子宫内膜癌为女性生殖道三大恶性肿瘤之一, 约占女性癌症总数的7%, 近年发病率有上升趋势, 与宫颈癌比较, 已趋于接近甚至是超过。子宫内膜癌的发病机理目前仍不十分清楚, 可能与雌激素的长期刺激、肥胖体质、遗传等因素相关。近年来对于尿激酶型纤溶酶原激活系统 (uPA) 和子宫内膜癌的相关性, 有学者认为, 此纤溶酶原激活系统中的uPA在细胞外间质水解过程中起重要作用, 参与组织改造和细胞迁移;推测uPA的作用系统可能与肿瘤的浸润和转移相关。而浸润和转移是恶性肿瘤的主要生物学特征之一, 也是肿瘤患者治疗失败和死亡的直接原因。因此有人认为可以利用肿瘤组织、尿液或者血清中uPA系统各蛋白的含量判断患者预后和治疗效果, 也可以通过阻断肿瘤相关蛋白酶的作用, 抑制浸润转移能力, 达到治疗肿瘤的目的, 这已成为当前肿瘤研究的一个新方向。

《1 尿激酶型纤溶酶原激活剂系统的组成与结构》

1 尿激酶型纤溶酶原激活剂系统的组成与结构

人体内有两种纤溶酶原激活物, 分为尿激酶型纤溶酶原激活物uPA (urokinase-type plasminogen activator) 与组织型酶原激活物TPA (tissue-type plasminogen activator) , 二者均能激活纤溶酶原成为纤溶酶。TPA主要在血管内生理性溶栓中起作用。尿激酶型纤溶酶原激活剂系统包括尿激酶型纤溶酶原激活物uPA、尿激酶型纤溶酶原激活物受体uPAR (urokinase-type plasminogen activator receptor) , 纤溶酶原激活物抑制剂PAIs (plasminogen activator inhibitors) 。

《1.1尿激酶型纤溶酶原激活因子》

1.1尿激酶型纤溶酶原激活因子

uPA基因定位于第10号染色体的长臂上, 其长度为6.5 kb, 由11个外显子和10个内含子构成。可转录为2.4 kb的成熟mRNA, 初始翻译产物为前尿激酶原, 含有431氨基酸残基, 除去20个氨基酸残基的信号肽, 即为最初由细胞分泌释放的单链无活性尿激酶原 (pro-uPA) , 又经纤溶酶、组织蛋白酶等在lys158处催化断裂肽腱K158-I159, 成为有活性的双链尿激酶型纤溶酶原激活剂。尿激酶型纤溶酶原激活剂是一种丝氨酸蛋白水解酶, 含有411个氨基酸残基, 分子量约为50~60 KD的糖蛋白, 由2个二硫化键桥联的多肽链构成。其羧基末端为丝氨酸蛋白结构域, 氨基末端包含3个环域和1个生长因子结构域。uPA通过其生长因子结构域识别并结合uPAR的结构域, 使两者达到高效结合 (KD=0.1~0.5 nm) 。活性双链uPA和无活性的尿激酶原与uPAR有相同亲和力。uPA尚有第二个切点在lys135处, 产生氨基酸片段 (ATF) 和羧基端低分子量uPA。ATF在结构上由1个kringle域和1个生长因子结构域组成, 无催化活性, 也不是催化必须链, 其生长因子结构域含40个氨基酸残基, 与EGF的部分序列相类似, 含有能与其受体结合的区域, 而对kringle区域的作用目前还不清楚[1]。羧基端低分子量uPA, 含有丝氨酸蛋白结构域, 具有催化活性, 但不能与其受体uPAR结合, 其活性部位序列与其他丝氨蛋白酶类似, 此区域在丝氨酸蛋白酶家族进化中是保守的[2]。

《1.2尿激酶型纤溶酶原激活剂受体》

1.2尿激酶型纤溶酶原激活剂受体

通过亲和层析分离到uPA受体 (uPAR) , uPAR是糖化较多 (40%的分子量是糖) 的跨膜蛋白, 分子量为55~66 KD, 其差别主要由于糖化程度不一样所致。人uPAR的cDNA约有1.4 kb, 具有单一阅读框架。所编码的氨基酸序列中, 前端为21个氨基酸残基所组成的信号肽, 然后是313个氨基酸残基构成的uPAR, 接近羧基末端有一段疏水性序列, 可能为跨膜区域。另有10个氨基酸残基位于细胞质侧, uPAR中绝大多数组成位于细胞膜外面, 含有糖化位点。

《1.3纤溶酶原激活剂抑制剂》

1.3纤溶酶原激活剂抑制剂

PAIs由肿瘤细胞分泌, 以调节肿瘤细胞浸润转移的能力, 它能特异型抑制uPA的活性。抑制剂主要分为两大类, 即血管内破型 (PAI-1) 和胎盘型 (PAI-2) , PAI-1是一种分子量为52KD的糖蛋白, 含有379个氨基酸残基, 是正常人血浆中uPA的主要抑制剂, uPA形成uPA-PAI-1复合物后而失活。

《2 尿激酶型纤溶酶原激活剂系统的作用机理》

2 尿激酶型纤溶酶原激活剂系统的作用机理

1976年, Astedt等首先发现肿瘤细胞能产生uPA。大部分为uPA与PAI-1形成的复合物, 小部分以pro-uPA形式存在。肿瘤细胞分泌的无活性的pro-uPA与细胞表面的uPAR专一性结合后, 首先由血清中纤溶酶或肿瘤细胞所分泌的组织蛋白酶B, L激活转变化uPA[3]。细胞表面的uPAR对无活性的pro-uPA及有活性uPA均有高度亲和力。uPAR与uPA高效结合后, 将uPA集于细胞表面。仍与受体结合着的具有生物活性的uPA反过来又激活结合在细胞表面的纤溶酶原, 使其转化为纤溶酶。随后纤溶酶就开始降解肿瘤细胞外基质, 如纤维蛋白、纤维连接蛋白。同时还激活IV型胶原酶, 使之降解基底膜的主要成分IV胶原。在此过程中, uPAR极为关键, 它将uPA定位于细胞表面, 参与uPA的活化调节, 使uPA的蛋白裂解活性大大提高, 在肿瘤组织中, 则使基底膜产生灶性和直接的蛋白裂解, 有利于肿瘤细胞的侵袭和转移。Hudson等运用抗uPAR的单克抗体Mab3936阻碍uPA/uPAR的结合可以抑制肿瘤细胞的浸润[4], 说明细胞表面uPAR表达的调节直接影响细胞的浸润能力, 肿瘤细胞只有具备分泌uPA和表达uPAR才能发生浸润。

目前的研究结果认为, PAI-1防止血管生长过程中结缔组织 (ECM) 过分降解, 参与血管生长的调节, 可以防止瘤组织自身的降解, 促使转移瘤细胞定位。一般认为PAI-2与uPA的动态平衡控制了巨噬细胞在体内的游走。关于uPA系统的基因表达调控, 有学者认为是产生的因子及一些磷酸化调节因子能调节uPA基因的表达, 它们是通过改变肿瘤细胞内的转录因子 (TFS) 的含量和/或活性[5]。TFS与uPA启动子相应元件相结合, 改变uPA的转录;AP1, NFkB, PEA3等转录因子也在uPA基因表达调控中起作用;细胞内外信号传导通路与细胞中uPA表达有着密切关系。Puricelli等的研究表明, 从信号传导通路上来抑制uPA的活性可以从转录水平上干扰纤溶酶原激活剂系统各组分的表达[6]。

《3 尿激酶型纤溶酶原激活剂系与肿瘤》

3 尿激酶型纤溶酶原激活剂系与肿瘤

既然uPA系统在细胞间质的水解过程中起重要作用, 参与组织的改造和细胞的迁移, 那么可以设想, 它应该在肿瘤组织中呈现高表达状态。许多研究表明, 良性肿瘤细胞表面很少表达uPA, uPAR及PAI, 而浸润性的恶性肿瘤细胞大多有这些物质的表达。Hudson等在试管内运用流式细胞术和免疫组化染色技术分析人类膀胱癌细胞系RT4, T24, EJ, 253J等4种细胞中uPA, uPAR的表达, 发现T24, EJ, 253J表达uPAR, 其中EJ, 253J表达uPA水平最高, 浸润能力最强[4]。这种结果可能与不同细胞系生物学特异性有关。唐辉滨等应用免疫组化对uPA在乳腺肿瘤表达的研究得出, 在恶性组织中uPA的水平明显较良性增生和正常组织为高[7]。Jane等将啮齿动物骨肉瘤细胞 (uMRI06-01) 接种到裸鼠的胫骨上, 利用原位杂交技术, 第4天在胫骨肿瘤细胞检测到uPARmRNA的表达, 而第4周当肿瘤浸润周围组织时, uPA和PAI-1mRNA的表达明显增加, 在肺浸润灶也检测到uPA系统mRNA和骨有关蛋白的表达, 推论uPA及其受体的表达可能不仅对肿瘤局部浸润、原发肿瘤的生长而且对肿瘤远处的浸润和植入都起重要作用[8]。Saluda-Gorgul等研究发现在各类原发性无淋巴转移的浸润性乳腺癌中, uPA, uPAI-1和uPAI-2的含量有显著意义的增加, 其中PAI-2增加最明显, 是鉴别原发性乳腺癌可靠的标记物[9]。

uPA系统各组份是否随着肿瘤分期、分级的增加而明显增加, Seddighzadeh等研究发现已浸润肌层的膀胱肿瘤 (T2+) , 其uPA和uPARmRNA的表达量显著高于T1和Ta期膀胱肿瘤, 且uPA的水平与膀胱肿瘤相对危险度相关[10]。Word等对结肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、食道癌等恶性肿瘤的研究也得出同样结果, 即随着肿瘤分期、分级增加, uPA, uPAR和PAI-1的表达显著增加, 且增加水平与病人生存期呈负相关。以上研究表明肿瘤患者肿瘤组织中uPA系统各组份的含量可以作为肿瘤良恶性的参照。这对肿瘤的临床治疗有一定参考价值, 有报道认为uPA和PAI-1的测定有助于无淋巴转移、低风险的乳腺癌病人免受辅助性化学治疗。 但uPA各组份含量与分期及分级的定量关系有待进一步研究。

综上所述uPA系统对于肿瘤的诊断, 分期、分级, 治疗及预后有一定的临床意义。

uPA系统在子宫内膜癌中的研究已成为热点。1956年, 已有学者证实在人子宫内膜组织中含有丰富的PA, 其活性随月经周期变化。体内外的研究均证实, 月经周期子宫内膜PA活性的周期性变化受雌孕激素的调控, 雌孕激素联合刺激时, 子宫内膜PA活性升高而PAI-1活性受抑制, 单独的孕激素作用则相反。陈贵安等研究发现, 增殖期子宫内膜含有两种PA (tPA和uPA) , 分子量分别为70 000与54 000, uPA含量明显高于tPA[11]。分泌期子宫内膜仅含有uPA, 含量明显高于tPA。分泌期子宫内膜的uPA含量明显低于增殖期。陈贵安的研究还表明, 子宫内膜中PA活性增殖期高, 离体培养下间质细胞、腺体分泌tPA及uPA含量受雌激素刺激增加, 这与月经前半周期子宫内膜间质与腺体产生分裂增殖过程一致。充分提示升高的PAS活性诱发一系列纤溶酶反应, 引起蛋白水解液化细胞外基质, 为细胞分裂增生及迁移提供必要的细胞外环境。排卵前雌二醇值诱发宫腔液PA活性极大提高、增强的纤溶活性水解宫腔分泌液蛋白, 使之稀薄流动, 利于精子经宫腔上行[12,13]。排卵前宫颈粘液清亮、稀薄的性状也需要蛋白水解酶的作用, 因而可能也与PA活性升高有关。Schatz等人应用酶联免疫吸附测定等实验, 发现子宫内膜间质细胞在体外经孕激素处理, 明显降低uPA活性及其mRNA水平, 增加PAI-1释放及其mRNA水平[14]。并且这种作用能被孕激素的拮抗剂——RU486所阻断和逆转。Casslen发现孕激素可以引起内膜间质细胞PAI-1的mRNA表达增强, uPAmRNA无明显变化, 但蜕膜细胞膜上uPAR明显增多, 可使结合型uPA增多, 而结合型uPA的清除率远远大于游离型, 因此推测孕激素通过调节PAI-1的转录来促进PAI-1分泌, 加速uPAR的清除速度来降低uPA的浓度及活性[15]。

关于uPA系统在子宫内膜癌中表达的研究, 国内外的研究绝大多数集中在uPA系统组份在子宫内膜癌组织上的抗原表达。很多学者证实在子宫内膜癌组织中uPA水平较癌旁组织和绝经后正常妇女内膜明显升高。吴翠娇等运用免疫组织化学SABC方法测定, 在正常子宫内膜及癌前病变组织中, uPA分布于内膜表面上皮, 腺上皮细胞及血管基底膜, 间质细胞未见表过, 细胞着色浅, 染色较均匀[16]。但在癌组织中, 内膜表面上皮、腺上皮细胞膜上仍有分布, 胞浆中也存在。但癌细胞染色深, 且着色呈明显不均一性;间质组织中的某些成纤维细胞, 巨噬细胞亦有染色;常以癌巢周边与细胞间质成分邻近的部分染色较强。Taponeco等运用免疫组化方法发现, 在子宫内膜癌中uPA和PAI-1的表达比正常内膜及增生内膜明显增强, 在子宫内膜癌组织的基质中, uPA呈强表达[17]。

一些学者对子宫内膜癌中uPA的含量进行了定量的检测, 如Gleeson用ELISA法测定正常子宫内膜组织, 结果显示低浓度uPA水平 (浓度范围0.15~0.5, 平均3.4 ng/mg protein) , 而子宫内膜癌中全部显示高水平uPA (浓度范围0.41~9.2, 平均3.4 ng/mg protein) , 有显著性差异[18], 此结果与许多学者观点均相同。U.Kohler等用ELISA分别测定子宫内膜癌组织, 正常组织中uPA, PAI-1的含量, 结果发现:在子宫内膜癌中uPA, PAI-1的含量 (uPA 1.89 ng/mg, PAI-1 3.04 ng/mg) 明显高于正常内膜组织中uPA, PAI-1的含量 (uPA 0.84 ng/mg, PAI-1 1.01 ng/mg) , 但uPA的含量与癌组织病理学分期没有关系, 而PAI-1的含量G2/G3明显高于G1 (5.08 ng/mg VS 2.19 ng/mg) [19]。对于uPA含量与临床分期及分级的相关性, Gerstein ES等运用ELISA方法测定121例内膜癌和18例不同程度内膜增生, 发现内膜癌中uPA和PAI-1的含量大大高于增生内膜的含量, 并且uPA的含量随着癌组织浸润子宫肌层的深度有关[20]。这与U.Kohler等的研究相反, U.Kohler等的研究表明uPA的含量与癌组织病理学分期没有关系。Osmak M等[8]运用ELISA方法研究发现, uPA, PAI-1, PAI-2在子宫内膜癌中的含量明显高于正常子宫内膜组织 (uPA:1.266~0.633 ng/mg protein, PAI-1:4.468~1.958 ng/mg protein, PAI-2:3.428~0.483 ng/mg protein) , 并且uPA, PAI-1与癌组织分级、分期无关[21]。Gleeson采用ELISA法测定发现正常子宫内膜组织中存在低浓度PAI-2 (范围1.1-3.1, 平均1.5 ng/mg protein) , 子宫内膜癌组织中均存在高浓度PAI-2 (范围1.6~27.3, 平均4.9 ng/mg protein) , p<0.01。且PAI-2浓度在Ⅰc-Ⅲc期 (范围1.7~27.3, 平均6.9 ng/mg protein) , 比在Ⅰa-Ⅰb期 (范围1.6~5.8, 平均2.8 ng/mg protein) 高, 差异显著。但显示PAI-2浓度与组织学分级无关。造成这种差异相反的原因可能由于实验所采取的方法不同, 也可因病例选择差异所致, 有待进一步研究。

uPA系统可以作为预测预后的指标, 国外学者的研究发现, 在早期子宫内膜癌中uPA, PAI-1的含量越高, 术后生存率越低[22]。Nordengren J等报道, 高PAI-2与早期子宫内膜癌术后短期生存率有关, 而高uPAR对于早期子宫内膜癌没有预测性[23]。

关于子宫内膜癌患者血浆中uPA水平的报道很少, 且存在争议。Saito称其血浆中uPA的水平无明显变化[24], 而Koelb研究认为其含量比正常对照组高[25]。国内关于子宫内膜癌uPA血浆含量未见报道, 有与这相关的报道, 如贾海燕等运用改良ELISA测定正常静脉血流阻断前后血浆组织型纤溶酶原激活剂含量结果分别为:6.2±2.3 ng/ml和10.4±3.6 ng/ml[26]。陈卫昌等运用双抗体夹心ELISA法测定胃癌患者血清uPA含量[27]。

《4 结语》

4 结语

子宫内膜癌中uPA各组份呈高表达状态, 至于各组份是否与子宫内膜癌组织分级、分期有关, 仍存在争议;子宫内膜癌患者血浆中uPA含量是否比正常人有所变化, 有待进一步研究。