羧基酯脂肪酶结合脂肪酸合成酶治疗代谢功能障碍相关脂肪性肝炎

宋阳 ,  钟巍 ,  刘焯晞 ,  张雅婷 ,  官华宇 ,  谢茗旭 ,  夏芷君 ,  首第文 ,  周永健 ,  许鸿志 ,  于君 ,  张翔

工程（英文） ›› 2024, Vol. 41 ›› Issue (10) : 214 -227.

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工程（英文） ›› 2024, Vol. 41 ›› Issue (10) : 214 -227. DOI: 10.1016/j.eng.2024.04.018
研究论文

羧基酯脂肪酶结合脂肪酸合成酶治疗代谢功能障碍相关脂肪性肝炎

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Carboxyl Ester Lipase Protects Against Metabolic Dysfunction-Associated Steatohepatitis by Binding to Fatty Acid Synthase

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摘要

羧基酯脂肪酶（CEL）是一种重要的脂质代谢相关酶，在肥胖小鼠中高频突变。本文旨在阐明CEL在代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）中的作用、分子机制以及治疗潜力。我们采用胆碱缺乏高脂饮食（CD-HFD）喂养16周，或甲硫氨酸和胆碱缺乏饮食（MCD）喂养3周，诱导肝细胞特异性基因（Cel）敲除（Cel ΔHEP）小鼠和野生型（WT）同窝小鼠发生MASH，并通过液相色谱-质谱联用技术和共免疫沉淀法确定CEL的下游靶点。利用CEL腺相关病毒8型（AAV8）对CD-HFD/MCD饮食诱导WT小鼠进行尾静脉注射，以诱导CEL在肝脏中特异性过表达。我们观察到，在CD-HFD或MCD诱导的MASH小鼠中，CEL蛋白水平明显降低。与WT同窝小鼠相比，喂以CD-HFD或MCD的Cel ΔHEP小鼠表现出明显的肝脏脂肪变性、炎症、脂质过氧化和肝损伤，同时伴随肝脏核因子活化B细胞κ轻链增强子（NF-κB）激活增强。与此一致，敲低小鼠原代肝细胞和AML12肝细胞系中的Cel加重了脂质积累和炎症，而CEL的过表达则产生了相反的效果。从机制上看，CEL直接结合脂肪酸合成酶（FASN），导致FASN的SUMO化修饰减少，从而通过蛋白酶体途径促进FASN的降解。此外，在动物水平和体外细胞实验中，抑制FASN可以改善因敲低Cel而诱导的肝细胞脂质积累和炎症。使用AAV8-Cel进行肝细胞特异性CEL过表达，可以显著减轻CD-HFD或MCD诱导的小鼠MASH。CEL通过直接与FASN相互作用并抑制其表达以减少新生脂肪生成，从而抑制MASH。CEL过表达可能在治疗MASH中具有潜在的临床价值。

Abstract

Carboxyl ester lipase (CEL), a pivotal enzyme involved in lipid metabolism, is recurrently mutated in obese mice. Here, we aimed to elucidate the functional significance, molecular mechanism, and therapeutic potential of CEL in metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH). Hepatocyte-specific carboxyl ester lipase gene (Cel) knockout (CelΔHEP) and wildtype (WT) littermates were fed with choline-deficient high-fat diet (CD-HFD) for 16 weeks, or methionine- and choline-deficient diet (MCD) for three weeks to induce MASH. Liquid chromatography-mass spectrometry and co-immunoprecipitation were employed to identify the downstream targets of CEL. CD-HFD/MCD-fed WT mice received intravenous injections of CEL-adeno-associated viral, serotype 8 (AAV8) to induce specific overexpression of CEL in the liver. We observed a decrease in CEL protein levels in MASH induced by CD-HFD or MCD in mice. CelΔHEP mice fed with CD-HFD or MCD exhibited pronounced hepatic steatosis, inflammation, lipid peroxidation, and liver injury compared to WT littermates, accompanied by increased hepatic nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell (NF-κB) activation. Consistently, Cel knockdown in mouse primary hepatocytes and AML12 cells aggravated lipid accumulation and inflammation, whereas CEL overexpression exerted the opposite effect. Mechanistically, CEL directly bound to fatty acid synthase (FASN), resulting in reduced FASN SUMOylation, which in turn promoted FASN degradation through the proteasome pathway. Furthermore, inhibition of FASN ameliorated hepatocyte lipid accumulation and inflammation induced by Cel knockdown in vivo and in vitro. Hepatocyte-specific CEL overexpression using AAV8-Cel significantly mitigated steatohepatitis in mice fed with CD-HFD or MCD. CEL protects against steatohepatitis development by directly interacting with FASN and suppressing its expression for de novo lipogenesis. CEL overexpression confers a therapeutic benefit in steatohepatitis.

关键词

代谢功能障碍相关脂肪性肝炎 / 羧基酯脂肪酶 / 脂肪酸合成酶 / 脂质从头合成 / 治疗

Key words

Metabolic dysfunction-associated steatohepatitis / Carboxyl ester lipase / Fatty acid synthase / De novo lipogenesis / Treatment

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宋阳,钟巍,刘焯晞,张雅婷,官华宇,谢茗旭,夏芷君,首第文,周永健,许鸿志,于君,张翔. 羧基酯脂肪酶结合脂肪酸合成酶治疗代谢功能障碍相关脂肪性肝炎[J]. 工程（英文）, 2024, 41(10): 214-227 DOI:10.1016/j.eng.2024.04.018

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1 引言

代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）是代谢功能障碍相关脂肪肝病（MASLD）的进展阶段，伴有炎症、肝细胞损伤和纤维化。MASH是肝细胞癌的重要风险因素，并显著增加了对肝脏移植的需求[1‒2]。尽管已有大量研究，但人们对MASH的潜在病理生理机制仍缺乏全面的理解[3]。

多种脂质相关基因的表达变化是MASH发展的关键因素[4]。羧基酯脂肪酶基因（Cel）通过分解胆固醇酯和甘油三酯生成游离胆固醇和脂肪酸[5‒6]，在脂质代谢调节中扮演着重要角色。最新研究表明，羧基酯脂肪酶（CEL）与多种代谢紊乱的发展相关，如血糖异常[7]和动脉粥样硬化[8‒9]。另一项研究还发现，CEL通过与清道夫受体途径的相互作用，调节高密度脂蛋白中胆固醇酯的选择性肝脏摄取和代谢[10]。我们之前的研究表明，在肥胖小鼠中，Cel基因突变频繁，Cel的敲低或无义突变会导致肝细胞内脂质水平和内质网应激增加[11]。两者都是MASH发展的已知因素[12‒13]。然而，CEL在MASH中的具体功能仍不明确。

我们的研究结果显示，肝细胞特异性Cel基因敲除小鼠（Cel ΔHEP）在喂以胆碱缺乏高脂饮食（CD-HFD）或甲硫氨酸和胆碱缺乏饮食（MCD）时，MASH症状加重。机制研究表明，CEL直接结合脂肪酸合成酶（FASN），减少了FASN的SUMO化修饰，从而增强其通过蛋白酶体途径的降解。通过肝细胞特异性过表达CEL，能够显著减轻CD-HFD和MCD诱导的小鼠模型中的脂肪性肝炎。这些发现共同揭示了CEL在调节FASN介导的新生脂肪生成，从而减轻MASH发展中的作用。

2 材料和方法

2.1 小鼠模型及处理

转基因小鼠模型：肝细胞特异性Cel基因敲除小鼠由百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司培育。我们构建了两种小鼠MASH模型：雄性Cel ΔHEP小鼠或野生型（WT）小鼠予以为期16周的CD-HFD饮食诱导MASH发生，并以正常饲料（NC）作为对照；另一组小鼠则给予3周的MCD饮食诱导，以MCD对照饲料作为参照。小鼠饲料购自美国Research Diets公司。在处死前，小鼠经过禁食，并测量体重。处死后，收集肝脏组织和血清样本。

腺相关病毒（AAV）介导的肝细胞特异性CEL过表达小鼠模型：通过尾静脉注射携带甲状腺素结合球蛋白启动子的AAV8来特异性诱导CEL在肝脏的表达，实验组（AAV8-Cel）包含Cel外显子序列，对照组（AAV8-null）则不包含，上述病毒由上海和元生物技术股份有限公司制备。注射浓度为每只小鼠1 × 1011基因组拷贝，在注射后两周，按照前述方法诱导MASH。

为评估抑制FASN对Cel基因敲除的整体影响，我们使用了携带Cel单向导RNA（sgRNA）和成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）相关蛋白9的AAV8载体[AAV8-sgRNA（Cel）和 AAV8-sgRNA（NC），上海和元生物技术有限公司]进行敲减。小鼠通过尾静脉注射1 × 1011基因组拷贝∙只-1的AAV8-sgRNA（Cel）或 AAV8-sgRNA（NC）。注射后两周，通过MCD诱导MASH，同时每日口服给予FASN抑制剂TVB-3664，剂量为3 mg∙kg-1。

动物实验经过香港中文大学动物实验伦理委员会的批准。

2.2 细胞培养与处理

采用雄性C57BL/6小鼠进行小鼠原代肝细胞（MPHs）的分离[14]。首先，利用乙二醇四乙酸（EGTA）经门静脉灌注小鼠肝脏，随后使用胶原酶D（11088858001; Sigma-Aldrich，美国）进行消化，以梯度密度离心法获得MPHs。分离所得到的MPHs经过计数后，接种于涂有胶原蛋白的培养板上，静置3 h，并在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基中培养。小鼠永生化正常肝细胞系AML12则在含10% FBS及胰岛素-转铁蛋白-硒的DMEM/F12中培养。利用棕榈酸和油酸刺激肝细胞进行体外MASH模型的构建，所用棕榈酸和油酸预先溶解于10%去脂牛血清白蛋白（BSA）。AML12细胞或MPH在无FBS培养基中饥饿8 h后，转入含棕榈酸和油酸（0.33/0.66 mmol∙L-1）的DMEM/F12中培养24 h。另一种体外MASH模型则是将MPH暴露于对照培养基或缺乏甲硫氨酸和胆碱的DMEM/F12培养基（MCD培养基，上海安为生物科技有限公司）中培养48 h。

为敲低Cel或Fasn在细胞中的表达，我们使用了特异性siRNA（siCel和siFasn）以及非靶向对照siRNA（siNC）进行细胞转染，以上siRNA均由上海和元生物技术有限公司提供。siRNA转染使用Lipofectamine‍TM RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific，美国）进行，相关实验流程按照制造商的说明书进行操作。

2.3 组织学检查

肝脏组织在室温下用10%福尔马林固定过夜。固定后，对组织进行脱水处理，并随后以石蜡包埋。采用苏木精-伊红（H&E）染色进行组织学分析。两名独立研究人员根据脂肪肝活动评分系统（NAS）对切片的炎症、脂肪变和气球样变进行评估和评分。NAS得分为脂肪变、炎症和气球样变评分的总和。为了评估脂肪沉积情况，将肝脏冰冻切片进行油红O染色。使用冰冻切片机将肝脏切成4 μm厚度的切片，并在染色前用4%（V/V）多聚甲醛固定10 min，然后用油红O工作溶液（Sigma-Aldrich）进行染色。

2.4 Western Blot（WB）实验

蛋白样品使用放射免疫沉淀裂解实验（RIPA）缓冲液进行裂解，并通过双吡啶酸（BCA）试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行定量。Western Blot实验按照之前的方法进行。所使用的主要抗体详细列于附录A的表S1中。

2.5 Pull down实验

将小鼠肝脏组织在RIPA缓冲液中裂解以进行共免疫沉淀（Co-IP）分析。将1 mg的蛋白裂解液与2 μg的抗CEL抗体或对照小鼠免疫球蛋白G（IgG）在4 °C下孵育过夜。随后，将得到的裂解物-抗体混合物与20 μL Protein A/G Plus琼脂糖珠（sc-2003；Santa Cruz Biotechnology，美国）孵育4 h。使用含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤珠子，然后与上样缓冲液共热。分离的蛋白质通过银染或Western Blot进行检测，并使用液相色谱-质谱法进行特征分析。

在Pull down实验中，1 μg重组小鼠CEL蛋白（50583-M08B；北京义翘神州生物技术有限公司）和1 μg重组小鼠FASN蛋白（ABIN3009348; Antibodies-online GmbH，德国）在4 °C下孵育过夜。随后，混合物与1 μg抗CEL抗体或1 μg抗FASN抗体在4 °C下孵育过夜，然后与50 μL Protein A/G Plus琼脂糖珠或Protein A/G磁珠孵育。洗涤珠子后，使用含0.05%吐温-20的PBS，随后加热以洗脱蛋白质。最后，通过Western Blot分析这些蛋白质。

2.6 肝脏总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和反应性硫代巴比妥酸物质（TBARS）检测

将重约20~30 mg的肝组织样本进行匀浆。根据制造商的说明，使用胆固醇定量试剂盒（ab65359; Abcam，英国）检测TC水平；使用Wako E-test TG试剂盒（日本和光纯药工业株氏会社）检测TG水平；通过TBARS测定（MAK085; Sigma-Aldrich）丙二醛水平以评估脂质过氧化。所有实验均进行三次重复。

2.7 葡萄糖和胰岛素耐受性测试

小鼠在禁食过夜后，进行腹腔葡萄糖耐受性测试（IPGTT），以每千克体重1 g葡萄糖进行腹腔注射；或进行腹腔胰岛素耐受性测试（IPITT），以每千克体重0.75 U胰岛素进行腹腔注射。按照指定时间间隔监测血糖水平。

2.8 血清生化检测

使用Catalyst One化学分析仪（IDEXX Laboratories，美国）按照制造商提供的标准流程，测定血清中的TC、TG、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和血尿素氮（BUN）水平。

2.9 RNA提取与小鼠基因分型

使用TRIzol试剂（15596018; Invitrogen，美国）提取总RNA，并使用PrimeScript RT试剂盒（RR037B; Takara，日本）进行互补DNA（cDNA）合成，使用的RNA总量为1000 ng。用于基因分型的引物列表见附录A的表S2。

2.10 脂肪肝聚合酶链反应（PCR）阵列

利用小鼠肝脏cDNA进行小鼠脂肪肝PCR阵列（PAMM-157ZF; Qiagen，德国）。通过ΔΔCT方法评估候选基因的相对表达水平。对于基因变化倍数大于2的情况，视为具有统计学显著性差异。

2.11 免疫组化（IHC）

对小鼠肝脏、胰腺和肠道样本进行免疫组化染色。样本经过石蜡包埋后，进行切片、去石蜡和再水合。使用柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复。随后，用3% H2O2处理切片，并用5%山羊血清封闭。将CEL抗体（表S1）在4 °C下孵育过夜，然后用山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶（HRP）结合物（Bio-Rad，美国）进行孵育。最后，使用苏木精进行对比染色，并拍摄显微图像。

2.12 实时PCR

使用TB Green Advantage定量聚合酶链反应预混液（639676；Takara Bio，日本）在QuantStudio 7 Flex实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific）中进行实时PCR。每个样本均进行三次重复测试。用于实时PCR的引物列表见表S2。

2.13 统计分析

结果以均值±标准差（SD）表示。两组间的比较使用t检验或Mann-Whitney U检验。多组间数值变量的差异则使用方差分析（ANOVA）方法进行评估。葡萄糖耐受性和胰岛素释放测试的差异采用双向方差分析（two-way ANOVA）进行比较。统计分析使用SPSS（版本26.0；IBM，美国）或GraphPad Prism（版本8.4.3；美国）进行。

3 结果

3.1 肝细胞特异性Cel敲除促进CD-HFD诱导小鼠MASH发展

我们首先检测了喂食CD-HFD或MCD的小鼠肝脏CEL蛋白水平。结果表明，这些MASH小鼠模型中CEL蛋白水平下调[图1（a）]。为了探讨CEL在MASH中的作用，我们构建了肝细胞特异性Cel基因敲除小鼠[图1（b），附录A中的图S1（a）和（b）]，并将其喂食CD-HFD 16周[图1（c）]。通过实时定量PCR（qPCR）检测Cel在Cel ΔHEP小鼠及其野生型同窝小鼠的肝脏、胰腺和肠道中的信使RNA（mRNA）表达，结果显示Cel ΔHEP小鼠的肝脏中Cel表达特异性丧失[附录A图S1（c）]，验证了肝细胞特异性Cel基因敲除。随后，通过WB [附录A图S1（d）]和IHC染色（附录A图S2）进一步验证了Cel ΔHEP小鼠中肝脏CEL的缺失，而WT小鼠的肝脏中存在CEL表达。与此同时，我们观察到Cel ΔHEP和WT小鼠的CEL在其他器官表达相似，即胰腺中CEL高表达，小肠中则表现出弱表达[附录A图S1（d）和图S2]。

此外，Cel ΔHEP小鼠的体重和肝脏重量显著高于其WT同窝小鼠[P < 0.01，图1（d）]。与WT小鼠相比，Cel ΔHEP小鼠的肝脏中TG、TC和TBARS水平显著升高[所有P < 0.01，图1（e）]，IPGTT/IPITT实验结果显示Cel ΔHEP小鼠还伴随胰岛素敏感性降低[所有P < 0.01，图1（f）]。Cel ΔHEP小鼠的血清ALT和AST，以及TG和TC水平也显著升高[所有P < 0.01，图1（g）]。组织学分析显示，Cel ΔHEP小鼠的肝脏中出现更严重的脂肪变、炎症和气球样变[图1（h）]。Cel ΔHEP小鼠肝脏中与胆固醇代谢相关的基因，包括甾醇调节元件结合蛋白2（Srebp2）、β-羟基-β-甲基戊二酸单酰CoA还原酶（Hmgcr）、角鲨烯环氧化酶（Sqle）、低密度脂蛋白受体（Ldlr）表达明显上升；而脂肪生成基因，包括乙酰辅酶A羧化酶α基因（Acaca）和脂肪酸合成酶基因（Fasn）也明显上升；最后脂质氧化相关基因，包括酰基辅酶A氧化酶（Acox）、蛋白激酶B（AKT）丝氨酸/苏氨酸激酶1基因（Akt1）、雷帕霉素靶点激酶基因（Mtor）的mRNA表达同样也有显著性升高[图1（i）]。此外，在Cel ΔHEP小鼠中观察到促炎性核因子活化B细胞κ轻链增强子（NF-κB）通路的激活，表现为肝组织中NF-κB抑制因子α（IκBα）水平降低和NF-κB p65磷酸化水平升高[图1（j）]。在免疫组化染色的巨噬细胞标记物F4/80实验中，Cel ΔHEP小鼠肝脏中观察到更明显的巨噬细胞浸润[P < 0.01，图1（k）]。炎症标记物白介素6（Il6）和肿瘤坏死因子α（Tnfα）的mRNA表达在Cel ΔHEP小鼠肝脏中也显著升高[P < 0.01，图1（i）]。同时，Sirius Red染色结果显示Cel ΔHEP小鼠的肝脏纤维化更为明显[P < 0.01，图1（l）]，并伴随纤维化标记物α-平滑肌肌动蛋白（αSma）和胶原蛋白Iα1链（Col1a1）mRNA表达的升高[P < 0.01，图1（i）]。综上，我们的研究结果表明，肝细胞特异性Cel基因敲除加重了CD-HFD诱导的小鼠MASH表现。

3.2 肝细胞特异性Cel敲除促进MCD诱导的小鼠MASH发展

为了验证我们的发现，我们使用Cel ΔHEP小鼠建立了MCD诱导的另一种MASH模型[图2（a）]。结果显示，Cel ΔHEP小鼠在接受MCD诱导MASH后，肝脏中TG、TC和TBARS水平均显著高于MCD诱导MASH的WT小鼠[所有P < 0.01，图2（b）]。Cel ΔHEP小鼠的血清ALT（P < 0.05）和AST（P < 0.01）水平也显著高于WT小鼠[图2（c）]。组织学分析显示，Cel ΔHEP小鼠的肝脏中出现严重的脂肪变、炎症和气球样变[图2（d）]。促炎性NF-κB通路活性在Cel ΔHEP小鼠中升高[图2（e）]，同时与炎症相关基因（Il6、Tnfα）的mRNA表达也显著增加[图2（f）]。此外，通过F4/80染色观察到Cel ΔHEP小鼠中巨噬细胞浸润显著增加[图2（g）]。来自这两个小鼠模型的一致观察证实了肝细胞特异性Cel敲除加重了饮食诱导的MASH发展。

3.3 CEL在体外调节肝细胞脂肪变和炎症

我们进一步在离体实验中，用脂肪酸[油酸联合棕榈酸（OA/PA）]处理小鼠肝细胞（MPH和AML12）来探讨CEL在MASH中的作用。结果显示，脂肪酸处理导致MPH和AML12细胞中脂质积累更加明显[所有P < 0.01，图3（a）]。在用siRNA敲减Cel表达后，细胞内TG水平也显著升高[所有P < 0.01，图3（b）]，同时伴随NF-κB通路的激活，表现为IκBα水平降低和NF-κB p65磷酸化水平升高[图3（c）]。相反，CEL过表达减轻了MPH（P < 0.01）和AML12细胞（P < 0.05）的脂质积累[图3（d）]，同时降低了细胞内TG水平[所有P < 0.01，图3（e）]和促炎性蛋白通路活性[图3（f）]。

我们还建立了另一个体外MASH模型，通过用MCD培养基培养MPH和AML12细胞以诱导严重的肝细胞的炎症和脂肪变。结果显示，MCD培养基的使用导致脂质积累显著增加，这一现象在Cel敲除后更加明显[所有P < 0.01，附录A图S3（a）和（b）]。此外，评估细胞炎症水平后发现，MPH和AML12细胞在Cel敲除后Il6和Tnfα的mRNA表达均显著升高[所有P < 0.01，附录A图S3（c）]，同时NF-κB通路被激活，表现为IκBα水平降低和NF-κB p65磷酸化水平升高[附录A图S3（d）]。我们体外和体内研究结果均表明CEL在MASH中对脂肪变和炎症反应具有调节作用。

3.4 CEL直接靶向FASN治疗小鼠MASH

为了阐明相关的潜在机制，我们对小鼠肝脏组织进行了Co-IP和质谱分析，以识别CEL的结合靶标。结果显示，FASN可能是CEL的一个靶标[图4（a）]。具体而言，我们在小鼠肝脏组织中进行了抗CEL/抗FASN的共免疫沉淀实验，随后WB结果表明，抗CEL和抗FASN分别能够捕获FASN和CEL蛋白[图4（b）]。进一步地，我们利用CEL和FASN的重组蛋白进行同步验证，通过共免疫沉淀[图4（c）]和Far-Western Blot [图4（d）]实验一致证实了FASN与CEL之间的直接相互作用。

此前的研究表明，小泛素相关修饰物2（SUMO2）介导的SUMO化修饰能够保护FASN免受蛋白酶体降解[15]。因此，我们在肝细胞中过表达CEL后，通过免疫共沉淀分离FASN蛋白，并检查了FASN的SUMO化水平。结果显示，SUMO化的FASN水平下降，而总细胞裂解液中的SUMO化水平保持不变。这表明CEL可能发生特异性靶向作用并减少FASN的SUMO化[图4（e）]。我们还观察到，CEL过表达导致小鼠肝细胞中FASN蛋白表达下调[图4（f）]。为了探讨这种降低是否由蛋白酶体降解途径所介导，我们对CEL过表达的细胞进行了蛋白酶体抑制剂MG132的处理。与未处理的细胞相比，MG132处理组FASN蛋白水平上调[图4（f）]。而在动物整体水平，在喂食CD-HFD或MCD的Cel ΔHEP小鼠中，肝脏FASN蛋白表达显著高于WT小鼠[图4（g）]。此外，免疫荧光共染色显示CEL与FASN在小鼠肝细胞中共定位[图4（h）]。综上，CEL过表达可以通过调节FASN的SUMO化水平促进FASN的蛋白酶体降解。

3.5 靶向作用FASN可以逆转Cel敲除诱导的MASH表型加重

接下来，我们继续验证干预FASN表达，是否会影响CEL在MASH中的功能。使用siRNA敲除经脂肪酸处理的AML12细胞中Cel和（或）Fasn，我们发现Cel的敲除显著增加了脂质积累[P < 0.01，图5（a）]、细胞内TG水平[P < 0.01，图5（b）]以及NF-κB通路的活性[图5（c）]，而这些因Cel敲除引起的变化可以通过转染Fasn siRNA逆转。同时，我们还采用了FASN的化学抑制剂TVB-3664 [16]进行了同样的实验。结果提示，化学性抑制FASN与siRNA结论相符合，TVB-3664显著减少了脂肪酸处理的AML12细胞脂质积累[P < 0.01，图5（d）]和细胞TG水平[P < 0.01，图5（e）]，同时增强了IκBα的蛋白表达，并降低了磷酸化p65与总p65的比率[图5（f）]。

在体内验证方面，我们使用MCD小鼠模型进行实验。通过尾静脉注射AAV8-sgRNA（Cel）实现肝脏Cel的敲除，并同时予以口服FASN抑制剂TVB-3664进行治疗[图5（g）]。结果显示，TVB-3664有效逆转了MCD喂养小鼠中Cel敲除的影响，肝脏中的TG、TC、TBARS水平以及血清ALT均显著降低[图5（h）]。此外，TVB-3664的使用还显著降低了NAS，并减轻了由于Cel敲除引起的肝脏脂质积累[图5（i）]。更重要的是，TVB-3664给药后IκBα和磷酸化p65/总p65的蛋白表达降低，进一步确认了FASN抑制逆转了MCD喂养小鼠中Cel敲除引发的炎症加剧[图5（j）]。综合这些结果表明，靶向作用FASN能够有效消除CEL敲除诱导的MASH发展。

3.6 CEL过表达治疗CD-HFD诱导的MASH

我们利用AAV8-Cel在小鼠肝脏中选择性过表达CEL，以评估CEL在CD-HFD诱导的MASH中的治疗潜力[图6（a）]。确认CEL仅在小鼠肝脏中过表达[图6（a）]，而在胰腺等其他器官中则未见过表达（附录A图S4）后，我们利用CD-HFD饮食诱导了小鼠MASH模型。我们观察到AAV8-Cel处理的小鼠肝脏重量（P < 0.01）和体重（P < 0.01）均显著低于AAV8-null处理的小鼠[图6（b）]。在过表达CEL并喂食CD-HFD的小鼠中，肝脏中的TC（P < 0.01）、TG（P < 0.01）和TBARS（P < 0.05）水平均有所降低[图6（c）]，并且胰岛素敏感性得到了改善[图6（d）]。这些小鼠的血清ALT（P < 0.05）、AST（P < 0.05）、TC（P < 0.01）和TG（P < 0.01）水平也显著低于对照组[图6（e）]。组织学分析显示，CEL的过表达减轻了CD-HFD诱导的肝脏脂肪变、炎症和气球样变[图6（f）]。此外，脂肪生成相关基因（如Acaca和Fasn）以及脂质氧化相关基因（如Akt1、Mtor和Acox）的mRNA表达在CEL过表达的小鼠中显著降低[图6（g）]。同时，NF-κB的活化也降低，表现为NF-κB p65的磷酸化水平下降和IκBα水平上升[图6（h）]，肝脏中的F4/80阳性细胞数量减少[图6（i）]，炎症标记物Il6和Tnfα的mRNA表达也显著降低[图6（j）]。此外，CEL过表达的小鼠的纤维化也得到了缓解[图6（k）]，同时αSma和Col1a1的mRNA表达下降[图6（l）]，肝脏中的FASN蛋白表达也降低[图6（h）]。

3.7 CEL过表达治疗MCD诱导的MASH

为了验证我们的发现，我们继续利用AAV8-Cel或AAV8-null对MCD诱导的MASH小鼠模型进行干预[图7（a）]。与AAV8-null对照组相比，AAV8-Cel治疗显著降低了肝脏中的TG、TC和TBARS水平[所有P < 0.01；图7（b）]。AAV8-Cel处理的小鼠还表现出肝损伤的减轻，血清ALT和AST水平降低[图7（c）]。组织学检查显示，AAV8-Cel处理的小鼠肝脏脂肪变、炎症和气球样变得到缓解[图7（d）]。CEL过表达小鼠的NF-κB通路活性显著降低[图7（e）]，并伴随着巨噬细胞浸润减少[图7（f）]和炎症基因（Il6、Tnfα）的mRNA表达下调[图7（g）]。此外，喂食MCD的CEL过表达小鼠中，FASN的蛋白表达也降低[图7（e）]。综合这两种饮食诱导的MASH小鼠模型结果表明，过表达CEL是一种具有潜在临床应用价值的MASH治疗方法。

4 讨论

本文深入探讨了CEL在小鼠模型中对MASH的作用及其机制。MASH是一种代谢性疾病，越来越多的证据表明，脂质积累在其发病机制中起着核心作用[17]。然而，尽管MASH的全球发病率不断上升，我们对其发生机制的理解，尤其是宿主遗传因素在MASH中的角色，依然相对模糊。虽然以往的研究已识别出MASH与基因改变或单核苷酸多态性之间的相关性[18]，但这些遗传因素与代谢失调之间的具体分子相互作用仍未明确。在本研究中，我们发现饮食诱导的MASH小鼠肝脏中CEL蛋白水平显著下降（图1），提示CEL可能对MASH具有治疗作用。

尽管CEL主要在胰腺合成，但它在肝脏中也有表达[10]，主要存在于肝细胞中[19‒21]。CEL在肝细胞特定的内质体区室中存在，这提示肝脏来源的CEL可能由肝细胞直接分泌[22]。CEL在肝细胞表面及内质体区室中的存在表明，它可能参与肝脏的分泌-捕获途径，这一途径在脂蛋白代谢中发挥着重要作用[23]。肝脏中的CEL促进高密度脂蛋白（HDL）衍生胆固醇酯的选择性摄取，对于肝脂蛋白代谢起到重要作用[24]。我们的研究结果表明，肝脏中的CEL能够直接与FASN结合，从而降低FASN的SUMO化水平，促进了FASN通过蛋白酶体途径的降解，进而抑制了MASH的发展。这些结果提示，肝脏中的CEL可能通过调节肝脏脂质代谢发挥抗MASH的作用。

相比之下，尽管我们的结果提示肠道中存在CEL，但显然肠道中的CEL表达并非内源性，而是可能来源于胰腺[21]。肠上皮细胞可能通过内吞途径从胰汁中摄取CEL，并与伴侣蛋白GRP94结合，使CEL能够附着在十二指肠上皮并在肠腔中表达[25]。先前的一项研究[21]虽然发现肠道中有CEL蛋白的阳性信号，但并未检测到CEL mRNA的表达，这与我们结果是一致的。在本研究中，我们主要关注肝脏中的CEL，探讨了其在MASH中的作用及机制。

具体来说，我们建立了两种饮食诱导的MASH小鼠模型，并进行了肝细胞特异性Cel敲除，确认CEL缺失显著加速了MASH的发展（图2）。这些发现与我们之前的研究一致，我们在肥胖小鼠中识别到Cel更频繁的突变，并观察到Cel敲除导致体外肝细胞中胆固醇酯显著积累[11]。尽管其他研究报道提示非特异性Cel敲除中对胰岛素敏感性及血清胆固醇或脂质水平影响不大[26‒27]，但我们在两种不同MASH小鼠模型中得到的一致结果为肝细胞特异性CEL缺失加速疾病进程的结论提供了有力证据。综合这些结果，我们研究提示CEL的抗MASH作用可能是组织特异性的（主要为肝脏）。

随后，我们进行了体外实验，以阐明CEL在MASH发展中的机制。我们的结果确认CEL可以调节小鼠肝细胞中的脂肪变和炎症（图3）。通过质谱分析，我们识别出了CEL与FASN之间的直接靶向作用，FASN是一种在脂肪生成中起关键作用的酶，常在MASLD/MASH中上调[28]。CEL直接与FASN结合，导致FASN的SUMO化水平降低，这促进了FASN的蛋白酶体降解，从而减少FASN相关的脂肪生成（图4）。此外，我们通过体外功能实验进一步验证了FASN的siRNA和化学抑制剂能够抵消Cel敲除诱导的MASH促进效应（图5）。研究表明，SUMO化在MASH的发病机制中发挥作用。例如，SREBP1c的SUMO化抑制其转录活性并抑制脂质生成[29]，而核受体肝受体同源物1的SUMO化受损则通过诱导氧甾醇结合蛋白样3的表达促进MASH [30]。法尼醇X受体的乙酰化也被报道能够阻止其与SUMO连接酶蛋白抑制物信号转导子和转录激活子（STAT）Y（PIASy）的相互作用，抑制其SUMO2修饰，并在肥胖小鼠中激活炎症基因[31]。综合来看，我们的结果也为SUMO化在MASH发展中的参与提供了额外证据。

目前MASH缺乏特效治疗药物，其发病率逐年增加，且有导致肝脏恶性病变的可能，使其成为全球重要的健康问题[32]。因此，我们探讨了靶向作用CEL是否具备治疗MASH的潜力。为此，我们构建能够在小鼠肝脏中特异性过表达CEL的AAV8载体。结果显示，肝细胞特异性CEL过表达有效减轻了CD-HFD诱导的小鼠疾病表型（图6）。这一治疗效果在另一种MCD诱导的MASH小鼠模型中得到了验证（图7）。多项临床试验已使用重组AAV载体针对肝脏疾病（尤其是针对遗传性代谢性肝病）开展治疗，目前还主要集中在第一、二期临床试验[33]。携带特定DNA序列的重组AAV颗粒用于治疗已成为基因治疗中一种非常有前景且安全的方法。

在MASLD的背景下，尽管AAV基因治疗在动物实验中展现出治疗潜力，但目前仍主要集中于基础实验研究层面[34‒35]。随着越来越多的证据将基因突变与MASLD联系起来，携带AAV载体的基因治疗为MASLD的治疗提供了新的解决方案。然而，正在进行的AAV研究的疗效仍需更深入的全面评估。尽管相关初步结果表明基于AAV的MASLD治疗方案具有一定的临床价值，但这些试验从动物模型到人类临床环境的成功转化仍需重点关注。CEL在肝细胞中特异性的抗脂肪变作用凸显了其作为强有力干预治疗的潜力。AAV介导的CEL过表达为针对MASH的基因治疗开辟了新的思路和理论基础。此外，我们的发现也为MASLD中AAV研究的前景注入了新的动力，亟需进一步的临床研究来验证这些结果。

5 结论

我们的研究表明，肝细胞特异性CEL缺失与MASH发展加速相关，CEL对MASH具有抗脂肪变作用。我们的机制研究揭示，CEL通过直接靶向促进FASN的SUMO化来保护肝脏免受MASH的影响。此外，我们的结果提示肝细胞特异性CEL过表达可以作为一种新颖、有效、具备临床应用潜力的MASH治疗策略。综上，本研究为开发针对MASH这一重要肝病的靶向治疗开辟了新的途径。

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