美国）/LabChip GX（Perkin-Elmer，美国）精确检测RNA完整性。

2.5.2 文库构建

样本质量合格后进行文库构建。主要流程如下：①使用带有oligo(dT)的磁珠富集真核信使RNA（mRNA）；②采用片段化缓冲液（fragmentation buffer）对mRNA进行随机片段化；③以mRNA为模板合成第一链和第二链互补DNA（cDNA），并进行cDNA纯化；④对纯化后的双链cDNA进行末端修复、加A尾并连接测序接头，随后采用AMPure XP磁珠进行片段大小筛选；⑤最后经PCR扩增获得cDNA文库。

2.5.3 文库质控

文库构建完成后，首先采用Qubit 3.0荧光计进行初步定量，确保文库浓度不低于1 ng·μL^-1。随后使用Qsep400高通量分析系统检测文库插入片段大小。确认插入片段符合要求后，采用定量聚合酶链反应（qPCR）精确定量文库有效浓度，要求有效浓度大于2 nmol·L^-1，以确保文库质量满足测序要求。

2.5.4 测序

质控合格的文库采用高通量测序平台进行双端150 bp（PE150）测序。

2.5.5 分析流程

测序完成后，原始数据通过BMKCloud提供的生物信息学流程进行处理。首先对原始数据进行过滤，获得高质量清洗数据（clean data）；随后将其比对至指定参考基因组，获得映射数据（mapped data）。进一步开展文库质量评估、结构水平分析、差异表达分析、基因功能注释和功能富集分析。此外，基于BMKCloud平台开展转录组数据深度挖掘和交互式分析，包括基因检索与绘图、特有及共有基因分析、PPI网络构建、基因集富集分析（GSEA）、差异基因共表达分析以及加权基因共表达网络分析（WGCNA）。

2.6 核因子E2相关因子2（NRF2）抑制条件下小鼠辐射模型的建立

2.6.1 实验动物分组

C57BL/6小鼠随机分为以下5组（每组10只）：CON组、NC组、CKI-H组、溶剂组[二甲基亚砜（DMSO）组]以及ML385组（NRF2抑制剂组）。

2.6.2 药物配制

NC组给予100 μL 0.9% NaCl；CKI-H组给予100 μL CKI；溶剂组给予5 μL DMSO + 40 μL聚乙二醇（PEG）300 + 5 μL Tween 80 + 50 μL生理盐水；ML385组给予5 μL储备液（100 mg ML385溶于0.76 mL DMSO）+ 40 μL PEG 300 + 5 μL Tween 80 + 50 μL生理盐水。

2.6.3 肺组织RNA提取及实时荧光qPCR分析

采用TRIzol试剂提取肺组织总RNA。取约50 mg肺组织置于500 μL TRIzol中，静置5 min后使用组织匀浆器充分匀浆，直至无明显组织碎片。随后加入100 μL氯仿，涡旋20 s并手动颠倒混匀。样本置冰上静置分层后，于4 ℃、12 000 r·min^-1离心15 min。小心吸取上层无色水相并转移至新的Eppendorf（EP）管中。随后加入500 μL预冷75%乙醇，涡旋混匀后，于4 ℃、7500 r·min^-1离心5 min，弃上清。沉淀以1 mL新鲜配制的75%乙醇-焦碳酸二乙酯（DEPC）水混合液重悬，涡旋至沉淀悬浮后再次于4 ℃、7500 r·min^-1离心5 min。弃上清后，将EP管倒置于滤纸上干燥3~5 min。最后加入10~25 μL DEPC水溶解RNA，并使用分光光度计检测RNA纯度和浓度。RNA样本保存于-80 ℃。引物序列详见表1。

2.7 肺组织免疫印迹分析

采用组织裂解液和苯甲基磺酰氟（PMSF）按1∶10∶0.1比例提取肺组织总蛋白。组织在冰上使用电动研磨器充分匀浆，并裂解30 min。匀浆液转移至新的1.5 mL EP管中，采用二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度。取等量蛋白（30 μg）与5×上样缓冲液混合，煮沸15 min后保存于-80 ℃。免疫印迹（Western blot）检测时，蛋白样本经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，随后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。PVDF膜经甲醇活化后置于转膜液中浸泡15 min。电泳结束后，根据目标蛋白分子量切取相应凝胶，并在冰浴条件下以320 mA转膜45 min。转膜完成后，膜用洗涤液洗涤3次，每次5 min，并以8%脱脂奶粉封闭2 h。加入一抗后，于4 ℃孵育过夜。洗涤后加入二抗，于室温孵育1 h。随后加入增强化学发光（ECL）底物反应30 s，并使用荧光成像系统进行显影分析。

血清SOD水平采用SOD检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）检测。血清样本于冰上解冻后加入标记好的离心管。检测孔设置为空白孔、对照孔、样本孔和样本空白孔。空白孔加入20 μL蒸馏水和20 μL酶稀释液；对照孔加入20 μL蒸馏水和20 μL酶工作液；样本孔加入20 μL血清样本和20 μL酶工作液；样本空白孔加入20 μL血清样本和20 μL酶稀释液。各孔加入200 μL SOD检测底物后，于37 ℃孵育20 min。随后使用酶标仪在450 nm处测定吸光度，并计算SOD水平。

2.8 生物层干涉（BLI）检测

采用Octet RED96e系统（Sartorius，德国）检测蛋白-小分子之间的结合动力学和亲和力。将NRF2蛋白稀释至30~50 μg·mL^-1，并固定于谷胱甘肽S-转移酶（GST）传感器上。随后对传感器进行封闭和洗涤，并转移至含不同浓度CKI待测化合物的动力学缓冲液孔中。程序设置采用系统默认的蛋白-小分子结合检测模式。结合信号采集后，使用OctetHT V10.0软件进行结果分析。R²用于评估拟合优度，数值越接近1表示拟合效果越好。

2.9 统计学分析

实验结果采用GraphPad Prism 8.0软件绘图。所有数据均以均值 ± 标准误（SEM）表示。两组间比较采用Student t检验；三组及以上组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。p小于0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 CKI化学成分鉴定及基于定量检测的整体靶点建模

本研究旨在系统解析CKI干预RILI的潜在机制。本文首先整合CKI的化学成分鉴定与定量检测结果，并基于加权策略构建其网络靶标模型。随后，通过构建多层级模块化生物分子网络，解析CKI在RILI不同病理阶段中的干预作用，并进一步结合转录组测序及小鼠辐射模型进行实验验证。

为从分子层面预测CKI对RILI的潜在影响，本研究系统整理了山西振东制药股份有限公司已发表及未发表的CKI指纹图谱和含量测定研究数据[40‒42]，共获得107种化学成分。其中包括42种黄酮类、30种生物碱类、5种糖类、4种三萜皂苷类、2种酚苷类、2种苯丙素类化合物以及22种未分类化合物[图1（a）]。同时，本文进一步分析了BTL和KS的成分谱，以全面刻画CKI来源成分的类别构成。定量分析显示，CKI中含量较高的成分主要为糖类和生物碱类，分别占总糖含量的42.71%和总生物碱含量的18.90%。在生物碱类成分中，氧化苦参碱和苦参碱含量最高，分别为42.96%和15.20%；其次为氧化槐果碱（13.45%）、槐定碱（5.02%）和槐果碱（4.89%）[图1（b）]。随后，所有化合物均在PubChem数据库中进行结构信息注释。

基于此前在UNIQ系统中开发的算法drugCIPHER [32]，本团队预测了每一种鉴定化合物在全基因组尺度上的潜在生物效应。在此基础上，本研究进一步采用适用于定量化合物检测数据的改进统计方法，分别计算CKI、KS和BTL成分的整体靶点。本策略使CKI中各成分的定量信息能够被纳入整体靶点建模过程，从而更准确地反映复方整体作用特征[图1（c）]。值得注意的是，通路分析显示，CKI的主要作用靶点富集于信号转导、免疫系统调节和能量代谢等关键生物过程[图1（d）]。

3.2 网络靶标分析揭示CKI对RILI的模块化调控效应

为深入解析RILI的发病机制，本研究系统回顾了相关文献并整合分子证据。具体而言，本研究从GEO数据库获取RILI相关数据集GSE206426，并结合比较CTD [33]、Gendoo算法[34]以及既往研究报道[1‒3]，系统收集RILI相关分子。对这些RILI相关分子进行KEGG富集分析[43]后发现，RILI与免疫反应、炎症反应和细胞凋亡等过程密切相关[图1（e）]。

基于文献证据，本研究将RILI的病理进程概括为3个主要阶段：早期阶段以DNA损伤为核心事件；急性阶段主要表现为放射性肺炎发生；晚期阶段则以肺纤维化形成为主要特征。从初始DNA损伤和炎症激活，到后期不可逆纤维化进展，这一复杂病理过程受到氧化应激、免疫细胞浸润、炎症反应及促纤维化因子等多重因素共同驱动，最终导致RILI由急性肺炎向慢性肺纤维化转化。

基于CKI预测整体靶点及RILI病理机制的整合分析，本研究发现CKI主要通过6个关键模块调控RILI进程，包括早期DNA损伤、活性氧（ROS）相关过程、免疫反应、肺炎阶段的炎症反应、纤维化阶段的成纤维细胞活化和细胞外基质（ECM）重塑[附录A图S1（a）]。进一步分析显示，KS和BTL在ROS水平调控及免疫相关通路中可能具有协同作用，如氧化应激反应和T细胞活化调节[图2（a）]。

在CKI不同类别成分中，生物碱类成分在上述通路中表现出主导作用，其在多个通路中的富集得分显著较高[图2（b）]。此外，黄酮类、酚苷类和三萜皂苷类成分也对多个调控模块具有重要贡献。基于这些发现，本文进一步构建了三个阶段特异性生物网络，用于表征CKI在RILI不同病理阶段中的调控作用[图2（c）、附录A图S1（b）和（c）]。值得注意的是，在放射性肺炎阶段，CKI对免疫反应、炎症反应及ROS相关过程的调控可能构成其治疗RILI的关键作用环节。这些过程之间高度耦合：免疫细胞可在炎症过程中产生ROS，而ROS又进一步放大炎症反应并加重组织损伤。在该网络中，生物碱、黄酮类和三萜皂苷类成分可能通过作用于多个模块中的关键分子，共同发挥协同调控效应。

为进一步获得RILI相关分子机制的系统性证据，本文分析了scRNA-seq数据集GSE206426 [图2（d）]。KEGG富集分析显示，单细胞数据中鉴定的差异表达基因显著富集于ROS相关模块中的生物过程，包括氧化应激反应和ROS调控等[图2（e）]。多个参与ROS和氧化应激调控的关键分子[核因子红细胞系2相关因子2（NFE2L2）、NAD(P)H醌氧化还原酶1（NQO1）、超氧化物歧化酶1（SOD1）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物还原蛋白1（PRDX1）以及硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）]，在两种动物模型的正常组与辐射组之间均表现出一致的表达差异[图2（f）]。随后，我们整合RILI的分子机制、CKI及其成分的整体靶点，构建了多层级网络，用以刻画不同CKI成分对3个核心模块（ROS相关过程、免疫反应和炎症反应）的潜在调控作用[图2（g）]。在所有CKI成分中，生物碱类成分由于能够广泛影响多个调控模块，被认为是最具影响力的成分类别；同时，黄酮类和酚苷类成分也在多个关键过程中发挥重要调节作用。

此外，我们进一步从CKI成分中预测关键化合物组合，综合考虑两个指标：一是通过QED评分评估的类药性，二是基于网络算法[38]预测的化合物靶点与RILI分子机制之间的接近程度。在最重要的候选化合物中，生物碱类成分同时表现出较高的QED评分和较高的网络接近性评分[图2（h）]，提示其可能是CKI调控RILI的主要药效物质基础。研究进一步根据网络接近性评分排名前10的化合物进行分析，鉴定出4种具有代表性的生物碱成分：苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱和氧化槐果碱。这些成分不仅与RILI相关机制具有较高网络接近性，同时具有较好的类药性和较高的QED评分[图2（i）]。最后，为验证预测得到的关键化合物组合，本研究根据各生物碱的质量百分比配制混合溶液，其中包括苦参碱（3.39 mg·mL^-1）、氧化苦参碱（9.58 mg·mL^-1）、槐定碱（1.12 mg·mL^-1）和氧化槐果碱（3 mg·mL^-1）。动物实验中，H&E染色结果显示，在第7天和第14天，正常小鼠肺组织保持清晰且排列有序的肺泡结构。相比之下，15 Gy辐射模型组（NC组）小鼠肺泡壁出现明显炎症细胞浸润，主要包括中性粒细胞和单核巨噬细胞；肺泡壁发生不同程度塌陷，伴随肺组织损伤、肺泡腔消失，以及支气管上皮细胞轻至中度变性和排列紊乱。经生物碱组合[图2（j）、附录A图S1（d）和（e）]或CKI处理后，小鼠肺组织结构相对完整，炎症细胞浸润减少，肺泡结构更加清晰且完整。其中，CKI-H组保护效应最为明显，呈现出剂量依赖性的治疗趋势。

3.3 转录组学解析揭示CKI干预RILI的核心调控机制

为系统解析CKI在RILI中的分子作用机制，本文对辐射模型小鼠及辐射后经CKI干预的小鼠进行了转录组测序分析[附录A图S2（a）]。采用DESeq2算法筛选DEGs [附录A图S2（b）、（c）]，共鉴定出175个在干预前后发生显著变化的基因[图3（a）]。辐射组（NC组）相较于对照组（CON组），共检测到371个下调基因和912个上调基因[图3（b）、附录A图S2（d）]。而在CKI干预后，235个基因表达水平下调，23个基因表达水平上调[图3（c）、附录A图S2（e）]，这提示CKI对辐射诱导的转录异常具有显著调控作用。

GO富集分析显示，辐射组DEGs显著富集于免疫反应、炎症反应、淋巴细胞活化与分化以及白细胞活化与分化等过程[图3（d）、附录A图S2（f）]。相比之下，CKI干预后，DEGs主要富集于先天免疫反应激活及对干扰素α（IFN-α）、IFN-β和IFN-γ的细胞响应[图3（e）、附录A图S2（g）]。KEGG通路分析进一步揭示关键调控通路的变化。在辐射条件下，DEGs主要富集于细胞因子-受体相互作用、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路以及磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信号通路；而CKI干预后，DEGs主要富集于（MAPK）信号、细胞因子-受体相互作用及Janus激酶-信号转导及转录激活蛋白（JAK-STAT）信号通路。此外，自然杀伤细胞介导的细胞毒性和NOD样受体信号通路等免疫相关通路也显著富集[附录A图S3（a）、（b）]。

为进一步评估这些转录变化的功能意义，本文对DEGs进行了GSEA分析。结果显示，与抗氧化活性相关的分子功能在显著富集的GO和KEGG通路中占据主导地位[图3（f）]，先天免疫反应等生物过程则显著被抑制。进一步分析表明，在辐射条件下，炎症反应、免疫反应及NOD样受体信号通路显著激活[附录A图S3（c）]；而在CKI干预后，这些免疫相关过程均显著下调[附录A图S3（d）]。

综合上述结果，CKI在RILI中的作用呈现出多模块调控特征，涉及免疫、炎症、氧化应激及细胞命运调控等多个层面。其中，抗氧化应激相关功能在转录组及计算预测中均表现为最显著的调控方向，提示其可能是CKI发挥治疗作用的核心机制。

3.4 CKI对RILI的调控以抗氧化应激为核心

辐射后7 d内，小鼠体重明显下降，但随后逐渐恢复。与NC组相比，CKI-H及阳性对照组显著促进体重恢复（p < 0.01）[图4（a）]。ELISA检测显示，NC组血清中TNF-α和IL-6水平显著升高（p < 0.01），而CKI处理可在7 d和14 d内以剂量依赖方式降低上述炎症因子水平，其中CKI-H组效果最显著[图4（b）]。

在氧化应激层面，脂质过氧化产物4-羟基壬烯醛（4-HNE）在辐射模型小鼠肺组织中显著升高，而CKI处理可显著降低其表达，且中高剂量效果更优[图4（c）、附录A图S4（a）和（b）]。类似地，DNA氧化损伤标志物8-羟基-2'-脱氧鸟苷（8-OHdG）在NC组显著升高，CKI干预后呈剂量依赖性下降[图4（d）、附录A图S4（c）和（d）]。炎症相关指标方面，髓过氧化物酶（MPO）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）水平在NC组显著升高，提示炎症反应增强。免疫荧光分析显示，iNOS⁺F4/80⁺细胞显著增加，而CKI处理显著降低该细胞群比例[图4（d）]。

在转录水平上，NC组iNOS mRNA表达升高，而酵母提取物诱导巨噬细胞蛋白1（YM-1）和精氨酸酶1（ARG-1）表达降低；CKI干预后，iNOS下降而YM-1和ARG-1升高，提示其可能促进巨噬细胞向抗炎M2表型极化[图4（e）]。此外，炎症因子IL-1β、IL-6及TNF-α在NC组显著升高，而CKI可显著抑制其表达；同时，IFN-γ下降而抗炎因子IL-10上升[图4（f）]。在细胞凋亡方面，CKI表现出抗凋亡作用，降低BAX表达并上调BCL-2 [图4（g）]。

在抗氧化体系方面，关键抗氧化酶NQO1、血红素氧合酶1（HO-1）及谷光甘肽过氧化物酶1（GPX-1）在NC组显著下降，而CKI处理可显著恢复其表达[图4（h）]。mRNA水平检测亦显示NQO1和HO-1表达随CKI剂量增加而显著上调[图4（i）]。

综上，结合转录组数据及分子实验验证，CKI通过调控氧化应激、炎症反应、免疫稳态及细胞凋亡等多个模块发挥作用，其中抗氧化应激调控构成其核心作用机制，在放射性肺炎阶段尤为关键。

3.5 NRF2介导CKI的抗氧化应激调控作用

基于前述结果，本文进一步聚焦于氧化应激关键调控因子——NRF2 [44]。组织学分析显示，CON组肺组织结构完整，而NC组出现明显炎症细胞浸润、肺泡塌陷及结构紊乱。CKI-H处理显著改善肺组织结构，而NRF2抑制剂ML385则明显削弱该保护作用[图5（a）]。

在分子水平上，BLI实验表明，CKI中关键生物碱成分苦参碱和槐定碱可与NRF2发生弱结合（解离常数K_d约为10^-4 mol·L^-1）。同时，CKI可促进NRF2向细胞核转位，而ML385则显著抑制该过程（附录A图S5）。

蛋白水平检测显示，NC组中抗氧化酶NQO1和HO-1表达显著降低，而CKI-H处理显著恢复其表达（p < 0.01）；ML385处理则逆转该效应[图5（b）]。

在转录水平上，CKI降低iNOS表达并上调ARG-1表达，而ML385进一步加剧炎症表型[图5（c）]。同时，NQO1、HO-1及GPX-4等抗氧化基因在CKI处理后显著上调，而ML385则抑制其表达。

氧化应激标志物4-HNE和8-OHdG在NC组显著升高，CKI显著降低其水平，而ML385处理则再次升高这些指标[图5（d）]。

在炎症方面，MPO表达及iNOS⁺F4/80⁺细胞数量在NC组显著增加，CKI可显著抑制该变化，而ML385则逆转该效应[图5（e）、附录A图S6（c）和（d）]。IL-6和TNF-α在CKI处理后显著降低，而ML385显著恢复其升高趋势[图5（f）、（g）]。此外，抗氧化酶SOD活性在NC组显著降低，而CKI处理可恢复其水平；ML385则再次降低SOD活性[图5（h）]。

综上，这些结果明确表明NRF2在CKI发挥抗氧化和抗炎保护作用中起核心介导作用[图5（i）]。CKI通过激活NRF2信号通路，协调调控氧化应激与炎症反应，从而有效缓解RILI。这一发现提示，靶向NRF2的调控可能构成CKI治疗放射性肺损伤的关键机制基础，并为其临床应用提供重要理论支持。

4 讨论与结论

RILI是肺癌放射治疗中常见的并发症之一[7‒9]。其病理过程通常包括早期DNA损伤、放射性肺炎阶段的氧化应激、炎症反应与免疫改变，以及后期纤维化阶段的细胞外基质沉积和组织重塑[1‒3]。CKI是由苦参和白土苓组成的中药复方制剂，已广泛用于放射性损伤及多种肿瘤的治疗和辅助治疗[45‒50]。既往临床报道提示CKI对RILI具有一定疗效[51‒54]，但其作用机制尚未被系统阐明。本研究通过网络靶标分析，采用整合化合物定量信息的改进整体靶点模型，系统解析了CKI治疗RILI的模块化调控机制。通过构建多层级生物网络，本文描绘了CKI干预RILI的分子调控图谱，鉴定出生物碱类成分是其关键活性成分，并明确氧化应激是CKI发挥治疗作用的核心调控轴。进一步的辐射动物模型验证表明，NRF2及其下游分子HO-1和NQO1在CKI调控氧化应激、免疫反应和炎症反应过程中发挥关键作用。本文整合机器学习、转录组学和实验验证的研究策略，为理解CKI的治疗潜力提供了新的系统性证据。

NRF2是RILI中调控氧化应激的重要介质[44]，也是连接抗氧化防御与炎症抑制的关键转录因子[55‒56]。NRF2被激活后转位进入细胞核，并与多种解毒及抗氧化反应相关基因启动子区域中的抗氧化反应元件（AREs）结合，从而驱动下游保护性基因表达。其中，HO-1和NQO1是NRF2通路中两个关键效应分子，能够保护细胞免受氧化损伤[57‒59]。HO-1可催化血红素分解为胆绿素、游离铁和一氧化碳，这些产物具有抗氧化和抗炎作用；NQO1则通过催化醌类还原，减少有害ROS生成，从而维持细胞氧化还原稳态。本研究显示，CKI能够调控NRF2、HO-1和NQO1，并影响SOD、4-HNE和8-OHdG等氧化应激相关指标，表明其可有效抑制RILI中的氧化损伤及其继发炎症反应。NRF2被抑制后，CKI对TNF-α、iNOS和IL-6等分子的抑制作用明显减弱，提示这些炎症分子很可能位于CKI-NRF2调控轴的下游。此外，CKI还可调节IL-1β、YM-1、ARG-1、IL-10和IFN-γ等与炎症和免疫调节密切相关的分子，并通过调控BAX和BCL-2发挥抗凋亡和细胞保护作用。

本研究进一步通过NRF2抑制实验和核转位实验确认，NRF2是CKI治疗RILI的关键介导因子。NRF2激活可促进抗氧化酶和解毒蛋白表达，从而减轻辐射诱导的氧化损伤并抑制炎症反应。已有研究表明，NRF2活化能够通过增强细胞抗氧化能力、抑制促炎细胞因子产生，缓解RILI相关炎症、纤维化和细胞凋亡[54]。此外，NRF2还可调节受辐射肺组织中的巨噬细胞功能，从而减轻放射性肺纤维化并促进组织修复。因此，NRF2可能是RILI干预中的重要治疗靶点，NRF2激活剂或调节剂有望为放射性肺损伤提供新的治疗策略[60‒61]。值得注意的是，NRF2的保护作用并不局限于肺组织。已有研究显示，NRF2可通过降低ROS水平并增加角质层厚度，减轻放射性口腔黏膜炎[62]；也可通过丙酮酸激酶M2（PKM2）/NRF2/GPX-4通路缓解海马神经元铁死亡[63]；还可通过枸杞多糖-糖蛋白介导的NRF2激活，保护电离辐射下的上皮屏障完整性[64]。这些证据进一步支持NRF2作为放射损伤防护核心调控节点的广泛意义。

此外，本研究检测了CKI关键成分与NRF2之间的结合能力。BLI结果显示，槐定碱和苦参碱可与NRF2发生弱结合，结合浓度约为100 μmol·L^-1。此类弱结合可能是中药多成分体系中的常见现象。一方面，这可能源于天然产物自身的结构特征；另一方面，这类成分在作用于多个靶蛋白时，可能更多依赖非共价结合形式的变构调节[65]。这种非共价变构作用有利于小分子从蛋白中解离，避免持续性过度激活或抑制所带来的潜在不良效应。因此，这一作用模式也可为未来药物开发提供一定理论参考。

本研究仍存在一定局限性。首先，在化合物数据收集方面，本研究仅获得了部分生物碱成分的精确定量检测数据；对于其他生物碱或不同类别化合物，只能获得其总量信息，如总糖和总黄酮含量。尽管如此，本文所提改进后的策略通过基于权重的大规模随机采样，在一定程度上弥补了定量信息不足可能带来的误差。相比既往模型，本方法能够更充分整合已有定量数据，从而提高整体靶点预测的准确性。

综上，本研究为CKI等中药复方的机制研究提供了一个整合性研究范式，即将化合物信息、定量检测结果、转录组学技术与动物实验验证相结合。基于该范式，本研究构建了以氧化应激、免疫和炎症调控为核心的模块化生物网络，系统阐明了CKI干预RILI的潜在机制。CKI通过靶向作用NRF2并调控HO-1和NQO1等下游分子，一方面抑制氧化应激并调节SOD、4-HNE等氧化损伤相关指标；另一方面进一步影响TNF-α、IL-6和iNOS等免疫炎症相关分子，从而发挥抗炎、免疫调节和组织保护作用。

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Received	Accepted	Published
2025-04-15	2025-09-24	2025-12-01
Issue Date
2025-11-21

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