《1.引言》
1.引言
玉米醇溶蛋白是玉米主要的贮存蛋白之一，是玉米产业的主要副产品[1]。它独特的疏水性驱使研究人员研究它在食品工业之外的潜在应用价值[2]。我们课题组第一个将玉米醇溶蛋白作为一种生物材料应用于组织工程领域，并证明了它具有良好的组织相容性和机械特性。玉米醇溶蛋白多孔支架的第一个产品可被用作骨替代物[3–6]。作为一种三类医疗器械，其原材料的质量监控、合适的灭菌方法，以及生物相容性都是需要研究的。
首先，原材料的质量必须稳定且可控。我们发现不同途径购得的玉米醇溶蛋白具有不同的外观，且影响了支架成型和其机械性能。这促使我们来研究经不同途径购得的玉米醇溶蛋白的差异。
灭菌过程的控制对于无菌医疗器械制造商的质量管理体系至关重要。灭菌过程的控制水平直接影响了无菌医疗器械的质量和安全。对于制造商来讲，最传统的灭菌方法是环氧乙烷灭菌法。然而，这种方法可能会导致环氧乙烷在多孔支架中的残留[7,8]。因此，我们研究了其他传统的方法，如湿热灭菌法、干热灭菌法和γ射线灭菌法。但是，这些方法也可能会对玉米醇溶蛋白结构的稳定性造成影响，因为温度和压强可能会影响蛋白质的结构[9]。例如，所使用的γ射线含有大量的能量，这可能会导致分子电离[10]。
评价细胞增殖的传统方法是3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)实验[11,12]，在我们之前的研究工作中采用的也是这种方法[3–6]。然而最近，我们发现在MTT实验中，玉米醇溶蛋白支架的背景吸光度非常高，可能会影响数据的评价[13,14]。因此，我们尝试了另一种方法——CCK-8实验[15]，并比较了这两种方法在评价玉米醇溶蛋白膜上细胞增殖情况的差异。同时我们也思考了导致玉米醇溶蛋白在MTT实验中具有较高背景吸光度的可能影响因素。
《2.实验材料和方法》
2.实验材料和方法
《2.1.氨基酸分析、十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰氨凝胶电泳和微观形貌表征》
2.1.氨基酸分析、十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰氨凝胶电泳和微观形貌表征
玉米醇溶蛋白1购自小林制药株式会社(日本)，玉米醇溶蛋白2(260-01283)和玉米醇溶蛋白3(261-00015)均购自和光纯药工业株式会社(日本)，玉米醇溶蛋白4(片状)购自吴江八坼药用辅料厂(中国)。我们将片状的玉米醇溶蛋白4用多功能粉碎机(Q-100A2，上海冰都电器有限公司，中国)粉碎并过筛得到玉米醇溶蛋白4粉末。将4种玉米醇溶蛋白粉末分别用6mol·L–1的HCl按照1:6(g·mL–1)的比例溶解，油浴110℃加热22h。完全水解后，将混合物经旋转蒸发浓缩，再经冷冻干燥(FreeZone4.5，Labconco，美国)得到粉末。将粉末溶解在柠檬酸–柠檬酸钠缓冲溶液(pH=2.2)后，用全自动氨基酸分析仪(L-8900，日立，日本)进行分析[16]。
将4种来源的玉米醇溶蛋白用75%(体积分数)的乙醇分别配成浓度为1mg·mL–1的样品溶液。取20μL样品溶液与20μL上样缓冲液混合，90℃水浴加热15min。其中，上样缓冲液由2mL丙三醇、2mL10%(质量分数)的十二烷基硫酸钠(SDS)、1mL2-巯基乙醇、0.5mL0.1%溴酚蓝和0.625mL浓缩胶缓冲液配制而成。变性凝胶电泳使用立式平板凝胶电泳仪(伯乐，美国)进行。所用凝胶由浓度为5%的丙烯酰胺浓缩胶和浓度为12%的丙烯酰胺分离胶组成。在室温下110V电泳30min，之后150V电泳约1h。所用电极缓冲液由3.05g三羟甲基氨基甲烷、14.4g甘氨酸和1gSDS溶解在1L Milli-Q水中配制而成。最后用考马斯亮蓝R250染色使条带可视[17]。
玉米醇溶蛋白粉末的微观形貌用扫描电子显微镜(SEM)(S-3400N，日立，日本)和带有滤光片(U-MSWB2，Olympus，日本)以提供激发光的荧光显微镜(IX71，Olympus，日本)进行研究。
《2.2.玉米醇溶蛋白多孔支架的制作和灭菌》
2.2.玉米醇溶蛋白多孔支架的制作和灭菌
将玉米醇溶蛋白1与氯化钠(粒径为0.3~0.425mm)按质量比1:1.5混合，用不锈钢模具(Φ=1.75mm)对其每面施压0.1MPa保持2min模压成3D支架。之后将支架在55℃水浴30min，取出切成高度为4mm、直径为2mm的圆柱，再冷冻干燥6h即可[4]。
将玉米醇溶蛋白多孔支架在20kGy、25kGy和30kGy剂量的γ射线下照射完成γ射线灭菌[18]。灭菌前后的玉米醇溶蛋白粉末和玉米醇溶蛋白多孔支架由十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测。
将玉米醇溶蛋白粉末放入电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9053A，上海精宏实验设备有限公司，中国)，于160℃保持3h完成干热灭菌。将玉米醇溶蛋白粉末放入高压灭菌锅(HVE-50，Hirayama，日本)，于121℃保持20min完成湿热灭菌。灭菌前后的玉米醇溶蛋白粉末由SDS-PAGE进行检测。
《2.3.细胞培养和增殖》
2.3.细胞培养和增殖
我们采用L929细胞(中国科学院细胞库，中国)来进行细胞研究，使用添加10%新生牛血清(上海远慕生物技术有限公司，中国)和双抗(100U·mL–1青霉素和100μg·mL–1链霉素，国药集团化学试剂有限公司，中国)的GIBCO®DMEM(生命科技有限公司，美国)在37℃5%CO2培养箱(NU-4750E，NuAire，美国)中培养。
玉米醇溶蛋白膜玻片由在直径为8mm的玻璃玻片上涂布10μL浓度为0.1g·mL–1的玉米醇溶蛋白冰乙酸溶液形成。种植细胞前，所有玻片经160℃3h灭菌，之后放入48孔板用培养液浸泡2h。玻璃玻片和玉米醇溶蛋白玻片上L929细胞的种植密度为2×104个·mL–1，测试孔每孔加500μL细胞悬液，本底孔每孔加500μL培养液。孔板培养6天。
《2.4.MTT实验和CCK-8实验》
2.4.MTT实验和CCK-8实验
L929细胞在玻璃玻片和玉米醇溶蛋白玻片上的增殖情况由MTT实验和CCK-8实验评价。评价前，测试孔和本底孔中的溶液均由500μL培养液更换。之后每孔加入50μL浓度为5mg·mL–1的MTT(AMRESCO，美国)溶液或CCK-8试剂(上海翊圣生物科技有限公司，中国)，孔板孵育4h。孵育结束后，对于CCK-8实验，每孔取100μL溶液转移至96孔板；对于MTT实验，用300μL二甲基亚砜(DMSO)替换各孔溶液，振荡10min后，每孔取150μL转移至96孔板。用酶标仪(MultiskanFC，Thermo Scientific，美国)测量各孔的吸光度，CCK-8实验的波长为450nm(n=6)，MTT实验的波长为490nm(n=6)。测试结束后，CCK-8实验的各孔用磷酸盐缓冲液小心清洗，每孔加500μL培养液继续培养。实验在每天的同一时间进行，持续6天。
为了研究MTT实验的本底吸光度，我们将玉米醇溶蛋白玻片和玻璃玻片在培养液或磷酸盐缓冲液(PBS)中浸泡12h。加或不加MTT孵育4h后，用300μL二甲基亚砜替换各孔溶液，振荡10min后，每孔取150μL转移至96孔板。之后在490nm(n=6)波长下测量孔板的吸光度。
《2.5.统计分析》
2.5.统计分析
在本文所有适用的地方，数据均表达为平均值±标准差(n=6)的形式。数据间的显著性差异由单因素方差分析(ANOVA)来评价，p<0.05。
《3.结果和讨论》
3.结果和讨论
《3.1.4种来源的玉米醇溶蛋白的表征》
3.1.4种来源的玉米醇溶蛋白的表征
从外表来看，玉米醇溶蛋白1和2均为白色，而玉米醇溶蛋白3和4为黄色。根据玉米醇溶蛋白的自体荧光，4种来源的玉米醇溶蛋白粉末的形态能够很容易被观察，如图1(a)~(d)。如图1所示，玉米醇溶蛋白1和2的粉末为卵石状，而玉米醇溶蛋白3和4的粉末为碎片状。至于粉末的尺寸，玉米醇溶蛋白3中小尺寸粉末的比例比玉米醇溶蛋白1或2中更高，且直径更小。如图1(e)~(h)所示的SEM图片显示玉米醇溶蛋白1和2均具有光滑的表面，而玉米醇溶蛋白3和4则是多孔的。
《图1》
图1.玉米醇溶蛋白粉末图。荧光显微镜图：(a)玉米醇溶蛋白1，(b)玉米醇溶蛋白2，(c)玉米醇溶蛋白3，(d)玉米醇溶蛋白4；SEM图：(e)玉米醇溶蛋白1，(f)玉米醇溶蛋白2，(g)玉米醇溶蛋白3，(h)玉米醇溶蛋白4。每张图上的比例尺为200μm。
之后我们研究了4种来源的玉米醇溶蛋白的氨基酸组成，如表1所示。图2显示的是作为玉米醇溶蛋白的典型色谱图的玉米醇溶蛋白1的液相色谱图。表1显示，尽管4种来源的玉米醇溶蛋白在形貌上有一定区别，但它们的氨基酸组成并没有显著差异。由于玉米醇溶蛋白的主要氨基酸组成为谷氨酸(24.8%±0.3%)、亮氨酸(19.2%±0.4%)、脯氨酸(9.8%±0.3%)和丙氨酸(9.6%±0.1%)，均为疏水氨基酸，因此玉米醇溶蛋白是一种疏水蛋白非常合理。
《表1》
表1 4种来源的玉米醇溶蛋白的氨基酸组成
《图2》
图2.玉米醇溶蛋白1的色谱图。
图3为4种来源的玉米醇溶蛋白的电泳图。从图中我们可以看到，4种来源的玉米醇溶蛋白均在25kDa和22kDa处拥有两条主要条带，且没有显著差异。
《图3》
图3. 来自不同厂商的玉米醇溶蛋白的SDS-PAGE图。(a)蛋白质分子量标准；(b)玉米醇溶蛋白1；(c)玉米醇溶蛋白2；(d)玉米醇溶蛋白3；(e)玉米醇溶蛋白4。
《3.2.灭菌前后的SDS-PAGE》
3.2.灭菌前后的SDS-PAGE
图4为热灭菌法前后玉米醇溶蛋白的电泳图，表2为其强度分析。灭菌后并没有新条带出现，这表明在干热灭菌和湿热灭菌过程中，玉米醇溶蛋白的肽链没有发生聚合或断裂。这个结果显示两种灭菌方法都是可以接受的。此外，表2显示条带1，即大分子量条带(25 kDa)的比例要小于条带2，即小分子量条带(22 kDa)。
《图4》
图4. 使用不同灭菌方法前后的SDS-PAGE图。(a)蛋白质分子量标准； (b)未灭菌的玉米醇溶蛋白2；(c)干热灭菌后的玉米醇溶蛋白2；(d)湿 热灭菌后的玉米醇溶蛋白2。
《表2》
表2 图4的强度分析
图5为γ射线灭菌前后玉米醇溶蛋白的电泳图，表3为其强度分析。尽管在30kGy剂量下，两条主要条带的相对百分比有些不同，但依然没有新条带产生。因此，γ射线灭菌的推荐剂量25kGy适用于玉米醇溶蛋白支架的灭菌[18]。
《图5》
图5.γ射线灭菌前后的SDS-PAGE图。(a)蛋白质分子量标准；(b)玉米醇溶蛋白2；(c)玉米醇溶蛋白3；(d)玉米醇溶蛋白4；(e)使用20kGy灭菌后的玉米醇溶蛋白(玉米醇溶蛋白2)多孔支架；(f)使用25kGy灭菌后的玉米醇溶蛋白(玉米醇溶蛋白2)多孔支架；(g)使用30kGy灭菌后的玉米醇溶蛋白(玉米醇溶蛋白2)多孔支架。
《表3》
表3 图5的强度分析
《3.3.细胞增殖实验》
3.3.细胞增殖实验
图6显示了L929细胞在玻璃和玉米醇溶蛋白膜上的增殖情况。我们发现由MTT法和CCK-8法得到的曲线有些不同。尽管两种方法均证明了玉米醇溶蛋白具有更好的生物相容性，MTT法显示L929细胞从接种后第二天起在玉米醇溶蛋白膜上的增殖便优于玻璃，而CCK-8法显示从接种后第三天L929细胞在玉米醇溶蛋白膜上的增殖才优于玻璃，且比在玻璃上提前一天达到峰值。我们注意到在MTT法中玻璃和玉米醇溶蛋白膜间本底吸光度的差异要远比CCK-8法中显著，这意味着CCK-8法的实验结果更为可信。
《图6》
图6.L929细胞在玻璃和玉米醇溶蛋白膜上的增殖。(a)MTT实验得到的增殖曲线；(b)CCK-8实验得到的增殖曲线。*表明具有显著差异(单因素方差分析，p<0.05，n=6)；**表明具有极显著差异(单因素方差分析，p<0.01，n=6)。
为了研究MTT法中玉米醇溶蛋白高本底吸光度的原因，我们将玻璃玻片和玉米醇溶蛋白玻片浸泡在PBS或培养液中，并进行了MTT实验，表4为实验结果。当玻璃玻片和玉米醇溶蛋白玻片浸于培养液中时，本底吸光度均高于其浸于PBS中时，且玉米醇溶蛋白浸于两种溶液中经MTT孵育后的本底吸光度更高。例如，玻璃玻片经MTT孵育后的本底吸光度在PBS中为0.045±0.001，在培养液中为0.063±0.002；而玉米醇溶蛋白膜玻片经MTT孵育后的本底吸光度在PBS中为0.142±0.006，在培养液中为0.246±0.014。因此，我们推测在培养液和玉米醇溶蛋白中存在某些成分能够影响从MTT到甲瓚的还原反应。此外，玉米醇溶蛋白膜能够吸收可观数量的培养液，这也与我们之前的研究结论相吻合：玉米醇溶蛋白膜具有良好的溶胀性[19]。半胱氨酸可能是这样的影响成分之一，因为它在玉米醇溶蛋白和培养液中均存在，且在所有氨基酸中具有很强的还原性。已有报道N-乙酰半胱氨酸具有还原MTT四唑环的能力[13]。同时，我们发现胶原作为一种典型的不含有半胱氨酸的蛋白，在MTT实验中没有本底干扰[20,21]——这也支持了我们的推测。
《表4》
表4 玻璃和玉米醇溶蛋白膜的本底吸光度
《4.结论》
4.结论
我们确立了一个有效的生化方法，即SDS-PAGE，来评价不同来源的玉米醇溶蛋白的纯度，研究了不同的灭菌方法对玉米醇溶蛋白的影响，并将MTT法在评价这种有潜力的生物材料的细胞相容性时与CCK-8法进行了比较。结果显示我们使用的4种来源的玉米醇溶蛋白在氨基酸和肽链组成方面并没有表现出显著差异。无论是干热灭菌还是湿热灭菌过程，都没有影响玉米醇溶蛋白的肽链。25kGy的γ射线灭菌对于玉米醇溶蛋白多孔支架灭菌过程是合适的剂量。当使用MTT法时，玉米醇溶蛋白的本底会影响细胞增殖的结果，而CCK-8法更适合评价玉米醇溶蛋白膜或支架上细胞的增殖情况。根据CCK-8实验，我们得到和之前所发表的研究相同的结论，在玉米醇溶蛋白膜上细胞增殖优于玻璃。
《致谢》
致谢
感谢国家国际科技合作专项(2014DFG02330和2015DFG32730)的支持。同样感谢上海市科学技术委员会(13JC1403400和15540723900)和上海交通大学医学工程合作项目(YG2013MS77和YG2014ZD03)的支持。
《Compliance with ethics guidelines》
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