《1  前言》

1  前言

乙型肝炎(乙肝)是危害我国人民健康最严重的疾病之一。我国现有约1.2亿名乙肝表面抗原(HBsAg)携带者,不仅可成为传染源,部分人还可发展成为慢性肝炎,肝硬化,及肝癌患者。预防性乙肝疫苗在世界及我国均已证实可有效地预防乙肝,但对乙肝患者并无疗效。目前用于治疗乙肝的干扰素和作用于病毒逆转录酶的新药拉米芙定(lamivudine)虽有抑制病毒复制的效果,但健药后病毒常恢复复制,并已发现有抗药变异株。此外,上述治疗价格昂贵,需长期注射或服用,难以被广大悦者所采用。我们于1986年发现我国90%以上的乙肝患者肝内无病毒基因整合,提出了可以治愈乙肝的观点“。1988年在研究与分析乙肝患者的免疫应答后,提出我国多数乙肝患者为幼龄感染病毒,处于对HBsAg的免疫耐受状态。设想用修饰HBsAg或用合成肽等改变抗原,或改变抗原君递方式等新治疗策略以治疗乙肝患者。这一新思路自1988年获国家高科技计划资助至今。首先在国内外无先例的条件下建立了鸭乙肝免疫耐受动物模型并利用这一模型研究了多种类型的治疗性疫苗^[2~5]，最终发现抗原-抗体免疫原性复合物(Immunogenic Complex简称IC)可有效地在部分鸭中清除病毒及病毒抗原,认为可发展成为可供人体应用的治疗性疫苗。这一技术已于1997年获国家发明专利(专利证书号ZL931124093)。1997年起,治疗性乙肝疫苗已被列为“863“计划重大项目,现已完成重组型治疗性乙肝疫苗(YIC)的实验研究,通过了部级鉴定,已由北京生物制品所进行中试,将申报临床研究。

在我国研制治疗性乙肝疫苗的同时,法国巴斯德研究所的Tioliais等开始用HBsAg转基因鼠进行了实验研究^[6]。其路线为仅用HBsAg或病毒包膜抗原(HBsAg+PreS2)作为免疫原,进行了人体实验,有一定疗效^[7]。近年来,该所学者又转为研究核酸疫苗(DNA Vaccine)在转基因鼠中的疗效^[8]。90年代中期以来,美国学者研究了病毒核心抗原合成肤交联佐剂组建治疗性疫苗,在转基因鼠中虽有较好效果,但在黑猩猩中结果不理想。此外,史克,Chiron等公司也在90年代中后期开展了乙肝治疗性疫苗的研制,其路线均为用不同佐剂提高HBsAg的免疫原性。本课题组所采用的IC治疗性疫苗与上述疫苗的路线根本不同,是通过改变对HBsAg的昌递方式以诱生有效的克疫,消除免疫耐受性。本课题组对IC治疗性乙肝疫苗进行了作用机理研究,动物实验及生产工艺研究。现将基础理论研究及动物实验的结果介绍如下:

《2  抗原-抗体免疫原性乙肝治疗性疫苗的机理研究》

2  抗原-抗体免疫原性乙肝治疗性疫苗的机理研究

为消除对HBsAg的免疫耐受性,本项目设计的治疗性疫苗是通过将HBsAg与相应的特异抗体(抗-HBs)拍一定比例及工艺结合组成复合物(IC)。IC中的抗体分子的Fab段可与HBsAg结合,而抗体分子的Fc段可与抗原呈递细胞(APC)表面的Fc受体结合,从而将复合物中的HBsAg带入APC内,促进HBsAg被APC所摄取。鉴于IC被摄取后,其中的抗原昔递方式可不同于单独抗原的君递,会更有效地激活T辅助细胞(TH),诱生免疫介导的细胞因子及/或特异抗体。

《2.1  证实抗体中的Fe段是促进APC摄取IC的关键》

2.1  证实抗体中的Fe段是促进APC摄取IC的关键

应用对HBsAg有免疫应答的Balb/c小鼠,用刀豆蛎白A腹腕注射获得巨喜细胞,分别与HB-sAg、anti-HBs,IC孵育。细胞经洗涤,裂解后测定被吞噬的HBsAg的百分率。结果IC的吞噬率为64.5%,而HBsAg的吞噬率仅为2.5%。分别用羊抗-HBs,鼠抗-HBs组建IC免疫鼠,结果前者免疫诱生的抗-HBs远低于后者。这是由于APC表面的Fc受体只识别同种动物抗体的Fc段, 羊抗~HBs只有聚集HBsAg的作用而无通过Fc促进吞噬的作用,故免疫效果较差^[9]。用胃蛋白酶消化去除鼠一抗一HBs的Fc后组建IC,因缺少Fc段,鼠腹腕巨噬细胞吞噬复合物的百分率大大降低^[9]。

《2.2  证实IC经APC的君递作用后可更有效地激活T细胞》

2.2  证实IC经APC的君递作用后可更有效地激活T细胞

取分别经HBsAg,IC,抗-HBs孵育的巨嘧细胞,与同品系小鼠浓集脾胃来源的T细胞同孵育,用³H-TdR掺入实验测定T细胞增值反应,结果显示经与IC孵育后的巨噬细胞可更有效地促进丁细胞增殖(表1)。

《表1》

表1 鼠腹腔巨嘧细胞的抗原君递作用^[10]

Table1 Antigen presentation of mouse peritoneal maerophages

*³H一T4R撸入的cpm数书与其他cpm数相比 p<0.01

《2.3  证实经IC免疫的小鼠脾细胞在HBsAg刺激下可诱生更高水平的TH1型细胞因子》

2.3  证实经IC免疫的小鼠脾细胞在HBsAg刺激下可诱生更高水平的TH1型细胞因子

分别用HBsAg及由HBsAg与鼠抗-HBs组建的IC免疫小鼠,取脾细胞,经HBsAg刺激后,用细胞因子试剂盒(Amersham公司产品)检测y一干扰素,白细胞介质一2,白细胞介素-4,白细胞介素-5及肿瘤坏死因子a。结果显示IC免疫鼬牌细胞较HBsAg免疫鼠脾细胞经特异抗原刺激后,可诱生更多的THI型细胞因子(表2)。

《表2》

表2 用IC或HBsAg免疫鼠脾细胞在HBsAg作用下诱生的细胞因子^[10]

Table 2 Cytokines induced by HBsAginHBsAg or IC immunized mouses plenocytes

*与HBeAg免疫限比软p<0.02

以上实验证实了IC乙肝治疗性疫苗设计路线的理论,从而为进一步开发与生产IC治疗性疫苗萸定了基础。

《3  重组酵母菌表达的HBsAg与鼠抗-HBs组建成IC(YIC)的免疫原性研究》

3  重组酵母菌表达的HBsAg与鼠抗-HBs组建成IC(YIC)的免疫原性研究

为组建可供乙肝患者应用的IC治疗性疫苗,选择我国北京生物制品研究所生产的HBsAg为原料(ZHBsAg),并与国外的重组HBsAg进行了抗原电镜观察,免疫原性,抗原结合力,纯度等性能的对比。建立了制备YHBsAg-鼠抗一HBs复合物的方法,在鼠中首先进行了免疫原性实验研究。结果见图l。与HBsAg相比,YIC在鼠中初次免疫后显示略增强免疫应答效果,但经再次免疫后IC诱生的抗HBs的效价(log3.9±0.3)可达单用HBsAg免疫鼠抗体效价(log2.4±0.25)的10倍以上。通过mRNA的细胞因子半定量测定方法,发现用YIC免疫的鼠腐细胞经用HBsAg刺激后,诱生IFN-7的mRNA(24h,T/C为1.07),明显高于单用HBsAg免疫的小鼠(24h,T/C为0.71)。而IL4的mRNA则在两组间无明显差异(图2)。这些实验证明我国生产的YHBsAg可作为原料制备YIC,并可刺激机体产生比单独HBsAg免疫更强的体波及细胞免疫应答。

《图1》

图1 YHBsAg与YIC免疫小鼠血清抗-HBs动态

Fig.1 Anti-HBs response induced by YHBs Agand YIC with alum

《4  YXIC在对HBsAg低应答鼠中的免痛原性》

4  YXIC在对HBsAg低应答鼠中的免痛原性

应用现有的乙肝预防性疫萌发现,约有3%一5%被免疫者仅出现低效价的抗-HBs,或不产生抗-HBs,难以达到有效预防的效果,被称为低反应者或无反应者。由于YIC可增强机体的免疫应答,进一步研究了YIC是否可在低免疫应答机体中诱生有效的抗体。与国外合作应用了对HBsAg正常反应鼠B10咸系及低反应鼠B10.S品系,分别用HBsAg及YIC进行了免疫对比研究。结果见图3。实验结果显示,用YIC免疡B10.S鼠加或不加氢氧化铣佐剂均可诱生与BI0鼠相似效价的抗HBs,而单用HBsAg则无此作用,说明YIC可有效地提高低克疫应答鼠对HBsAg的克疫应答。

《图2》

T-IFN-7 或 IL-4mRNART-PCR扩增产物; C一设计的内对照扩增产物; T/C一细胞图孔与内对照之比; HPRT-次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(a house keeping gene)

图2  YHBsAg及YIC免疫小鼠腐细胞特异诱生IFN-Y及IL-4mRNA半定量研究

Fig.2 Semi-quantification of IFN一Y and IL-4 mRNA in splenocytes of YHBsAg and YICim-munized mice

《5  IC在HBsAg转基因鼠中的治疗效林》

5  IC在HBsAg转基因鼠中的治疗效林

为研究IC的疗效,与国外合作应用了HBsAg转基因鼠(TgE),共分为3组每组10只鼠,按雌雄各5只再分成两小组。三组所用的免疫原如下:同源IC免疫组,每只鼠肌肉注射含2gHBsAg与鼠抗-HBs组建的IC及佐剂氢氧化铝;非同源IC免疫对照组,每只鼠肌肉注射含2gHBsAg与人抗-HBs组建的IC及佐剂氢氧化铣;不注射的对照

《图3》

图3  正常应答鼠(B10)与低应答鼠(B10.S)中HBsAg与IC免疫后抗-HBs应答

Fig.3 Anit-HBs response in normal responder mice (B10) and low respondermice(B10.S)im-munizedwithHBsAgandIC

组。共免疫4次,每次免疫间隔3周。每组动物于免疫前及免疫后第3、6、9、12周分别检测HB-sAg量及抗-HBs效价,各组动物的HBsAg转阴率及血清抗-HBs的平均效价见表3。结果显示在转基因鼠中IC可使部分小鼠HBsAg转为阴性并出现抗体。同源IC组显然有疗效,但不同源IC免疫组则几乎未见疗效,更进一步证明IC是通过抗体的Fc段而发挥作用。结果还显示IC在雌性鼠中的疗效较雄性鼠为好。理论上转基因鼠所表达的抗原应相当稳定,但在本实验过程中部分转基因鼠出现自发HBsAg消失,反眨转基因鼠作为疗效动物模型的不足之处。根据对照组小鼠中始终未出现抗-HBs,而IC治疗组中可诱生抗~HBs,说明治疗组鼠是通过特异性免疫应答,清除了持续存在的HB-sAg。

《6  总结与讨论》

6  总结与讨论

本课题组经过十余年研究,以消除对乙肝表面抗原的免疫耐受性为治疗目标,首先建立了鸭乙肝免疫耐受动物模型,设计了多种候选的治疗性疡苗,经过实验证明IC是有效又可行的乙肝治疗性疫苗。通过小鼠的实验研究,揭示了这一疫苗的作用机理是以IC中抗体Fe段与APC表面的受体结合,促进APC摄取IC,通过改变抗原的昌递方式,有效地激活T细胞,释放更高水平的IFN-Y等THI型细胞因子。IC不仅可在HBsAg低反应鼠中诱生抗-HBs,还可在HBsAg转基因鼠中清除部分鼠的HBsAg及诱生抗-HBs。本研究结果显示IC可用于治疗乙肝患者,并有可能获得较好的疗效。

本课题组还完成了用YHBsAg和人高效价抗HBs免疫球蛎白(简称HBIG)制备供人体应用治疗性疫苗的实验室工艺,产品标化及参比的效力实验。现已由北京生物制品所进行中试及申报临床研究。

《表3》

表3 IC在HBsAg转基因鼠(T8E)中免疫效果

Table 3 Results of IC immunization in HBsAg transgenic mice(TgE)

由于本课题立项早,十余年来得到“863“计划的持续支持与资助,在研究中对理论研究与开发产品并重,因此当前在国际乙肝治疗性疫苗中得到了国际学术界的重视,并已占有一席之地。本项目的临床研究如能尽早进行,将使我国在乙肝治疗性疫苗的领域中处于国际领先地位。

面对开发和应用治疗性乙肝疫苗的大好前景,我们必须看到治愈乙肝的艰巨性。任何新的治疗制品都有一个逐步认识与完善过程。只有通过临床联系基础,不懈地进行临床研究与科学实验才会取得我国所特有的成就。

Experimental Studies on Recombinant Hepatitis B Immunogenic Complex Therapeutie Vaccine (YIC)

Wen Yumei, He Lifang, Qu Di, Ma Zhangmei,  Yao Xin
(Department of Molecular Vinology, Shanghai Medical University, Shanghai 200032, China )

[Abstract] A therapeutic vaccine composed of HBsAg complexed to anti-HBs (IC) has been developed for viral hepatitis B,Enhanced immune response was induced in hosts immunized with this complex,and the mechanisms of this vaccine was studied in mice。It was shown that the Fe fragment of anti-HBs in the complex was critical for induction of potent immune responses,The Fc fragment of the anti-HBs in the complex could attach to the Fe receptors on the antigen presenting cells (APC),increasing the uptake of HBsAg into these cells. After being ingested,the antigen complexed to antibody could be more effectively processed and presented to T cells,After incubation with macrophages previously treated with IC, 一 cells showed higher proliferation rate, and higher level of interferon-y mRNA was detected。Enhanced immune response in host has also been shown by comparing anti-HBs titer in mice immunized with antigen-antibody complex versus the anti-HBs titer in mice immunized only with HBsAg,More than tenfold increase in anti-HBs was observed in the latter group,In addition,this complex was used to immunize an HBsAg low-responder mouse strain (B10.5)、Compared to the normal responsive counterpart mouse strain (B10),immunization with HBsAg induced (cont. on p. 57)

利;而且实用性强、投资省、效益高,即根治了两个行业的污染,调整了产业结构,保护环境和生态平衡,并将推动燃煤电力、水泥、新材料、煤炭、建筑、环保等行业的发展,可以说本发明开辟了生态效益型的经济增长之路。

Clean Burning Process of Coal Which ConyertsPollutants into Value-added Products

Zhu Xuefang
(Chinese Academy of Sciences, Beijing 100864, China )

[Abstract] The new technology of clean burning of coal and simultaneousiy converting the resultants into value-added products is to add a special admixture in coal and grind them together to form affinity granules,which are sprayed into the boiler of the power plant for affinity calcination,The technology,while ensuring power and heat supply, decreases the contents of carbon residue,NOx and CO raises the activity of pulverized coal ashes conducts soild desulfurization,and turns al the solid resultants into quality cemtnt clinkers in the quick burning and quick cooling boiler,thus eliminating gas and solid pollution without producing secondary pollution,and realizing clean production.

[Key words] clean burning； turning resultants into value-added products； quick burning and quick cooling;
solid desulfurization; affinity granules； atfinity calcination

《cont,from,p,42)  low titer of antibody,whereas,immunization using HBsAg-anti-HBs complex,B10.S mice responded by producing similar level of anti-HBs as that induced in the B10 mice,When the complex was used to immunize HBsAg positive transgenic mice (TgE), after four injections,in the female mice,72% cleared HBsAg and developed anti-HBs (mean titer 1:1070 by EIA); while in the male mice,54% cleared HBsAg and developed anti-HBs (mean titer 1:455 by EIA)、Though some of non-immunized mice lost their HBsAg spontaneously during the experiment,none developed anti-HBs。 Data showed that this immunogenic complex has promising potential to be used for the treatment of hepatitis 丁 patients,For human use,a theraPeutic vaccine composed of yeast-derived recombinant HBsAg complexed to human high-titer anti-HBs immunoglobulin (HBIG) has been developed、Standard procedure for manufacturing this complex,as well as in vitro assay for monitoring its effect were also established,This complex wil be further optimized for mass pro-duction and application for clinical trial will be submitted.

[Key words] hepatitis B; therapeutic vaccine；i antigen-antibody complex； immune responses