我国自1978年第一头胚胎移植奶牛诞生以来, 已有20余年的历史。牛胚胎移植技术经过摸索、试验、实践, 并通过引进专家和设备, 不少单位已逐渐掌握技术, 形成一支基本专业队伍, 目前已初步进入产业化阶段。
《1 我国养牛业的现状与问题》
1 我国养牛业的现状与问题
近年来我国畜牧业生产一直保持高速增长的势头。1997年全国肉牛存栏数为11 646万头, 奶牛441.3万头, 总数居世界第三位[1]。总产肉量达6397.5万t, 居世界第一位, 其中牛肉产量为494.9万t, 也名列世界前列;但我国人均牛肉量和牛奶量分别为4.05 kg和6.01 kg, 远低于美国41.36kg和261.63 kg及世界平均水平9.93 kg和80.67kg[2]。特别是个体的平均生产水平、胴体重、产奶量和存栏牛的平均产肉量均大大低于世界发达国家的水平 (见表1) [1]。
我国养牛业以前以役用为主, 没有专用的肉用品种, 改良比例仅30%[3], 个体小, 产肉量低, 平均胴体重仅147 kg。如果能达到世界平均水平, 即可增加58.23万t牛肉;同时我国奶牛的纯种少、饲养管理水平低, 平均产奶量仅为1 574 kg, 而世界平均在以上欧美等国的平均单产都在6 000 kg以上[1]。综上所述, 我国养牛业的生产水平相当低, 与先进国家相比, 差距很大, 远不能满足人民生活水平增长的需要, 必须加速牛的改良, 提高养牛业的生产水平。因此, 需培育或引进一批适应我国不同生产模式的优良品种。农业部“全国畜禽良种工程建设规划” (1998～2002年) (简称“规划”) 中提出:“肉牛的良种覆盖率从30%提高到35%, 奶牛从60%提高到70%, 提高良种在畜牧业增产中占技术进步作用总贡献份额, 从20%提高到25%～30%”。“规划”还明确指出:“建立良种繁育体系, 保存、培育和提高我国地方优良牛种, 推广应用引进优良品种, 逐步形成优势牛种的繁育体系”。而且还提出要“改进引种方式, 鼓励引进冻精和胚胎, 利用胚胎移植、胚胎切割等先进生物技术, 加快繁育改良步伐”。这就为科技成果的转化提出了更高的要求, 并为胚胎移植技术产业化拓宽了市场。
《2 胚胎移植技术的研究概况》
2 胚胎移植技术的研究概况
自1890年Heape在英国剑桥大学首次报道家兔胚胎移植成功后, 胚胎移植技术已有一百多年的研究历史[4]。20世纪30年代以后, 有关胚胎移植的研究越来越多并相继在各种家畜上获得成功1975年1月在美国科罗拉多州召开了第一届国际胚胎移植学会成立大会, 标志着胚胎移植技术进入新的更高的发展阶段[5]。1976年牛的非手术胚胎移植技术推广;1977年开始商业化应用, 13个国家成立了数百家商业化胚胎移植公司。仅北美1978年移植后妊娠的牛近1万例;近10年间每年多达10万余例。目前仅美国每年达30多万例[6]。国外胚胎移植技术的发展史概括于表2。
《表1》
表1 1997年世界主要国家养牛业生产水平
Table 1 The production levels of cattle industry in the world in 1997
*根据联合国粮食及农业组织 (FAO, 1997) 提供资料计算
《表2》
表2 国外胚胎移植及其有关技术发展概况
Table 2 General situation in embryo transfer and re-lated technology in overseas
*引自Hafe, 1980, 许怀征等译
20世纪70年代以来, 牛的胚胎移植技术首先在北美迅速发展, 以后广泛应用于家畜改良, 增加特定品种数量、引种以及动物品种资源保存等方面, 有十几个国家成立了商业性的胚胎公司。美国、加拿大以及西欧一些国家的牛胚胎移植已经商业化, 经胚胎移植产下的犊牛占出生犊牛总数的0.2%, 其中的70%是肉牛[7]。
在我国这一技术起步较晚, 自1973年家兔胚胎移植成功以后, 相继在各种家畜上均取得突破[8] (表3) 。80年代以后我国又在胚胎克隆、嵌合体等方面均取得成功。
新疆畜牧科学院于1988年建立新疆家畜生物工程实验中心。10年来该中心累计生产荷斯坦奶牛、西门塔尔等品种胚胎6 000余枚, 以黄牛为受体的鲜胚平均妊娠率为55%, 最高达73%, 冻胚的平均妊娠率为40%, 最高达50%以上。“八五”期间由该院和中国农科院畜牧所合作承担“中国荷斯坦奶牛MOET育种体系的建立与实施”攻关项目中胚胎移植任务, 共超排供体278头, 平均每头获可用胚枚鲜胚移植给青年奶牛的妊娠率为70% (240/343) 、冻胚53% (133/251) 的好成绩。1999年, 与新疆20余县签定了近3 000枚胚胎移植的技术服务合同, 截止年底已完成移植胚胎2 000枚。内蒙古家畜改良站累计自产牛胚胎近千枚, 并从加拿大等国引进肉牛胚胎2 000余枚, 冻胚移植后的妊娠率达50%左右。此外, 国家在“九五”期间分别以“肉牛胚胎移植产业化”和“奶牛胚胎移植产业化”作为重大科技攻关项目立项。国家科技部生物技术开发中心还设立了“牛胚胎移植产业化研究”的“八六三”中试开发项目。与此同时, 以胚胎移植为产业的科技企业也应运而生。
《表3》
表3 我国胚胎移植和相关技术发展概况
Table 3 General situation in embryo transfer and re-lated technology in China
*引自《家畜胚胎工程》, 郭志勤等编著
《3 胚胎移植的几个关键技术环节》
3 胚胎移植的几个关键技术环节
家畜胚胎移植是一种新的人工繁殖技术, 用这种方法将新形成而未着床的早期胚胎从一头母畜体内取出植入另一头同种母畜的生殖道内, 使其正常发育至分娩。这项技术一般用良种或优秀母畜作供体, 将生产性能低的个体作受体, 通过“借腹怀胎”获得增加良种后代的目的。经胚胎移植出生的后代是从供体母畜和与供体母畜交配的公畜那里获得了遗传基因图
《3.1 超数排卵》
3.1 超数排卵
超数排卵是胚胎移植的一个关键技术环节, 受多种因素影响, 个体反应差异很大。首先是超排用激素是影响其效果的主要因素。随着进口激素的应用和国产激素质量的提高, 目前这种因素的影响逐渐变小, 但每批新激素的应用, 均应作预备试验调整合适的剂量。其次是供体牛所处生理条件和个体反应。近年来, 由于前列腺素F2α及其类似物在超排上的应用, 增加了超排处理的机动性。我国近期大多数单位超排一头次可获5～6枚可用胚, 已达相当高的水准。重复超排是增加优秀供体后代的有效措施, 一年可超排4～5次, 每次间隔2～3个月, 平均每头供体一年可获20～25枚可用胚, 即可获得10头以上后代, 一般隔年处理。
《3.2 胚胎冷冻》
3.2 胚胎冷冻
胚胎冷冻 (-196℃) 保存是胚胎移植技术真正走向商业化的关键因素。胚胎的冷冻保存可使胚胎移植在任何时间、任何地点进行, 并可减少运输费用, 简化引种过程, 使优良家畜遗传资源在世界范围内转移。
1949年Polge等[9]发现甘油在精子冷冻过程中的作用年等[5]论述了二甲亚砜 (DMSO) 的低温保护作用, 激起人们对哺乳动物胚胎保存的研究兴趣;1973年Wilmut和Rowson[10]进行牛胚胎冷冻保存并成功产犊。近年来人们着重于简化冷冻程序、快速冷冻、“一步细管法”及玻璃化冷冻等研究, 但仍普遍采用程序冷冻法。早期通常采用甘油和DMSO为抗冻保护剂, 后来逐渐转向用乙二醇和1, 2-丙二醇。目前在牛胚胎商业化生产中常用1.8 mol/L乙二醇加0.25mol/L蔗糖。防冻剂的添加方法, 从最初的4步或6步, 简化为3步。植冰温度一般在-4℃～-8℃范围内, 根据防冻剂种类而定。乙二醇不得高于-7℃, 否则很难诱发乙二醇液形成冰;甘油一般在-5.5℃植冰。植冰后的降温速度, 以0.3℃/min降至-35℃, 再以0.1℃/min降至-38℃, 投入液氮 (-196℃) 保存[11]。
解冻温度一般选在20℃或37℃, 胚胎经冷冻后易发生透明带破损, 而透明带的破损主要是解冻时造成的。经作者[12]观察, 在37℃水浴解冻的胚胎, 透明带破损率与冷冻时胚胎的品质发育阶段有关 (表4) 。表中所列的结果显示出质量好的、发育快的胚胎, 透明带破损少, 胚胎存活也呈好的趋势。透明带的破损率约占20%左右。
《表4》
表4 不同等级胚胎的冷冻效果
Table 4 Freezing result of different grade embryos
据郭志勤等[12]观察, 透明带完整与否对解冻后胚胎的存活率影响不大。解冻后不论透明带完整与否, 凡细胞团结构紧密、清晰的, 培养后继续发育的存活率高达95.61%, 细胞团松散的仅占28.13%, 差异极显著 (p<0.01) 。若以透明带完整与破损区分, 存活率分别为81.42%和78.79%, 差异不显著 (p>0.05) (表5) 。从以上研究可以得出这样的结论:胚胎经冷冻解冻后的质量判别应以胚胎细胞团的形态结构为主。
《表5》
表5 胚胎冷冻及解冻后的发育情况
Table 5 Embryo development after freezing and thawing
《3.3 胚胎切割技术的应用与展望》
3.3 胚胎切割技术的应用与展望
胚胎切割技术是目前更有效地挖掘胚胎移植潜力的方法之一, 具有广泛的应用价值。同时又是进行动物遗传学、发生学等方面研究工作的一种手段。我国奶牛的胚胎切割于1989年取得成功 (表6) 。
胚胎切割技术目前已进入应用阶段, 切割后的鲜胚半胚移植成功率接近50%, 并创造了用玻璃针和刀片的徒手切割方法。
胚胎切割的主要用途可归纳为:
1) 提高胚胎移植时的总受妊率:半胚与胚胎移植相结合可提高胚胎的受妊率。由于在数量上半胚比全胚增加一倍, 其总受胎率远远超过全胚。
2) 生产同卵双生后代:在牛上不仅移植一对半胚生产同卵双胎、增加头数, 而且还可避免异性双胎造成的母犊不孕。
3) 有效的遗传育种试验材料:由于同卵的2个半胚它们在遗传性状上相同使用同卵双生后代作遗传育种方面的试验材料, 将会相对减少遗传性状差异带来影响。
此外, 还可进行胚胎的性别鉴定, 以及增加和保存珍贵家畜及濒危动物的种质等。总之, 胚胎切割技术本身已进入实用化阶段。但在切割胚的长期保存及切割技术的改进方面, 还有很多有待研究的问题, 其发展的前景是广阔的。
《表6》
表6 我国奶牛胚胎切割研究概况*
Table 6 Research on dairy embryo splitting
*引自《家畜胚胎工程》, 郭志勤等编著。
《4 牛胚胎移植技术产业化的前景与措施》
4 牛胚胎移植技术产业化的前景与措施
综上所述, 我国养牛业亟待发展, 生产水平急需提高。农业部制定的规划中已明确规定了我国养牛业今后的发展目标和建设的基本思路, 这就为家畜高新技术成果的转化, 特别是胚胎移植技术的推广应用开拓了广阔的前景和市场。与此同时, 还需采取以下主要措施:
1) 胚胎移植是以扩大优良种畜和引种为目的, 所以必须考虑到供体牛的品质, 不论是引种或扩大种畜群, 都应从供体牛的品质、遗传因素等方面选择。不能将胚胎移植技术单纯作为商业获利的手段。
2) 我国现有奶牛441万多头, 但平均产奶量低。平均产奶量超过3 000 kg的占全国奶牛总头数的55.68%[4];但在各省市大中城市的部分牛场产奶量大多在6 000 kg以上, 有的还超过8 000kg。鉴于我国奶牛业的具体情况, 可采用两种方法, 即可适量引进高产奶牛胚胎, 利用超数排卵和胚胎移植技术, 进行MOET育种, 建立高产、优质奶牛核心群利用现在的高产奶牛群生产胚胎用低产奶牛或土种母牛作受体牛, 扩大高产优质奶牛的数量。
3) 我国肉牛数量大, 生产水平低。根据《规划》规定, 除保存、培育、提高我国原有地方优良牛种外, 要逐渐推广应用优良品种, 逐步形成优势牛种的繁育体系。为此, 今后肉牛的发展方向与胚胎移植技术的应用应注意以下方面:
要因地制宜的引入良种, 建立优质肉牛繁育基地, 同时要考虑到今后牛肉的品质和品牌问题;建立良种肉牛胚胎的工厂化生产, 在肉用种牛的繁殖基地, 选出一定数量的种母牛用来生产胚胎, 一般每头供体年可作4～5次, 可产胚胎约20～25枚, 第二年正常妊娠, 用另一部分种母牛生产胚胎, 依次轮换;双胎牛的生产通过激素诱发, 用正常超排用量的1/5～1/3 FSH分3天注射, 可诱发排2～3个卵, 移植2个胚胎, 另一个胚胎分割后, 移两个同卵半胚, 前两种方法可能产生异性双胎, 但对增加肉源来说还是有好处的, 因为双胎可以增加头数, 此外怀单胎和双胎母牛, 对摄取的食物量没有差异。
4) 胚胎移植技术本身还需进一步研究, 提高超排效果, 冷冻胚胎的存活和移植技术, 以及开展活体取卵、体外受精等以扩大卵源, 降低成本, 提高胚胎移植成功率。
总之, 在当前我国大力发展养牛业的大好形势下, 应尽快将胚胎移植这一高技术成果产业化, 促进我国养牛业的进一步发展
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