《1 前言》

1 前言

放置宫内节育器（IUD）是我国育龄妇女最常用 的避孕方法之一，约占40 %左右[1] 。我国是一个人 口大国，计划生育是一项长期的基本国策，近年来 全国 IUD 使用的流行病学调查显示 IUD 使用后的 一些副反应如子宫异常出血和不适感等副反应仍 未能较好地解决[2] 。如何消除或减轻放置 IUD 后所 产生的各种副作用、增加使用者的舒适程度，是一 个迫切需要解决的难题。本研究根据囊型IUD[3] 的 设计特点，笔者研制出新配方的硅橡胶材料用于囊型 IUD 的制作。为了评价这种高分子聚合材料的 细胞毒性，为临床的安全使用提供依据和资料，本 实验对此材料的细胞毒性进行了研究，现报道 如下。

《2 资料和方法》

2 资料和方法

《2.1 实验材料与主要试剂》

2.1 实验材料与主要试剂

1）实验材料：硅橡胶材料[4] （ 配方：100质量份乙 烯基硅油；40质量份气相二氧化硅；10质量份六甲 基二硅氮烷）由华南理工大学材料学院提供；高密 度聚乙烯由广州华粤行仪器有限公司提供。

2）实验溶剂：RPMI1640 完全培养液（含 RPMI1640 培养液、青霉素/链霉素，胎牛血清）；批号： 8112835、12110511、NWJ0473；级别：细胞级；有效期 至：2013-06-19；生产单位：GIBCO、杭州吉诺生物医 药有限公司、Hyclone。

《2.2 实验动物及细胞培养》

2.2 实验动物及细胞培养

采用小鼠成纤维细胞 L-929。来源：中山大学 实验动物中心细胞库。于广东省医学实验动物中 心细胞室，37 ℃、饱和湿度和 5 %二氧化碳的环境 培养。于 100 mm 培养皿加入 10 mL RPMI1640 完 全培养液。待细胞长至80 %~90 %汇合时，弃去原 培养液，磷酸盐缓冲溶液（PBS）液洗涤2次，0.25 % 胰酶消化 1 min，吸弃胰酶，加入 RPMI1640 完全培 养液。

《2.3 细胞检查》

2.3 细胞检查

对传代细胞观察 3 d。期间每日检查细胞一 次，细胞未见异常，培养液未见异常，该株细胞纳入 实验。

《2.4 剂量设计与分组》

2.4 剂量设计与分组

细胞毒性：依据 GBT 16886.5—2003《医疗器 械生物学评价第 5 部分体外细胞毒性试验》，设立 空白对照组、阴性对照浸提液组、阳性对照液组、 100 %、50 %和 25 %浓度的材料 A 浸提液组，共 6 个组。

《2.5 浸提液的制备》

2.5 浸提液的制备

1）供试品浸提液的制备：称取4.0 g材料，用纯 净水冲洗干净，用滤纸吸干后，制成10 mm×50 mm 块状，进行 115 ℃高压灭菌 30 min，以含 RPMI1640 完全培养液为浸提介质，按照0.2 g样品/ mL浸提介 质，37 ℃振荡浸提24 h，分别制备出浸提液20 mL。 取上清液作为100 %样品浸提液，然后用RPMI1640 完全培养液配成50 %和25 %浓度。

2）阴性对照液提液的制备：准确称取2.0 g高密 度聚乙烯材料，用纯净水冲洗干净，用滤纸吸干后， 剪成约10 mm×50 mm块状，进行Co60辐照灭菌，以 含RPMI1640完全培养液作为浸提介质，按照0.2 g 样品/ mL 浸提介质，37 ℃振荡浸提 24 h，制备出浸 提液10 mL。

3）阳性对照液提液的制备：含6.3 %苯酚的 RPMI1640完全培养液。

4）空白对照液提液的制备：不含供试品材料的 RPMI1640 完全培养液。在浸提期间，置于与供试 品材料同样的容器中并采用同样的浸提条件。

《2.6 实验方法及结果评价》

2.6 实验方法及结果评价

1）实验方法：用 RPMI1640 完全培养液培养 L929 细胞，当细胞达到其对数生长期末细胞趋于 融合时，用消化液消化细胞，用细胞培养液制成 1×104 个/mL 的细胞悬液；将细胞悬液接种于 96 孔 培养板，每孔 100 μL，轻轻水平转动培养板使细胞 均匀地分散在皿孔表面；置37 ℃、5 % 二氧化碳培 养箱中培养 24 h；弃去原培养液，每组加入 100 μL 的空白对照液、阴性对照浸提液、25 %、50 %和 100 %浓度的材料A浸提液、阳性对照液，每组设8孔 （不使用边缘孔，边缘孔用PBS填充）；置CO2培养箱 中继续培养72 h，显微镜下观察细胞形态；每孔加入 噻唑兰（MTT）溶液20 μL，继续培养4 h。弃去孔内 液体，每孔加二甲基亚砜（DMSO）150 μL，轻轻振荡 10 min；用酶标仪测定每孔的吸光度，测定波长为 570 nm，参考波长为630 nm。

2）结果评价：a.细胞相对增值率（RGR）的计算： RGR＝ × 100 % ；b.显微镜观察细 胞毒性分级标准。细胞毒性分级标准：0 级，无反 应，细胞形态正常，贴壁生长良好，胞浆内有离散颗 粒，无细胞溶解；1级，反应极轻，至多20 %的细胞呈 圆形，疏松贴壁，偶可见细胞溶解；2级，反应轻微， 至多50 %的细胞呈圆形，无胞浆内颗粒，明显可见 细胞溶解和细胞间空间；3级，反应中度，至多70 % 的细胞呈圆形或溶解；4级，反应重度，细胞层几乎 完全破坏。

3）RGR 与细胞毒性分级的关系判断标准： 0 级，RGR 100 %；1级，RGR为80 % ~ 99 %；2级， RGR 为 50 % ~ 79 %；3 级，RGR 为 30 % ~ 49 %； 4 级，RGR为0 % ~ 29 %（要求阴性对照组的反应不 大于1级，阳性对照组反应大于3级）。

《3 结果》

3 结果

《3.1 各组的细胞毒性级别》

3.1 各组的细胞毒性级别

6组的细胞毒性如下所示。空白对照组：0级； 阴性对照浸提液组：1级；阳性对照组：4级；100 %浓 度材料浸提液组：2 级；50 %浓度材料浸提液组： 2 级；25 %浓度材料浸提液组：1级。

《3.2 各组的细胞增殖率测定》

3.2 各组的细胞增殖率测定

100 %浓度材料浸提液组、50 %浓度材料浸提 液组、25 %浓度材料浸提液组培养72 h后细胞OD 值 分 别 是 0.694 ± 0.045、0.759 ± 0.0364 和 0.850 ±0.044；RGR值分别是（66.2 ± 4.3）%、（72.4 ± 6.1）%、 （81.1 ± 4.2）% 。 阴性对照浸提液组（OD 值 为 0.914±0.065，RGR为（87.2±6.2）%）、100 %浓度材料 浸提液组、50 %浓度材料浸提液组、25 %浓度材料 浸提液组和阳性对照浸提液组（OD 值为 0.190± 0.011，RGR为（18.1±1.1）%）与空白对照组（OD值为 1.047±0.053，RGR为（100.0±5.1）%）比较，差异有统 计学意义（t =2.78，P <0.05）；空白对照组、100 %浓度 材料浸提液组、50 %浓度材料浸提液组和阳性对照 液组OD值与阴性对照浸提液组比较，差异有统计 学意义（t =3.04，P <0.05）。

《3.3 细胞毒性光学显微镜下观察结果》

3.3 细胞毒性光学显微镜下观察结果

在细胞培养 24 h 、48 h 、72 h 后分别倒置显微 镜观察可见：空白对照组细胞贴壁生长，数量逐渐 增加，折光性强，多为长梭形和多角形，并见圆形分 裂状态细胞；在培养 72 h 后，阴性对照浸提液组约 85 %以上的细胞形态正常、贴壁生长良好、胞浆内 有离散颗粒，偶见细胞溶解；阳性对照液组细胞数 量明显减少，细胞变圆缩小、甚至崩解；25 %材料浸 提液组从培养48 h后开始有细胞圆缩，可见一小部 分的细胞溶解，在培养72 h后，约有20 %的细胞呈圆形或溶解；50 %、100 %材料浸提液组从培养48 h 后开始有细胞圆缩，明显可见细胞溶解和细胞间空 间，在培养72 h后，约有30 %、35 %的细胞呈圆形或 溶解（见图1）。

《图1》

图1 6组细胞培养72 h光学显微镜图片

Fig. 1 Optical microscope images of six groups of cell to culture 72 h

《4 讨论》

4 讨论

放置IUD是目前公认的一种放置时间较长、安 全可靠、长效简便、经济和可逆的避孕方法。经数 代研究者努力，IUD的有效性和安全性都有了显著 的提高，大大提高了育龄妇女对IUD的接受性。国 内外研制出的不同类型的 IUD，各有优劣：如活性 IUD的避孕效果好于惰性IUD，失败率降低；IUD的 铜面积越大，避孕失败率越低；含孕激素 IUD 虽避 孕失败率低，但易出现闭经等副反应；新型无支架 的 GyneFix 在 降 低 脱 落 率 、妊 娠 率 方 面 优 于 Tcu380A IUD，但放置失败率较高[5] 。目前，众多类 型的仍存在脱落、妊娠、出血、疼痛等副反应[6] ，影响 了 IUD 的推广使用。通过对 IUD 使用的流行病学 调查发现，IUD的质量及在子宫腔中面积大小和类 型与放置 IUD 后月经失血量的多少、疼痛、脱落和 意外妊娠有关[7] 。为了适应子宫在静止或收缩时的形态，增强宫腔对 IUD 的适应性，人们发明了多种 形态各异的IUD，但是仍然不能完全摆脱上述副作 用的困扰。目前使用较多的圆型、元宫型及 T 型 IUD等均是以金属或塑料为支架，加上铜套或铜线， 放置到子宫内发挥其避孕作用。随着妊娠病理、生 理的深入研究和相关学科的发展，人们对IUD避孕 原理的认识进一步加深，要求对IUD形态和材料进 行相应的改进和革新。因此，研制一种新型宫内节 育器，在不影响IUD避孕效果的基础上减轻IUD的 副反应具有显著的临床意义。

笔者根据 IUD 与宫腔有效接触可阻止妊娠的 原理，利用球囊的可变形性和可扩张性，一方面使 之与子宫内膜有尽可能大的接触面积从而阻碍胚 胎的着床，有效阻止妊娠；另一方面也增加 IUD 在 宫腔内的顺应性，使IUD的形状和大小与宫腔的形 态尽可能相适应，从而减少脱落及不适感的发生。 硅橡胶对人体无刺激具有良好的生物相容性，作为 长期植入体内的材料已经得到广泛的应用。其性 质主要与直链聚硅氧烷的化学结构有关，其分子主 链由Si―O―Si链组成，具有优良的热氧化稳定性， 在用于人体的时候表现出了无毒及生理惰性，与皮 肤接触不引起刺激，具有选择透气性、缓释的功 能。利用其这一特点，设想利用特殊的硅橡胶制作 成 IUD 置入宫腔可以有效地减轻 IUD 对子宫内膜 的刺激，避免现有IUD的副作用。在参考目前常用 的植入人体的医用材料基础上，笔者研制出特定配方的医用硅橡胶材料用于囊型IUD的制作，此种材 料具有重量轻、软硬适中、具有一定的弹性、耐腐蚀 性和一定控释性等性能，这样一方面不增加IUD本 身的质量，另一方面又可以减轻对子宫的刺激。笔 者研究在对囊型 IUD 的形态与规格进行合理设计 的基础上，对研制的高分子硅橡胶材料性能进行测 试，对其细胞毒性的潜在性作出评价。选用小鼠成 纤维细胞 L-929，通过不同浓度的供试材料浸提液 培养细胞后观察细胞形态和细胞增值率。结果根 据GBT 16886.5―2003医疗器械生物学评价第11部 分标准判定，所测囊型宫内节育器避孕材料细胞 毒性分别为2级、2级、1级，为临床的安全使用提供 依据。